T-CI 390-2024 健康人（异体）免疫细胞（CIK）的制备技术和应用规

CCSC272024-06-24发布IT/CI390－2024 Ⅲ健康人（异体）免疫细胞（CIK）的制备技术和应用规程 2规范性引用文件 3术语和定义 4仪器设备条件和细胞培养器材 5溶液配制和细胞培养技术 6CIK细胞制备规程 7质量检测和标准 8检验与放行 9标注，运输与追踪 610CIK细胞临床治疗方案和疗效评价 6 912参考文献 11T/CI390－2024本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由澳科大生命科技集团有限公司提出。本文件由中国国际科技促进会归口。本文件起草单位:澳科大生命科技集团有限公司、广州市坤圣生物科技有限公司、南方医科大学中西医结合医院、广州市番禺区化龙医院、广州中医药大学金沙洲医院、青岛瑞思德生物科技有限公司、青岛瑞思德医学检验实验室有限公司。本文件主要起草人员：祁岩超、张卫东、祁秋干、纪娜、王远东、史强、杨高远、段红伟、周晶、陈梦梦、张炳强。本文件是首次发布。T/CI390－2024本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场。该专利持有人已向本文件的发布机构保证，他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下，就专利授权许可进行谈判。该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案。相关信息可以通过以下联系方式获得：专利持有人姓名：广州市坤圣生物科技有限公司地址：广州市黄埔区广州国际生物岛寰宇一路27号云润大厦703室联系人：祁岩超电话箱：ycqi@163.net请注意除上述专利外，本文件的某些内容仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。1T/CI390—2024健康人（异体）免疫细胞（CIK）的制备技术和应用规程本文件规定了CIK免疫细胞的制备技术规程。本文件适用于人免疫细胞的生产、运输、存放。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。YY0572-2015《血液透析及相关治疗用水》YY0598-2006《血液透析及相关治疗用浓缩物》T/CGCPU019—2022《免疫细胞产品供者材料管理要求》3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1免疫细胞产品immunecellproducts经过体外分离、培养、扩增后制成的人源活免疫细胞3.2供者donor用于免疫细胞产品（3.1）采集、制备的细胞的来源是人3.3供者材料suppliermaterials从供者外周血，脐带血获得的用于免疫细胞产品生产的免疫细胞。3.4生物安全biosafety细胞的采集和制备处于没有危险和不受生物因子及相关因素威胁的状态.2T/CI390—20244仪器设备条件和细胞培养器材4.1仪器设备条件4.1.1场地条件：（1）GMP千级净化室（百级超净工作单元）100-300M2，（2）普通实验室（质量检测）50-100M2，（3）洗涮、准备间200-500M24.1.2大型设备：（1）血细胞分离机（单采机）（2）流式细胞仪（3）酶标分析仪（4）内毒素检测仪（5）常速，超速离心机（6）常温，低温冰箱（柜）（7）图像仪器，倒置显微镜4.2细胞培养器材4.2.1清洗与消毒玻璃器皿的清洗清水浸泡——洗衣粉刷洗——自来水冲洗——晾干，浸酸过夜——自来水冲洗10次以上——蒸馏水洗2-3次——烘干，包装——灭菌，贮存备用。培养板和培养瓶用符合国家标准规定的商售一次性使用培养瓶，袋物品。载玻片用一次性使用的物品。胶塞的清洗。自来水浸泡——2%NAOH煮沸10~20分钟——自来水冲洗——1%稀HCL浸泡30分钟——自来水冲洗——蒸馏水冲洗2~3次——晾干，备用。4.3灭菌4.3.1使用前，先检查高压灭菌器主体内水位是否超过电热管。4.3.2在加热开始时，放气阀垂直，使空气随加热由桶内逸出。待有较急的蒸汽喷出时，即将放气阀拨回水平位置。4.3.3瓶皿121-126℃15MIN;器械121-126℃10MIN;橡胶121℃15MIN;溶液121-126℃20-40MIN4.3.4当压力到达所需的范围时，开始计算时间。124-126℃灭菌时，安全阀能使之维持恒压；低于124℃时，则应在蒸汽压力到达所需范围时，适当调节开关使之维持恒压。3T/CI390—20244.3.5灭菌完，要迅速使之干燥者，将灭菌器内的蒸汽通过放气阀迅速排出。等压力为0时，再稍等1-2分钟，然后将盖打开，继续加热10-15分钟，使物品上残留的水蒸汽得到蒸发，随后关掉；灭菌液体时，应将液体灌装在玻璃瓶中，以不超过3/4体积为好，瓶口用棉花纱布塞好，并用绳子扎在瓶颈上，使瓶内的空气能自然泄出，而又不致使瓶塞落入瓶内。灭菌完，先关电源，等压力为0时，再稍等几分钟，打开放气阀，排出余气后，才能将盖开启。5细胞培养操作技术5.1洗液的配制重铬酸钾先溶于水中，然后，将浓硫酸缓慢加入。[强液]重铬酸钾63G，浓硫酸1000ML，蒸馏水200ML「常用」重铬酸钾63G溶于800ML蒸馏水,再缓慢加入浓硫酸1000ML.「本室」重铬酸钾120G：浓硫酸200ML：蒸馏水1000ML5.2细胞培养液5.2.1商售一次性应用的完全培养液：1640完全培养液。5.2.2配置：1640干粉（1）把干粉加入15-30℃（室温）三蒸水中，缓慢搅拌令之溶解，并将袋中微量粉末冲下。（2）加NAHCO32.0G/L1640培养液或3.7G/LDMEM培养液。稀释至1L。（3）用1NHCL或1NNAOH将PH调低于正常PH*7.2—7.3。（在正常情况下，培养液PH介于7.2-7.4间，呈桃红色。（4）立即除菌过滤，用0.22UM除菌滤膜的滤器负压抽滤（5）分装，放置4℃条件下保存，备用5.3消化液的配制（0.25%胰蛋白酶）（1）将PH7.2的PBS液高压消毒灭菌。（2）称取胰蛋白酶粉末0.25G，先用少许消毒的盐溶液调成糊状，然后再补足盐溶液，搅拌混匀，置室温4小时或冰箱内过夜，并不时搅拌振荡。(3).除菌过滤，分装入瓶，-20℃冰箱保存。5.4BSS的配制(PBS克/升）（1）准确称量试剂。(含有水份的水化物，与不含水份者的称量不同，应加以换算)。KCL0.2，KH2PO40.2，NACL8.0，NA2HPO4·7H2O.56。（2）依次溶解在750ML水中，待前一种试剂完全溶解后，再溶解下一种成分。（3）补足水分至1000ML。除菌过滤或高压灭菌10MIN，分装瓶中，4℃保存。5.5细胞培养操作程序5.5.1细胞计数法（1）悬液制备：取待测细胞，向培养瓶内加1ML0.25%胰蛋白酶液，37℃温箱中消化，至细胞接近脱离瓶壁前吸出消化液，加新的培养液5.0ML，轻轻吹打制备成细胞悬液。4T/CI390—2024（2）染色：取吸管1支，伸入培养瓶中，轻轻反复吹打细胞悬液使细胞重悬均匀后，立即吸细胞悬液少许，向离心管中滴入9滴，再滴入0.4%的台盘蓝染料1滴，混匀，置2-3MIN。（3）镜检：把计数板平放在显微镜台上，从边缘滴1-2滴已染色的细胞悬液。镜下观察可见细胞分散各处，健康细胞胞体完整，透明不着色，凡着色细胞均为不健康者。（4）细胞活度：每100个细胞减去着色细胞数，如有5个着色细胞，活度为95%。（5）细胞计数：细胞数/悬液=（4大格细胞总数/4）*104*毫升数.（6）接种：一般接种量在105-106细胞/ML范围.5.5.2细胞传代（1）将瓶中的培养液倒出，镜检，离心重悬细胞，用吸管将瓶壁上的细胞吹打均匀。（2）培养中的细胞分瓶，并加入培养液8-10ML，置培养箱中培养。（3）悬浮细胞传代时，只需吸出少量细胞转入新瓶，并补足营养液即可。6CIK细胞制备规程6.1制备程序6.1.1包被培养瓶（1）取50ML离心管，分别移入10MLD-PBS。（2）每管加入专用试剂若干，CD3AB50ΜL，混匀后移入75CM2培养瓶，标记。（3）将培养瓶平放在4℃冰箱内，避光过夜。6.1.2分离培养PBMC(1)单采机采取分离出相应数量单个核细胞。(2)取上述单核细胞液50ML，平均移入两个50ML离心管中，加入全血体积20%（每管5ML的羟乙基淀粉，垂直静置30-60分钟。（一般降到1/2体积）(3)将两管中的上层（血浆+淋巴细胞）移入新的离心管，350G/10MIN离心,(4)取上清（血浆）移入新的离心管，56℃水浴/30MIN灭活。(5)水浴灭活后的血浆，室温800G/20MIN离心，取上清（即自体血浆）留用。(6)取10MLFICOLL移入新的50ML离心管(7)细胞沉淀用20MLD-PBS重悬，细胞悬液缓慢加入FICOLL层，室温380G/20MIN离心,(8)吸取PBMC层，加D-PBS至40ML洗涤，室温350G/8MIN离心(8)弃上清，细胞沉淀加培养基至40ML洗涤，取样计数，室温，300G/8MIN离心(9)计数细胞，测定细胞活度,>95%(10)取包被的培养瓶，弃包被液，用D-PBS和培养基分别洗一次(11)调制细胞悬液，分别加入培养瓶。接种细胞数3×107(106/ML)/30ML/瓶,(12)每瓶加入IL-230ΜL（1000U/ΜL），IFN-Γ15ΜL(1000U/ML)，自体血浆1.5ML(即血浆浓度为5%)。显微观察，置于5%CO2，37℃培养,(13)显微观察细胞状态，理论上，若第2天细胞状态好，可不加血浆，并且转袋前尽量减少移动细胞，使细胞与包被液试剂充分接触。6.1.3细胞转移至培养袋5T/CI390—2024（1）在接种的4天，用巴氏吸管吹打贴附在培养瓶上的细胞，细胞悬液转移至50ML离心管中，取样计数。（2）吹打后，显微镜下观察贴壁细胞情况，如仍较多，每培养瓶加入5—10ML培养液继续吹打。（此时细胞一般不用酶来消化，以免损伤细胞）。（3）计数细胞，检测细胞活度，杀伤活性，流式细胞仪测定等。（4）分离细胞通过注射器套筒转移至培养袋，培养液调至200ML（1×105/ML添加IL-2100ΜL，自体血浆6MLIL-2为500U/ML，补救措施为将血浆含量提高到3%，细胞浓度一般不可低于0.4×105/ML）。（5）每天显微观察细胞状态。（6）隔天等量添加培养液并取样计数细胞等。同时添加IL-2,500U/ML，自体血浆1%及8万U/2ML庆大霉素一支所加培养液已加入白蛋白，含量为0.3%，即1000ML培养液加入20%白蛋白15ML）。6.2回收细胞（1）在培养袋三次加液后（分离接种细胞的第12天），袋中培养液体积为1200-1800ML(初转袋时150或200ML),收集细胞，（2）用50ML离心管分离细胞，D-PBS洗涤2次，取样进行质量检测。7质量检测和标准7.1显微观察细胞状态，取样计数（1）肉眼观察，培养袋或培养瓶中培养液清澈，无混浊。（2）显微观察细胞状态良好，大小基本均匀，反光度好，如有集落形成，证明生长良好。取样计数备用。7.2细胞活度：“台盼兰拒染细胞活度鉴定法”，细胞活度达90%以上为合格。7.3杀伤活性：效应细胞为CIK细胞，靶细胞为K562细胞。效：靶=20:1,杀伤活性达80%以上为合格。7.4流式细胞仪检测CIK细胞表型：CD3CD56双阳性细胞达20%或以上为合格。CD3CD4/CD8双阳性细胞在50%以上。具体方法见：流式细胞仪检测CIK细胞表型具体方法介绍。7.5安全检测：热源，病毒,支原体，细菌（霉菌）检测合格。7.5.1热源检测-定性检测法：取CIK细胞培养上清液用鲎试剂凝胶法检测：结果阴性（-）为合格。注：原理:热源又叫内毒素，是革兰氏阴性细菌的细胞壁组成部分。医学工业普遍接受的观点---控制内毒素污染，就等于控制了热源（细菌）污染。鲎试剂内含有被微量内毒素激活的凝固酶可和鲎试剂产生凝集反应形成凝胶。据此可判断热源（细菌）污染与否。7.5.2热源检测-定量检测法：检测流程仪器及软件准备：试验前开启动态试管检测仪，温度在37OC.(1)样品阳性对照液制备，每个样品取已制备的样品溶液0.4ML加入到细菌内毒素工作标准品中，放置漩涡混合器上混合1MIN,得到样品阳性对照液。(2)样品溶液制备：用配套的采样瓶采集样品，每种样品分别取0.1ML加入到0.9ML样品稀释瓶里，混匀，即得样品溶液。,6T/CI390—2024(3).鲎试剂复溶:开启鲎试剂和试剂复溶液，取0.25ML试剂复溶液加入鲎试剂瓶中，摇匀，放置1MIN,得鲎试剂溶液，取若干反应试管，每管加0.05ML鲎试剂。(4)加样及反应：阴性对照项：取0.1ML样品稀释瓶中的溶液加入到0.05ML鲎试剂溶液的反应试管，平行两管，轻轻混匀立即插入动态试管仪中反应。(5)阳性对照项：取0.1ML阳性对照液加入到0.05ML鲎试剂溶液的反应试管，平行两管，轻轻混匀立即插入动态试管仪中反应。(6)样品检测项及样品阳性对照项：每个样品取0.1ML样品溶液及样品阳性对照溶液加入到0.05ML鲎试剂溶液的反应试管，各平行两管，轻轻混匀后立即插入动态试管仪中反应。结果分析：(1)试验有效性条件：阴性对照项检测值应小于标准曲线最低点的检测值。(2)试验准确性判断：阳性对照项回收率应在50－200%之间。(3)样品无干扰的判断：样品阳性对照项的回收率应在50－200%之间。(4)检测结果判断标准：细胞培养液等，细菌内毒素不大于0.5EU/ML，执行标准《中国药典》;(5)病毒检测：HIV、HBV、HCV、TP检测全部合格---全部阴性：方法按检测试剂盒说明书进行。8检验与放行细胞制品达到：（1）无微生物，无内毒素；（2）细胞活性>90%；（3）细胞表型达到本标准的要求；有专职的质量控制员和技术长联合签名发放。9标注，运输与追踪9.1发放的细胞产品留样（5ML）深低温活细胞保存3年，必备用复查。9.2外发的细胞制品：（1）有细胞名称，数量，外观项目，发放人签名标注。（2）按规定进行一次性密封，密封口有签名的一次性密封条加封。（3）放置带有温度记录的血液保存-输送箱中，外加封条。（4）24小时内签收。9.3追踪制备方必须向应用方进行常规进行细胞治疗追踪和记录。10CIK细胞临床治疗方案和疗效评价10.1临床治疗方案10.1.1病例选择病例入选标准：①经病理证实、诊断明确的各种恶性肿瘤。②患者年龄、性别不限。③手术、放疗和化疗后病情稳定或有复发转移的患者。7T/CI390—2024.病例排除标准1）有严重过敏体质的病人。（2）严重心，肝，肾功能衰竭的病人。（3）临床医生认为不适应的病人。10.1.2治疗方案参照2021年2月国家药品监督管理局药品评审中心公布的《细胞治疗产品临床试验技术指导原则（试行）》中的“剂量探索和剂量递增”原则，每例患者至少二个疗程；每疗程输注6次，CIK细胞总数为150-300X108个。采用输血器静脉输注细胞，可考虑采用药物，如地塞米松5MG，于CIK输注前静推，预防不良反应，常规情况下可不用，有过敏史者，应提前预防。静脉输注：每次30-50×108细胞悬于150-200ML生理盐水中，每分钟60滴左右滴注。每天或隔天一次。6次一疗程：第一年以2-3个疗程，第二年半年重复一疗程，以后每年做一疗程，五年后视情况再定。肝动脉灌注：每周一次，每次10-20×108细胞悬于50-60ML生理盐水中，3次一疗程。不良反应及其处理本研究采用的健康人CIK细胞是异体免疫细胞，因专利技术处理，治疗相当安全。有部分病人（3-5%）在细胞回输后2-10小时内出现体温升高。中度发热（38.50C以下）一般2-6小时内可自行缓解。超过390C者可用药物或物理疗法对症处理。10.2临床疗效评价10.2.1一般临床症状治疗前后变化：包括：精神状况、睡眠情况、体重、食欲、痛疼等（详见观察表格）10.2.2实验室检查指标：癌标记物原发性肝癌治疗前后查AFP，CA19-9等非小细胞肺癌治疗前后查CEA和CA125等结直肠癌治疗前后查CEACA724等具体各种癌症病人治疗前后均查AFP、CEA、CA125、CEA。收集资料可综合分析不同癌标记物在不同肿瘤中的临床意义。.患者自身外周血淋巴细胞亚群测定治疗前、后分别采取病人静脉全血1ML通过流式细胞仪（FCM）测定其细胞亚群、T,B淋巴细胞、NK细胞的绝对数量变化。（见附表）患者自身免疫能力（NK活性）测定治疗前、后分别采取病人外静脉血10ML，检测患者自身外周血免疫细胞对K562细胞的杀伤活性，即NK活性。临床影像学指标疗效评价标准参照1979年WHO确定的实体瘤疗效评价标准拟订：完全缓解(COMPLETEREMISSION,CR)：所有病灶完全消失，至少维持4周；部分缓解(PARTIALREMISSON,PR)：双径可测病灶，各病灶最大径乘积之和缩小50％以上，至少维持4周；单径可测病灶，各病灶最大径之和减少50%,8T/CI390—2024至少维持4周。稳定(STABLEDISEASE,SD)：双径可测病灶，各病灶最大径乘积之和缩小不足50％,或增大不超过25％,至少维持4周。进展(PROGRESSIVEDISEASE,PD):一个或多个病灶增大超过包括：CT、B超、PET等，同时参照【实体肿瘤应答评估方案】。完全缓解（CR）所有病变完全消失并维持4周以上部分缓解（PR）肿瘤最大横径与最大垂直径的乘积减少50%以上，并维持4周以上好转（MP）肿瘤病灶二径乘积缩小25%以上，不足50%，无新病灶出现维持4周以上。稳定（SD）肿瘤病灶二径乘积缩小或增大均<25%，4周无新病灶出现。进展（PD）肿瘤病灶乘积增大25%以上，并有新病灶出现。有效率（%）=（CR+PR）例数/治疗总例数×100%存活时间病人的带瘤生存和无瘤生存时间应是疗效评估的重要指标。本研究拟采用1、2、3、5年生存时间作为CIK疗效评价标准。时间：从病人确诊之日计起，至去世之日止。治疗组：用CIK生物治疗5个疗程以上的病例。对照组：和临床应用单位同时期内，只用三大常规疗法，不用CIK生物治疗的同种病例相比较。9T/CI390—2024一CIK（NK）活性检测表1.制备效靶细胞时分抽静脉血ML，时分得PBMC取PBMCML（/ML）加稀释液ML，调浓度为/ML，共ML取K562ML（/ML）加稀释液ML，调浓