T-GXAS 489-2023 非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒和猪非典型瘟病毒鉴别检测 多重RT-PCR和多重qRT-PCR法_第1页
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GXASI本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定1非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒和猪非典型瘟病毒鉴别检测多重RT-PCR和多重qRT-PCR法本文件规定了用于鉴别检测非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒和猪非典型瘟病毒的多重RT-PCR和多重qRT-PCR法，包括原理、试验条件、试剂、主要仪器设备、样品采集与处理、多重RT-PCR检测、多重NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范ASFV：非洲猪瘟病毒（AfricanSwCSFV：猪瘟病毒（ClassicalSwineFeverAPPV：猪非典型瘟病毒（AtypicalPorcRT：反转录（ReverseTranscripPCR：聚合酶链反应（PolymeraseChainReactiRT-PCR：反转录聚合酶链反应（ReverseTranscriptionPolymerqRT-PCR:实时荧光定量反转录聚合酶链反应（QuantitativeRealCt值：每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环数（Cyc4.2根据ASFV、CSFV和APPV基因特定序列的保守片段，合成2应按照普通PCR仪和实时荧光PCR仪的不同仪器型号选取合适的PCR和qRT-PCR扩增试剂。宜选取商品化的反转录试剂盒、质粒提取试剂猪口鼻拭子、血清、全血、组织、环境拭子等样品采集按NY/取200µL待检样品于无RNA酶的1.5mL离心管中，按照RNA/DNA提取试剂盒操作说明书抽提总9.1.2加完试剂后瞬时离心混匀。将PCR39.2.1反应体系的配制加完试剂后瞬时离心混匀。将PCR反应管置于普通PCR仪内，设置如下反应参数：94℃2min；用重组质粒p-ASFV、p-CSFV和p-APPV混合物作为阳性对照，重组质粒的制备方法见附录C。412.1.2.1当阴性对照无任何扩增带，而阳性对照在12.1.2.2若被检样品在828bp位置出现扩增带，判定为ASFV阳12.1.2.4若被检样品在275bp位置出现扩增带，判定为AP根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正5ASFV-FAGGGGTTTGAGGTCCATTAASFV-RAPPV-FAPPV-RATCCGCCGGCACTCTATCAAG6ASFV-p72-FGGCGTATAAAAAGTCCAGGAAAASFV-p72-RASFV-p72-PTexasRed-TCACCAAATCCTTTTGCGATGCAAGCT-BCCTGAGTACAGGACAGTCGTJOE-TTCGACGTGAGCAGAAGCCCACC-APPV-5'UTR-FAPPV-5'UTR-RGGCACTCTATCAAGCAGTAAGGTAPPV-5'UTR-PFAM-TCGGGTCCACCATGCCCCTT

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