生物化学 Exploring Proteins(讲稿)

1§5.1样品纯化的基本流程§5.2层析（Chromatography）§5.3电泳（Electrophoresis）§5.4肽的测序与合成

Sequencing&Synthesis§5.5免疫印迹与ELISA§5.6质谱（MS）与蛋白质研究§5.7蛋白质3D结构的测定§5ExploringProteins2§5.1样品纯化的基本流程TissueHomogenization(匀浆)Filtration(过滤）Crudeextract（粗提品）desalination(脱盐)&Concentration(浓缩)

ColumnchromatographySaltingOut(盐析）Centrifugation(离心)(Cultured)CellCelllysis可使用电泳分析每步的分离效果和最终样品的纯度3GeneralCentrifugation4Ultracentrifugation:separationandmassdeterminationm:themassoftheparticle;v:thepartialspecificvolumeρ:thedensityofthemedium;f:thefrictionalcoefficient(ameasureoftheshapeoftheparticle).5SaltingOutAmmoniumsulfateisthemostpopularsaltused6Dialysis7Concentration高分子量聚乙二醇（PEG）8§5.1样品纯化的基本流程§5.2层析（Chromatography）§5.3电泳（Electrophoresis）§5.4肽的测序与合成

Sequencing&Synthesis§5.5免疫印迹与ELISA§5.6质谱（MS）与蛋白质研究§5.7蛋白质3D结构的测定§5ExploringProteins9Chromatography:separatingsubstancesbyallowingthemtopartitionbetweentwophases,onemobile,onestationary.Differencesincharge,size,Affinity,hydrophobicinteractions,chirality(smallmolecule)canbeexploitedforsubstanceseparationwithchromatography.§5.2层析（Chromatography）10Ion-exchangechromatographySize-exclusionchromatographyAffinitychromatographyHydrophobicinteractionchromatographyChromatography11Ion-exchangechromatography12线性盐浓度梯度的形成13Size-exclusion(Gel-filtration)chromatographymassdetermination14Affinitychromatography15HydrophobicInteractionChromatography17§5.1样品纯化的基本流程§5.2层析（Chromatography）§5.3电泳（Electrophoresis）§5.4肽的测序与合成

Sequencing&Synthesis§5.5免疫印迹与ELISA§5.6质谱（MS）与蛋白质研究§5.7蛋白质3D结构的测定§5ExploringProteins18Principleofelectrophoresis电泳原理与粒子大小、形状有关的系数粒子所带电荷大小带电粒子的泳动能力带电粒子的移动速度电场强度19MediaofelectrophoresisMedia:

polyacrylamidegel（聚丙烯酰胺凝胶）Socalled:polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE20丙烯酰胺亚甲基（甲叉）双丙烯酰胺Formingofpolyacrylamidegel21Nativeelectrophoresis(非变性电泳）

Denaturationelectrophoresis

(变性电泳）

Isoelectricfocusingelectrophoresis(等电聚焦电泳，IEE）

Twodimensional(2D)electrophoresis(二维电泳）Variationofelectrophoresis22非变性电泳：电泳缓冲液、凝胶、上样缓冲液（溶解样品的缓冲液）中均不含蛋白质的变性因素，电泳过程中尽量维持蛋白质的构象不变。变性电泳：除电泳缓冲液外、在凝胶中含有十二烷基磺酸钠(SDS)，上样缓冲液中含有SDS和二硫键还原剂(如巯基乙醇，二硫苏糖醇[DTT]),电泳前样品加热煮沸9一般约5分钟。该电泳英文缩写：SDS23SDS的特点（1）SDS能够与蛋白质结合，导致蛋白质变性。不同蛋白质-SDS复合物形状相似，都呈椭圆状；（2）大量SDS的负电荷消除了不同种类蛋白质间的电荷符号的差异，蛋白分子越大结合的SDS越多，各蛋白质-SDS复合物的电荷密度（或荷质比）趋于一致；（3）自由电泳时，它们的泳动率基本相同，而在适宜浓度的聚丙烯酰胺凝胶介质中电泳时，由于凝胶的分子筛效应，电泳迁移率就取决于蛋白质-SDS复合物的大小，也可以说是取决于蛋白质（亚基）分子量的大小。24SDS用来估测蛋白质的分子量25Electrophoresis：检测分离纯化效果26IEF(等电聚焦电泳)separatesproteinsbypIThepHgradientinthegelisformedfirstbysubjectingamixtureofsmallmultichargedPolymersthathavemanypIvalues.27282DelectrophoresisIEE+SDS292Delectrophoresis30§5.1样品纯化的基本流程§5.2层析（Chromatography）§5.3电泳（Electrophoresis）§5.4肽的测序与合成

Sequencing&Synthesis§5.5免疫印迹与ELISA§5.6质谱（MS）与蛋白质研究§5.7蛋白质3D结构的测定§5ExploringProteins31§5.4Sequencing&SynthesisInsulin32Sanger经过10多年的努力，使用超过100g牛胰岛素（bovineinsulin），于1953年公布测序结果。因该工作获得1958年的诺贝尔化学奖。首个蛋白质的成功测序33StepsforsequencingStep1:AnalysisofaacompositionStep2:BreakingdisulfidebondsifexistingStep3:CleavinglargepeptideintosmallStep4:Sequencingofthesmallpeptides Step5:OrderingthesmallpeptidesStep6:Locatingdisulfidebondsifexisting34Step1:AnalysisofaacompositionAla,2Gly,Asp,Phe,ArgPeptide6NHCl;~110°;~24hIon-exchangechromatography35Step2:BreakingdisulfidebondsifexistingTwomethods36Step3:CleavinglargepeptideintosmallChemicalcleavagecyanogenbromideEnzymaticcleavage3738Step4:SequencingofthesmallpeptidesThisreagentscanbeusedinSanger’smethod39Step4:SequencingofthesmallpeptidesSanger’smethod40Step4:SequencingofthesmallpeptidesEdman’smethod41Step5:OrderingthesmallpeptidesThr－PheGly－LysThereareatleasttwocleavingways;TheFragmentsmustbeoverlap.42Step6:LocatingdisulfidebondsifexistingMethod1lane1lane3lane2Lane1：BreakingdisulfidebondsandCleavingpeptideintofragmentsLane2：OnlyCleavingpeptideintofragmentsLane1：Marker43Step6:LocatingdisulfidebondsifexistingMethod2：DiagonalelectrophoresisThemixtureofpeptidesissubjectedtoelectrophoresisinasinglelaneinonedirectionandthentreatedwithperformicacid,whichcleavesandoxidizesthedisulfidebonds.Thesampleisthensubjectedtoelectrophoresisintheperpendiculardirection.44测序例子45Theaasequencesofmanyproteinsarecurrently

deducedfromtheirgenesorcDNA（互补DNA）sequences46Peptidesofupto150residuescanbesynthesizedbyautomatedsolid-phasemethodsmainlyinventedbyR.BruceMerrifield(whowonthe1984NobelPrizeinChemistryforthisaccomplishment)§5.4Sequencing&Synthesis47484950§5.1样品纯化的基本流程§5.2层析（Chromatography）§5.3电泳（Electrophoresis）§5.4肽的测序与合成

Sequencing&Synthesis§5.5免疫印迹与ELISA

§5.6质谱（MS）与蛋白质研究§5.7蛋白质3D结构的测定§5ExploringProteins51IgG型抗体的特点H：heavychainL：lightchainV：variableregionC：constantregion—：二硫键抗原的特点52免疫印迹（Immunoblot）的原理53ELISA的原理Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay

54ELISA的种类55§5.1样品纯化的基本流程§5.2层析（Chromatography）§5.3电泳（Electrophoresis）§5.4肽的测序与合成

Sequencing&Synthesis§5.5免疫印迹与ELISA§5.6质谱（MS）与蛋白质研究§5.7蛋白质3D结构的测定§5ExploringProteins56带电粒子在电场/磁场中的运动行为取决于其荷质比(mass-to-chargeratio)，荷质比不同的带电粒子其运动行为不同，利用这种差异进行测量分析的技术就是质谱(Massspectrometry)。质谱是目前测定分子量最准确的方法，并且可用于测定分子结构，蛋白质核酸的测序。实现质谱原理的具体设计方案有多种，在生命科学中应用的质谱主要是飞行时间质谱(TimeofFlightMassSpectrometer，TOF)。质谱（MS）的原理57Matrix-assistedlaserdesorption/ionizationmassspectrometry,MALDIMSMALDIMS（一种TOFMS）58MSpreciselymeasurestheratioofthemasstotheelectricchargeofaparticle(m/z)2is

nextto(m/z)1M:massofproteinX:massoftheaddedgroups(usuallytheH+)N:thenumberofcharges59TandemMS(MS/MS)cangivesequenceinformation60Phe–Pro–Gly–Gln–(Ile/Leu)–Asn–Ala–Asp–(Ile/Leu)–Arg61再示例62§5.1样品纯化的基本流程§5.2层析（Chromatography）§5.3电泳（Electrophoresis）§5.4肽的测序与合成

Sequencing&Synthesis§5.5