OPA-FMOC联用柱前衍生化法氨基酸类成分测定原理及其在药物分析中的应用

OPA-FMOC联用柱前衍生化法氨基酸类成分测定原理及其在药物分析中的应用氨基酸类成分分析方法——柱前衍生化法介绍Contents衍生化反应概述及原理1流动相及衍生试剂的配制2自动化衍生过程3应用实例4试验注意事项5衍生化反应概述及原理由于大多数氨基酸缺乏天然的紫外或荧光吸收，因此通常的做法是进行衍生化处理。柱后衍生化该方法多用于离子交换色谱，先通过阳离子交换树脂分离，然后再用茚三酮衍生化，在可见光区检测。衍生化法柱前衍生化该方法多用于液相色谱，先用衍生试剂与氨基酸进行衍生化反应，然后再用紫外或荧光检测器检测。柱后衍生化法1951年Moore和Stein研制出了第一台氨基酸分析仪，将未衍生的氨基酸用离子交换色谱分离后，用茚三酮进行柱后衍生，在可见光区检测。1958年由Beckman开发并推出了全自动分析仪。新一代的氨基酸分析仪已将分析时间缩短到大约110分钟。但是，因为需要专门的仪器，且仪器价格昂贵，这大大限制了该方法的推广应用。德国曼默博尔公司A300全自动氨基酸分析仪参考价：约100万RMB柱前衍生化法2,4-二硝基氟苯(FDNB)法6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯(AQC)法邻苯二甲醛(OPA)法异硫氰酸苯酯(PITC)衍生法丹酰氯(Dan-Cl)法氯甲酸芴甲酯(FMOC)法柱前衍生试剂种类较多，且各方法均有其优缺点，还没有一种很完善的柱前衍生试剂。现在大多以OPA法、FMOC法和AQC法为主。柱前衍生化法OPA柱前衍生化法原理：OPA在3-巯基丙酸的存在下与氨基酸反应优点：过量衍生试剂不干扰检测

缺点：1、不能与二级氨基酸（如脯氨酸）反应2、衍生试剂本身不稳定，易氧化变质338nm处无吸收在338nm处有吸收1971年由Roth首次提出用OPA对氨基酸进行柱前衍生FMOC柱前衍生化法原理：优点：可同时与一级和二级氨基酸反应

缺点：衍生试剂本身（FMOC-Cl）及其水解产物（FMOC-OH）对检测有干扰

266nm处有吸收262nm处有吸收OPA-FMOC联用柱前衍生化法让样品先与OPA试剂充分反应，将一级氨基酸全部反应完全，接着样品中剩余的二级氨基酸再与FMOC反应。由于FMOC、FMOC衍生物和反应副产物比任何OPA衍生物的疏水性都强，所以它们不会干扰任何一级氨基酸的检测。因为只有几种FMOC衍生物，所以可以使用简单的梯度将这些氨基酸与反应副产物和FMOC分离。1986年惠普/安捷伦将OPA和FMOC衍生反应依次结合，实现了氨基酸的全自动衍生、色谱分离和检测。OPA-FMOC联用柱前衍生化法流动相及衍生试剂的配制流动相的配制

衍生试剂的配置

衍生试剂可以从安捷伦公司直接购买，1mL安瓿瓶包装，即开即用，不需要做其他处理，但价格较为昂贵；自行配制时，因衍生反应纯度要求较高，需购买Sigma原装试剂，包括OPA(邻苯二甲醛)、FMOC-Cl(芴甲氧酰氯)和MPA(3-巯基丙酸)。流动相的配制流动相用HAc调节PH值至7.20±0.05

0.02MNaAc2LTHF7mLTEA400uL0.02MNaAc200mLACN400mLMeOH400mLA相B相PH值是试验最关键的影响因素试剂配制试剂配制OPA：20mg硼酸缓冲液：1.75mLACN：0.25mLMPA：32uLText0.4M硼酸缓冲盐取一定量硼酸，用水溶解，再用40%NaOH溶液调PH值至10.2OPA试剂FMOC试剂FMOC：20mgACN：4mL柱前自动衍生过程从1号瓶中吸取0uL水纯水纯水硼酸盐OPAFMOC样品柱前自动衍生过程从3号瓶中吸取5uL硼酸钠-氢氧化钠缓冲液衍生反应所需的环境，PH值在10.5左右纯水纯水硼酸盐OPAFMOC样品柱前自动衍生过程从1号瓶中吸取0uL水纯水纯水硼酸盐OPAFMOC样品柱前自动衍生过程从4号瓶吸取1uLOPA试剂纯水纯水硼酸盐OPAFMOC样品柱前自动衍生过程从1号瓶中吸取0uL水纯水纯水硼酸盐OPAFMOC样品柱前自动衍生过程从6号瓶吸取样品1uL，充分混合约2min纯水纯水硼酸盐OPAFMOC样品柱前自动衍生过程从1号瓶中吸取0uL水纯水纯水硼酸盐OPAFMOC样品柱前自动衍生过程从5号瓶抽取FMOC试剂1uL，充分混合约2min纯水纯水硼酸盐OPAFMOC样品柱前自动衍生过程从1号瓶中吸取0uL水纯水纯水硼酸盐OPAFMOC样品柱前自动衍生过程从2号瓶吸取水32uL，以最大速度充分混合3次，然后进样纯水纯水硼酸盐OPAFMOC样品应用实例注射液中氨基酸含量的测定清开灵参麦得力生丹红色谱柱及流动相梯度色谱柱：AgilentSB-C18柱（4.6mm×250mm,5um）时间(min)流动相B（%）流速（ml·min-1）0.001.012.0221.015.0221.030.0701.035.0701.038.01001.549.01001.552.001.0流动相梯度：每次实验前要根据实际情况，对梯度进行微调样品配制氨基酸混合标准品溶液的配制

精密称取各氨基酸标准品5-10mg，一起置入容量瓶中，用1%盐酸溶液溶解，并定容至100mL。用0.45um针头滤器滤过，即得。游离氨基酸供试液的配制

取各注射剂原液，直接用0.45um针头滤器滤过，即得。水解氨基酸供试液的配制

取各注射液1mL于带盖试管中，加入6mol/L盐酸溶液9mL，充氮气封口，盖紧瓶盖，置于110℃恒温干燥箱中水解24h，取出后将样品倒入蒸发皿中，70℃水浴中蒸干，然后加入1%盐酸溶液2mL，超声10min，用0.45um针头滤器滤过，即得。标准品色谱图注：1ASP天冬氨酸；2GLU谷氨酸；3ASN天冬酰胺；4SER丝氨酸；5GLY甘氨酸；6THR苏氨酸；7CYS胱氨酸；8ALA丙氨酸；9ARG精氨酸；10TYR酪氨酸；11MET蛋氨酸；12VAL缬氨酸；13TRY色氨酸；14PHE苯丙氨酸；15ILE异亮氨酸；16LEU亮氨酸；17LYS赖氨酸；18PRO脯氨酸精密度考察结果显示混合标准品精密度良好稳定性考察分别测定了放置0h、2h、4h、8h、12h、24h后混合标准品样品，结果显示混合标准品稳定性良好线性关系考察图：ASP标准曲线（浓度范围：0.0036～0.1078mg/ml）考察了从混合标准品母液一直到稀释30倍的一系列样品，结果显示，各氨基酸在各自浓度范围内线性关系良好。厂家一清开灵样品色谱图游离氨基酸水解氨基酸厂家清开灵样品色谱图游离氨基酸水解氨基酸得力生样品色谱图游离氨基酸水解氨基酸丹红样品色谱图游离氨基酸水解氨基酸参麦样品色谱图游离氨基酸水解氨基酸各注射液氨基酸样品测定结果比较单位：mg/mL试验注意事项