DB45T 1669-2018 陆川猪肉及其制品的DNA分子鉴定方法

2018-03-25发布2018-04-25实施I前言 II 12规范性引用文件 13术语和定义 1 25仪器与试剂 26鉴定步骤 27结果判定与表述 38实验室防污染措施 4附录A(资料性附录)陆川猪肉特异性条带的核苷酸序列信息 5附录B(规范性附录)PCR所用引物序列 6附录C(资料性附录)样品DNA提取方法 7附录D(资料性附录)1.8%琼脂糖凝胶的制备 8本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由广西大学提出。本标准起草单位：广西大学、广西分析测试研究中心、广西经贸职业技术学院、广西陆川县质量技术监督局。本标准主要起草人：黄丽、滕建文、杨磊、黄岛平、庞理松、夏宁、林葵、韦保耀、庞丽、李中宇。1本标准规定了陆川猪肉及其制品的DNA分子鉴定的术语和定义、原理、仪器与试剂、鉴定步骤、结件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验用水规格和试验方法GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测NY/T2993陆川猪来源于NY/T2993中纯种陆川猪生猪，以及以纯种陆川猪为母系进行杂交后的杂元陆川猪生猪的酮注：杂元陆川猪包括二元杂陆川猪和三元杂陆川猪。4原理25.1.5小型离心机(7000rpm)。5.1.8微量移液器(10HL、100HL、1000HL)。5.1.10一次性PE手套。5.2.52×EsPCRMasterMix(含溴酚蓝染料)。3行，同时PCR扩增阴性对照和空白对照。配置体系时依照表1,最后加入模板DNA。引物(上游)引物(下游)补ddH₂O至6.3PCR反应程序95℃/5min预变性；95℃/30s变性，40℃/30s退火，72℃/2min延伸，35～40个循环；72℃/5min总延伸；4℃/5min结束扩增。PCR产物直接进行琼脂糖凝胶电泳分析或置于4℃保存备用。6.4.1阴性对照：将不含陆川猪血缘的猪肉或肉制品按6.1提取DNA,按6.2配置PCR反应体系，按6.3程序进行PCR扩增。6.4.2空白对照：以灭菌水代替DNA模板，按6.2配置PCR反应体系，按6.3程序进行PCR扩增。的琼脂糖凝胶(1.8%琼脂糖凝胶制备参见附录D)的上样孔中，同时加入3.5μL的Marker,用1×TAE作及时进行紫外拍照观察，应将凝胶放入1×TAE缓冲液中暂时保存，但不宜超过4h,超4将电泳后的琼脂糖凝胶置于凝胶成像仪内观察，观察测试样品琼脂糖电泳检测图，按照以下方法进——如测试样品WW12目标基因琼脂糖电泳检测有1500bp对应条带，则被检样品为陆川猪肉及其——如测试样品WM12目标基因琼脂糖电泳检测无1500bp对应条带，则被检样品为非陆川猪肉及其制品；——如测试样品WM12目标基因琼脂糖电泳检测有1500bp对应条带，WM14目标基因琼脂糖电泳检测没有800bp~900bp对应条带，则被检样品为纯种陆川猪肉及其制品；——如测试样品WM12目标基因琼脂糖电泳检测有1500bp对应条带，WM14目标基因琼脂糖电泳检测有800bp~900bp对应条带，则被检样品为杂元陆川猪肉及其制品。8实验室防污染措施按照GB/T27403的规定执行。5(资料性附录)ACAAAGGGCTACAAACCAAAGCCTCATCCTGCACCCTTGCCTCAAGCAGGATGAAAGCTCAGAAACTCCTCTCTCTTTCTTGCCTCTGCTGTTTATTCAGCAGGCCTGGGCTCAGTTCCCCAGAGAGTGTACCACCATTGAGGCTTTGAGGCCCAGATCTGTCCCCACTGTCTGGGCCCGGGACTGACCGCTGTGGCTTCTCCTCAGGGAGGGGCAGGTGTGAGG6(规范性附录)引物名称引物序列上游5'-CACCACCACGC-3'下游5'-CACCACCACGC-3'上游5'-CTCCTCCTCGC-3'下游5'-CTCCTCCTCGC-3'7(资料性附录)C.2.2向离心管中加入400μ或水浴中25min~30min,其间每间隔10min涡旋混匀一次。C.2.3加入400μLBufferL2,颠倒混匀至分层消失，置于65℃金属浴或水浴中10min,然后12000C.2.4将上清液用移液器转移到离心柱中，再将离心柱放入收集管中，12000rpm室温离心1min,弃C.2.5向离心柱中加入500μLBufferPW,12000rpm室温离心1min,弃掉收集管中的废液。C.2.6再向离心柱中加入700μLBufferWB,12000rpm离心1min,弃掉收集管中的废液；将离心柱放回收集管中，12000rpm空管离心2min,弃掉离心柱中残余的BufferWB。C.2.7将离心柱移至新的1.5mL离心管中，向膜中央悬空滴加100μL已于65℃预热的BufferEB,室温放置5min,12000rpm离心1min,收8(资料性附录)D.1将凝胶托架两端用胶带封闭并水平放置在工作台上，放上梳子