第五章 发酵工程课件

第五章发酵工程主讲人：黄循吟第五章发酵工程一、概述问题：1、什么是发酵？

2、什么是发酵工程？它研究的内容是什么？

3、发酵工程应用微生物的目的和范围是什么样的？

4、导致发酵工程的发展出现转折的关键技术有哪些？（发展简史如何？）第五章发酵工程发酵：在生理、生化上，发酵也称为发酵作用，是指有机化合物既作为电子受体也作为电子供体的生物降解过程。它有两种解释，一是指由微生物作用于有机化合物的产能分解代谢，一般是在厌氧条件下进行并放出气体的过程。二是指生物体内有机化合物的产能分解代谢，在缺乏分子氧的条件下进行，将有机化合物作氧化剂，也用作可氧化的作用物，有时也称为无氧呼吸或无氧发酵。在工业上，发酵也称发酵工程，现代发酵工程是指微生物在好氧或厌氧环境中生长繁殖、代谢以获得者产品的过程。第五章发酵工程发酵工程：狭义发酵工程：是微生物工程，即利用微生物的特定功能，通过现代工程技术为人类制造有用产品或提供服务的技术。广义发酵工程：除了微生物工程之外，还包括细胞发酵工程、动物细胞发酵工程和生化工程。研究的内容：1）、利用现代生物学手段进行微生物优良菌种的选育；第五章发酵工程2）、微生物菌种的生产。即利用先进事迹的生产工艺高纯度对某微生物进行大量的人工纯培养；3）、微生物初级和次级代谢产物的发酵生产；4）、利用微生物的功能对某些化学物质进行修饰和改造，对某些有毒物质进行分解，以及对矿产材料进行浸提和浓缩等。第五章发酵工程发酵工程应用微生物的目的和范围：发酵工程是以工业化生产为目的，也就是通过微生物的代谢活动来获得医药、食品、化工等产品以及进行生物学材料和非生物材料与环保等方面的过程，因此，发酵工程的应用目的和范围有三种情况：一是直接生产菌体；二是利用微生物代谢产物；三是微生物学功能的利用。第五章发酵工程意义：由于发酵工业具有高效、安全、投资省、见效快和污染小的特点，因此，它日益受到各方面的重视，目前，已建立了一批微生物学产业，成为世界经济的重要组成部分。生物工程中的各个领域如细胞工程、基因工程、酶工程、单克隆抗体、生物量的转化等研究成果，一般都要通过发酵工程才能转化为生产力，获得经济效益和社会效益。就这个意义来说，发酵工程可以说是生物工程的重要组成部分，是大多数生物工程技术产业化的关键环节。第五章发酵工程导致发酵工程的发展出现转折的关键技术：

生物工程技术是古老又年轻的技术体系，这主要是基于利用微生物进行某些产品生产其历史确实可以久远。经历了四个转折时期：1）传统的微生物发酵技术——天然发酵特点：多数产品为嫌气发酵，非纯种培养，凭经验传授技术，产品质量不稳定。生产方式是仅仅是家庭式作坊手工业生产，还谈不上发酵工业。主要产品有各种饮料酒、酒精、酱、酱油、醋、干酪、乳酸等。第五章发酵工程2）第一代微生物发酵技术——纯培养技术的建立

特点：单种微生物的分离和纯培养技术的确立，使发酵技术从天然转变为纯培养发酵，实现了第一个技术进步（也可称为第一转析点）。因此人类开始了人为地控制微生物的发酵进程，从而使发酵的生产技术得到巨大的改良，提高了产品的稳定性。从19世纪末到20世纪30年代，出现的产品有乳酸、酒精、面包酵母、丙酮-丁醇等厌氧产品和柠檬酸、淀粉酶、蛋白酶等好氧产品。第五章发酵工程均为表面培养，产品的生产过程较为简单，对生产设备要求不高，规模不大。3）第二代微生物发酵技术——深层培养技术和代谢控制发酵技术A、青霉素发酵生产的成功，给人类医疗保健事业做出了巨大贡献，同时在发酵工业发展史上写了崭新的一页，给发酵技术带来了以下两在功绩：一是开拓了以青霉素为先锋的庞大的抗生素发酵工业；二是建立了深层培养法（sabmegedculture），把通气搅拌技术引入发酵工业。它使需氧菌的发酵生产从此走上大规模工业化生产途径，通气搅拌液体深层发酵技术是现代发酵工业的最主要的生产方式，这是发酵技术的第二个转折时期。第五章发酵工程代谢控制发酵技术是应用动态生物化学的知识和遗传学的理论选育微生物突变珠，从DNA分子水平上、控制微生物的化谢途径，进行最合理的代谢、积累大量有用发酵产物的技术。此技术不仅已在系列aa、以及核苷酸物质的发酵生产中得到广泛的应用、而且在抗生素等次级代谢产物的发酵中也得到广泛的应用。据此考虑，代谢控制发酵技术为发酵技术发展的第三个转折时期。1960-1970年这段时期是代谢控制发酵技术广泛应用的顶盛时期，几乎所有的aa和核苷酸物质都可以导用发酵法生产。第五章发酵工程4）第三代微生物发酵技术——微生物工程七十年代以后，由于微生物学、生物化学、遗传学与工程学的合流，产生了一门崭新的技术科学——生物工程（生物技术）。那么利用细胞工程和基因工程育种技术，可以构建出新型的工业发酵菌株（即工程菌株或工程细胞株），使发酵产品更加专一化，产品类型更加多样化；利用固定化技术构建的生物反应器和生物传感器，使发酵设备更加小型化，发酵操作更加自动化；第五章发酵工程利用计算机进行发酵过程程序控制，使发酵工艺更加精确化；另外利用超滤、萃取、亲和层析以及高压液相色谱等技术进行产品提取与纯化，使产品的纯度和得率大大提高。从而使发酵工程成为生物工程的重要组成部分，成为真正的高技术，微生物工程也就进入了生物工程的新阶段。因此，细胞工程和基因工程育种技术、固定化技术以及发酵过程中的计算机程序控制技术的建立，是发酵技术发展的第四个转折点。第五章发酵工程近年来，发酵工业又有了很大的发展。这是由于：一方面是对微生物产生的各种生物活性物质和各种转化的活性菌株进行了大规模的筛选，不仅陆续发现了一些新的活性物质，如特异性酶激活剂、免疫调节剂乃至除草剂等，而且还发现了一些新的转化活性，如甾体激素的转化、氨基酸转化等，使过去与发酵无关的一些产品在今天能用发酵的方法来生产，从而大大地拓宽了发酵工业的范围；另一方面是微生物生理代谢及遗传学的研究取得了重大进展，从而使长期处于经验式研究方法的育种与发酵工作开始向所谓理性化研究方法转变。发酵工艺及其程序控制的研究、新的第五章发酵工程生物反应器及传感器的应用，提高了发酵工业的发展水平；基因工程和酶工程与发酵技术相互渗透，用现代生物工程技术对传统发酵技术的改造，使发酵工业获得更大的活力；重组DNA技术的发展，使许多外源活性多肽的基因得以在微生物细胞中克隆与表达，使微生物从来不产生的一些物质（如生长激素、胰岛素、乙肝疫苗、干扰素等）变成了发酵产品，为发酵工业又开辟了一个新的领域。第五章发酵工程由上可见，尽管微生物发酵工程历史悠久，尽管在本世纪初微生物发酵法已逐渐发展成为有效的可控制的工业生产方法，尽管40年代初抗生素大规模深层发酵工艺的建立使发酵工程开始真正成为科学技术，开逐步形成了一批近代的发酵工业，但是微生物工程开始成为现代生物工程的主要部分，突破传统的发酵工艺，并以其产品的多样性、生产工艺的先进性而得到迅速发展则是在近二、三十年，它是随着发酵过程有关理论研究的不断深入，生物反应器及传感器的改进和自动控制技术的发展以及基因工程、细胞工程、酶工程等新技术的发展而产生的。第五章发酵工程二、微生物细胞的培养技术（一）、微生物细胞的营养及培养基（略）；（二）、微生物细胞的培养方法：根据培养基流动性的差异分为液体培养和固体培养。1、液体培养：用液体培养基进行微生物的生长繁殖和发酵的技术。第五章发酵工程1）、液体表面培养法又称液体浅盘培养或静置培养：其过程是将灭菌的液体培养基装入浅盘并使成一定厚度，接入菌种后置于可密闭的培养箱内的盘架上通气培养或进行静置培养。2）、液体深层培养法又称沉没培养法。是目前应用较多的方法。这是将微生物接入装有液体培养基的密闭发酵罐中进行培养和发酵的技术。根据操作方式的差异分为：第五章发酵工程分批培养法：向反应器中一次性投入培养液并接种，在一定条件下培养一定时间后，一次性放出培养液进行后处理的方法。放料后再重新投料，灭菌，接种培养或发酵过程。为了提高后应器的利用效率，常采用多级培养法。即先在小型反应器中接入少量的种子，培养后得较多的细胞又作为种子，接入大型反应器中培养。包括瘤细胞以及杂交瘤细胞等许多动物细胞、植物细胞和微生物细胞均可采用分批培养法。第五章发酵工程本法的优缺点：细胞生长活跃，反应过程易于控制，不易污染。但有时起始底物浓度太高，以致粘度大引起供氧不够，影响微生物生长或者出现底物对微生物生长的抑制，代谢物阻作用，有害物质的浓度随着营养物质的消耗而增加，细胞反应只能在有限的时间内进行，难以维持较长时间和对数生长期。第五章发酵工程分批补料培养法也称补料培养或半连续培养：是指在分批培养过程中，间隔或连续补加新鲜培养基的培养方法。本法优点：克服了高浓度底物的不良影响，反应器的利用率和生产能力都得到提高。连续培养法：在分批培养的对数生长期，以一定流速向反应器连续输入新鲜的培养基，同时以相同的流速连续流出反应液，这种培养方法称为连续培养法，也称流动培养法或开放培养法。第五章发酵工程特点：既保持了培养物质的供给与消耗的相对平衡，也保持了菌体的浓度相对稳定。优缺点：不断输入营养物质，连续排出产物或有害代谢产物，可维持长时间反应，提高设备利用率、产品收率和质量。但操作麻烦，难以控制和易污染。目前，酵母细胞生产，啤酒生产，溶剂（酒精、丙酮-丁醇）及污水处理采用这种工艺。其它如抗生素及酶类药物的生产正在试验阶段。第五章发酵工程在连续培养过程中，根据控制方式不同，又分为：恒化培养法（恒成分连续培养）：通过流加方式，及时补充微生物所消耗的营养物，使培养罐中的营养浓度基本恒定的培养方法。恒浊培养法：通过不断调节流速而使培养物的浊度保持恒定的连续培养法。在连续培养过程中，根据其工艺流程中反应器数目，又可分为：第五章发酵工程单级培养：一个反应器的培养方法。多级培养：由几个反应器串联的连续培养方式。在培养过程中，第一级反应器流出液可作为第二级反应器的进料液，而第二级反应器的流出液又作为第三级反应器的进料液，如此传递就构成多级连续培养方式。第五章发酵工程2、固体培养法：培养基是固体的培养方法。工业上主要利用皮、豆渣及其它杂物等固体材料为基质，并添加其它营养和水分组成。固体发酵方式有多种，根据所用设备和通风方式可分为：1）、浅盘培养：2）、转桶培养法；3）、厚层通风培养法；第五章发酵工程3、透析培养法

在细胞培养过程中，随着细胞的生长，培养液中将积累各种代谢产物，若某些代谢产物对细胞有抑制作用或毒性，则细胞生长及产物的生成受到抑制，此时若用半透膜将代谢产物排出，即可避免产物的抑制作用。这种利用过滤膜将细胞阻留在反应器中，并实现物质交换的培养方式称为透析培养，也称过滤培养。这种方法的缺点是膜易阻塞。第五章发酵工程第五章发酵工程（三）、微生物培养的一般工艺流程第五章发酵工程（四）、微生物培养条件及工艺条件的控制1、温度的影响及控制：2、PH值的影响及控制；3、溶解氧的影响及控制：工业上提高溶液中溶氧水平的措施是：1）、提高设备的供氧能力（如提高通风强度、增加搅拌速度、通气中掺入纯氧和增设挡板等）；2）、通过改进工艺，控制菌体对氧的消耗（控制补料速度，调节温度，液化培养基，中间补水及添加表面活性剂等）。第五章发酵工程（五）、基因工程细胞培养

基因工程细胞的培养技术本质上与一般需氧细胞的培养无差别，但也有其自身的特点，而且有较特殊的防护要求：具体措施是根据对试验室安全度的要求，并采取物理密封和生物密封两种方法：1、物理密封：是将基因工程细胞密封于设备内部，防止其扩散至外界及传染给操作者。密封程度分P1-P4级，级数越大，密封水平要求越高。第五章发酵工程2、生物密封：一是要求使用在特殊培养条件下才能生长的宿主；二是所用的载体对宿主具有高度的专一性。符合这两个条件，获得的工程细胞则不易扩散外界。其密封程度分B1和B2级，B2级的密封程度要求最严格。第五章发酵工程基因工程细胞的工业化培养过程中，对企业设备的物理防护要求分：BL1—LS：基本要求：1）、要求能在密闭状态下实现内部灭菌的培养装置，以防止重组细胞外漏；2）、培养装置中排出气体需经除菌滤器后才能排出；3）、培养后菌体收集、破碎及抽提产物也应在密闭设备或安全柜中完成。第五章发酵工程BL2—LS：BL3—LS：这两级要求相当严格。根据上述要求，在使用基因工程细胞培养过程中，对灭菌、接种、排气、排液、取样、机械密封、细胞收集、细胞破碎及废液处理等设备均有要求。第五章发酵工程基因工程细胞的培养特点：产物的产率往往比试验室培养规模低。原因：一是基因工程细胞的生长速率及表达效率与其所携带的外源DNA的稳定性有关。二是提高基因工程细胞的表达率，需采取适当的措施，如提高DNA在宿主细胞内的拷贝数及促进表达产物从细胞内向外分泌，这种措施还不够成熟；第五章发酵工程三是基因工程细胞的原宿主通常是某些营养物质的缺陷型，有些基因工程细胞生长过程是也产生某些抑制细胞生长的代谢物。针对这些情况，基因工程细胞的培养，至少要遵循P1级物理防护的规定和考虑底物浓度，质粒稳定性和表达率及质粒拷贝数的控制问题。第五章发酵工程三、微生物原生质体的融合技术问题：1、什么是原生质体？它与细菌L型有什么区别？2、什么是微生物细胞工程？3、原生质体融合技术的基本操作程序如何？第五章发酵工程原生质体：是去除细胞壁的裸露细胞，它仍能保持完整的遗传特征及生理生化特征，而且在适当的条件下能再生细胞壁，并恢复完整细胞。微生物细胞工程：细胞工程是生物工程的主体技术之一，而微生物细胞工程则是以微生物细胞为操作对象，以期改变其遗传性状，获得高产菌株及新物质的菌株。那么原生质体融合技术是改造微生物遗传性的重要技术。第五章发酵工程原生质体融合技术的基本操作程序第五章发酵工程四、工业微生物育种技术

微生物菌种资源是发酵工业的基础和关键，要使发酵工业产品的种类、产量和质量都有一个高速度的发展，首先必须选育出性能优良的菌株。工业微生物育种的目的：一是提高生产能力；二是选育适应于生产工艺的菌种；三是改变产物的分配比。当然，要使优良菌种的性能得以充分地发挥，应该具体的、全面的进行分析问题妥善地处理好菌种、工艺和设备及管理等方面的关系，堵能获得更大的经济和社会效益。第五章发酵工程（一）、具有工业价值的微生物菌种的筛选1、工业微生物筛选的一般要求：1）、稳定而高产的遗传特征；2）、抗噬菌体能力强；3）、发酵泡沫少；4）、需氧量低；5）、底物的转化率高；6）、对培养基和前体的耐受力强；7）、选用适当的培养基；第五章发酵工程8）、最适温度高；9）、菌种既要有高的稳定性，又要有基因操作的可修饰性；10）、产物易从发酵液中回收。2、常用的微生物分离筛选的途径：1）、从菌种保存机构的已知菌种中分离。2）、是从自然界分离筛选；3）、从生产中分离筛选。第五章发酵工程3、新菌种分离筛选方法：第五章发酵工程（二）、微生物菌种的改良1、自然选育：在生产中，利用微生物自然突变而进行良种选育的过程。