2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容课件

2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容2010年版《中国药典》

生物检定部分修订内容

2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容

主要内容一、药品生物检定概况二、药品生物检定增修订情况2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容药品生物检定概况定义应用范围作用2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容药品生物检定--定义

生物检定法是利用生物体包括整体、离体组织、器官、细胞和微生物等评估药物生物活性的一种方法。它以药物的药理作用为基础，以生物统计为工具，运用特定的实验设计在一定条件下比较供试品和相当的标准品或对照品所产生的特定反应，通过等反应剂量间比例的运算或限值剂量引起的生物反应程度，从而测定供试品的效价、生物活性或杂质引起的毒性。

2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容药品生物检定体内测定（invivo）--以整体动物生物体体外测定（inbitro）--以离体器官、组织、微生物、酶和细胞（原代细胞、传代细胞）为生物体，利用这些生物体评价药品的生物活性（药效、活力或毒力）2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容应用范围药品（生化药品、中药）生物制品（疫苗、血液制品）安全性检查2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容应用范围对从动物脏器、微生物或体液等提取的，有效成分不够确切，多组分、结构复杂，理化方法不能有效鉴定并具有生物活性的天然生化药物、中药，以及有些生物技术药物，由于空间结构的细微变化，影响药物的活性中心位点，目前质量标准中仍应用生物检定法评估药物的生物活性。如生化药物：一般是从生物体分离、纯化所得如肝素钠、鱼精蛋白、促肾上腺皮质激素。中药：洋地黄制剂、人工麝香、水蛭等。

2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容药品生物检定—作用工艺与方法验证效价与活性鉴别2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容作用—工艺及方法验证对于新生产工艺、新检测方法的改进、变更，往往需要生物检定来验证核对。中、外药典在重组人生长激素（rhGH）重组人胰高血糖素质量标准中明确规定，在生产研发阶段，“生产过程中的产品必须用体内生物检定方法测定其生物效价”，直到生产稳定为止。2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容作用—效价与活性当采用理化方法测定如HPLC替代胰岛素等原有的生物效价测定法时，仍需作大量的方法比对、相关性研究等工作。2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容作用—效价与活性定量的测定方法半定量的测定方法2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容定量的测定方法

效价（potency）测定是生物检定的主要内容，它是以药理为基础，生物统计为工具，运用特定的实验设计，利用生物体在一定条件下比较供试品与相当于标准品或对照品所产生的特定反应（可测量、量化的生理指标或生物药效或毒力）的一种定量的方法，因而被称为定量药理学。2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容定量的测定方法胰岛素缩宫素肝素卵泡刺激素黄体生成素升压素硫酸鱼精蛋白洋地黄生长激素降钙素2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容半定量的测定方法（活性检查）

当理化测定占主导地位，效价测定一般来讲可以不必精确，可归于活性检查项，采用半定量方法，设定限值，不需精密生物统计，尽可能减少实验动物用量或其他生物体用量；甚至只用于定性的鉴别。例如：新药重组人胰高血糖素类多肽是治疗糖尿病用药，其质量标准中即采用该法（限值为小鼠血糖降低大于20%）进行活性检查。2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容鉴别随着对动物保护意识提高，对实验动物减少、替代、优化（3R：Reduction、Replacement、Refinement）的实施，对能用理化测定的药品，生物效价测定逐渐降为鉴别项的定性或半定量测定。如USP升压素大鼠血压升高法用于鉴别。2010年中国药典缩宫素注射液将子宫收缩法放入鉴别项。2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容二、附录生物检定方法增修订情况2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容附录生物检定方法增修订情况附录增修订主要特点增修订主要内容2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容附录检查法或指导原则药典增修订情况一部二部热原检查法修订修订细菌内毒素检查法修订修订异常毒性检查法新增修订溶血与凝聚检查法新增

过敏反应检查法新增修订降压物质检查法新增修订生物检定统计法

修订中药注射剂安全性检查法应用指导原则修订

化学药品注射剂安全性检查法应用指导原则

新增中药生物活性测定指导原则新增

附录生物检定方法增修订情况2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容附录增修订主要特点

中药质量控制评价模式转变充分验证完善提高充分体现了“3R”原则

2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容附录增修订主要特点中药质量控制评价模式转变生物活性引入实现了中药质量标准由单一指标成分定性定量向活性有效成分及生物测定的综合检测。2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容附录增修订主要特点充分验证：遵循科学性、合理性、可操作性，新建或新设立项目必须经不同实验室的共同验证或适用性研究，如注射剂安全性指导原则对方法学的适用性研究；中药生物活性指导原则要求对方法的专属性、准确性、精密度（重复性、中间精密度、重现性）、适用性、科学性进行了研究。2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容附录增修订主要特点完善提高对2010药典一、二部检查法和指导原则进行修订和改进，对影响结果准确性的实验条件提出了要求，如热原检查法、溶血与凝聚、降压物质检查法、过敏试验。2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容附录增修订主要特点体现了“3R”原则如热原检查法取消家兔使用次数和体重上限规定。中药生物活性指导原则中对动物的使用等。2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容

增修订主要内容一、热原检查法二、细菌内毒素检查法三、异常毒性检查法四、溶血与凝聚检查法五、过敏反应检查法六、降压物质检查法七、生物检定统计法八、中药注射剂安全性检查法应用指导原则九、化药注射剂安全性检查法应用指导原则十、中药生物活性测定指导原则2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容热原检查法定义2010版与2005版区别修订背景实验用兔灵敏度测试热原检查适用性研究2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容热原检查法定义：本法系将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容

2010版与2005版区别2010版2005版1、体重1.7kg以上（三部未改变）体重1.7~3.0kg2、其中升温达0.6℃的家兔应休息2周以上

——3、

____*每一家兔的使用次数，用于一般药品的检查，不应超过10次。*三部仍规定，对血液制品、抗毒素和其他同一过敏原的供试品在5天内可重复使用1次。2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容2010版2005版4、在做热原检查前1-2日在作热原检查前1-2日5、温度相差不得大于3℃，且应控制在17～25℃（指实验室和饲养室）实验室和饲养室的温度相差不得大于5℃，实验室的温度应在17～25℃6、实验室温度变化不得大于3℃应注意实验室温度变化不得大于3℃2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容2010版2005版7、应防止动物骚动防止动物骚动8、置于宽松适宜的装置中置于适宜的装置中9、且同组各兔间正常体温之差不得超过1℃且各兔间正常体温之差不得超过1℃2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容2010版2005版10、与供试品接触的试验用器皿应无菌、无热原。去除热原通常采用干热灭菌法（250℃、加热30分钟），也可采用其他适宜的方法试验用器的注射器、针头及一切与供试品溶液接触的器皿，应置烘箱中用250℃加热30分钟，也可采用其他适宜的方法除去热原2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容2010版2005版11、3只家兔体温升高总和低于1.3℃

（三部未变，仍为1.4℃）3只家兔体温升高总和低于1.4℃

2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容修订背景１、热原实验是一个整体的动物实验，易受许多因素的影响。动物自身的行为、生理、外部环境以及一些实验过程等都可影响结果的准确性。２、对家兔体重取消了上限3.0kg，同时取消家兔使用次数不超过１０次的规定。2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容

修订背景３、增加了升温达0.6℃的家兔应休息2周以上新要求。4、实验环境要求更加严格：实验室与饲养室温度相差由不大于5℃改为3℃5、强调同组各家兔间温差不大于1℃，对家兔固定方式：宽松。6、判定标准更加严格：初试的3只家兔体温升高总和低于1.4℃改为低于1.3℃2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容实验用兔灵敏度测试每年不定期随机抽取体重和使用次数不同的实验用兔，按热原检查法要求注射５EU/kg或10EU/kg内毒素标准品，应得到不符合规定的结果。2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容热原检查适用性研究新品种建立热原检查标准时，建议进行适用性研究，在不影响家兔正常生理的前提下，按人用每公斤体重每小时最大供试品剂量的２－５倍设定限值。

（化学药品一般为２－３倍，中药为３－５倍）。2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容热原检查适用性研究适用性试验时设三组：⑴限值剂量的供试品组⑵10EU/kg内毒素组⑶含10EU/kg内毒素的供试品组。适用性试验判定：⑴组符合规定，⑵、⑶组不符合规定表明该品种可建立热原检查项。2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容二、细菌内毒素检查法定义2010版与2005版区别修订背景注射用药品、生物制品建立细菌内毒素检查法指导原则2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容二、细菌内毒素检查法定义：本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容2010版与2005版区别2010版2005年版1、细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.005EU/ml（用于光度测定法）且对内毒素试验无干扰作用的灭菌注射用水凝胶法细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0.015EU/ml的灭菌注射用水。光度测定法用的细菌内毒素检查用水，其内毒素的含量应小于0.005EU/ml

2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容2010版2005年版2、常用干热灭菌法（250℃、30分钟以上）去除常用的方法是在250℃干烤至少60分钟3、——或鲎试剂生产厂家推荐4、内毒素限值按L=K/M计算，M为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量，以ml/（kg·h）、mg/（kg·h）或U/（kg·h）表示，人均体重按60kg计算，人体表面积按1.62m2计算。注射时间若不足1小时，按1小时计算。供试品每平方米体表面积剂量乘以0.027即可转换为每千克体重剂量（M）内毒素限值按L=K/M计算，M为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量，以ml/（kg·h）、mg/（kg·h）或U/（kg·h）表示，人均体重按60kg计算，注射时间若不足1小时，按1小时计算。2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容

修订背景1、细菌内毒素与检查用水除了强调内毒素含量外，还强调应对内毒素试验无干扰作用。2、强调用干热灭菌法（250℃、30分钟以上）去除内毒素与热原法同步。3、根据某些药（如抗肿瘤药）用体表面积计算给药量的需要，增加了按体表面积给药时的计算方法。2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容注射用药品、生物制品建立细菌内毒素检查法指导原则

本原则依据2010年版药典制订，适用于注射用药品、生物制品建立细菌内毒素检查项目时进行的实验及研究。2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容需建立内毒素检查项目的品种质量标准中有家兔热原检查法需转换为细菌内毒素检查方法的品种。用于注射给药，但未有热原质量控制的品种。注射用新药需建立热原质量控制的品种。用于静脉给药的原辅料2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容建立方法时对鲎试剂及样品的要求同时使用两个鲎试剂厂家的鲎试剂每个品种至少三批样品（上市品种应检测两个以上生产厂家；新药需检测连续生产的样品）。2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容确定内毒素限值一般按公式L=K/M计算。M为人每公斤每小时临床最大用药剂量，依据药品使用说明书，《临床用药须知》确定。儿童用药如大于成人，以儿童为准。为保障安全用药，对于抗感染、抗肿瘤、治疗心血管疾病等重症用的药品、需联合用药的药品，可根据计算值适当调整，严格至计算限值的1/2或1/3。对于体积在100ml以上（包括100ml）的复方静脉输液类品种，内毒素限值一般按0.5EU/ml计。其他单方静脉输液品种除另有规定外也可按用药剂量计算，以EU/mg或EU/U表示。对于美国、欧洲或日本药典已收载的，并已建立细菌内毒素检查法的品种可参考国外药典规定的限值，与按公式计算出的数值比较，以严格者为该品种的限值。如果使用的是国外药典的限值，应以最新版本药典为准。2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容干扰实验建议使用较低灵敏度鲎试剂(0.5EU/ml或0.25EU/ml),以避免供试品中内毒素的阳性影响。2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容三.异常毒性检查法定义2010版与2005版区别2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容三.异常毒性检查法定义：本法系给予小鼠一定剂量的供试品溶液，在规定时间内观察小鼠出现的死亡情况，以判定供试品是否符合规定的一种方法。2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容三.异常毒性检查法异常毒性有别于药物本身所具有的毒性特征，是指由生产过程中引入或其他原因所导致的毒性反应。供试品如不合格，表明药品中含有超过正常产品毒性的毒性杂质，临床用药将可能增加急性不良反应。2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容2010版2005版1、本法系给予小鼠一定剂量的供试品溶液本法系将一定剂量的供试品溶液注入小鼠体内或口服给药2、制备配制2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容四.溶血与凝聚检查法定义2010版与2005版区别修订背景2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容四.溶血与凝聚检查法定义：本法系将一定量供试品与2%的家兔红细胞混悬液混合，温育一定时间后，观察其对红细胞状态是否产生影响的一种方法。2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容2010版2005版1、2%的家兔红细胞混悬液2%的兔（或羊）红细胞混悬液2、取健康家兔血液取兔或羊血数毫升（约20ml）3、0.9%氯化钠溶液、蒸馏水0.9%氯化钠溶液或蒸馏水2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容2010版2005版4、如试管中的溶液呈澄明红色如试验中的溶液呈澄明红色5、但1、2号管和5号管肉眼观察无明显著差异但1号管和5号管比色无明显著差异6、轻轻倒转3次仍不分散

振摇后不分散2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容2010版2005版7、应进一步置显微镜下观察，如可见红细胞聚集为凝聚。如有红细胞凝聚的现象，可按下法进一步判定是凝聚还是假凝聚。若凝聚物在试管振荡后又能均匀分散，或将凝聚物置于载玻片上，在盖玻片边缘滴加2滴0.9%氯化钠溶液，置显微镜下观察，凝聚红细胞能被冲散者为假凝聚，若凝聚物不被摇散或在玻片上不被冲散者为凝聚。2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容

修订背景1、考虑一般家兔容易得到，故将羊血删去；采用兔红细胞悬液；2、2010版用轻轻倒转3次来观察凝聚，规范了操作；3、在显微镜下见红细胞凝集为凝聚，简单明确；4、同时观察1、2号两个平行管与5号管的对比，来判定是否溶血；5、考虑药物与一次性试管（高分子材料）的相容性，强调用玻璃试管。2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容五.过敏反应检查法定义2010版与2005版区别修订背景2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容五.过敏反应检查法定义：本法系将一定量的供试品溶液注入豚鼠体内，间隔一定时间后静脉注射供试品溶液进行激发，观察动物出现过敏反应的情况，以判定供试品是否引起动物全身过敏反应。2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容

2010版与2005版区别2010版2005版1、供试品溶液进行激发

供试品进行攻击2、制备配制3、腹腔或适宜的途径注射腹腔注射4、称量

测定2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容2010版2005版6、动物有无过敏反应症状动物有无竖毛、呼吸困难、抽搐等过敏反应7、如在同一只动物上出现竖毛、发抖、干呕、连续喷嚏3声、连续咳嗽3声，紫癜和呼吸困难等现象如有竖毛、喷嚏、干呕、连续咳嗽3声和呼吸困难等现象8、或出现二便失禁、步态不稳或倒地、抽搐、休克、死亡现象之一者或出现抽搐、休克、死亡现象之一者2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容

修订背景1、适宜的途径——考虑对腹腔有刺激性的药物不适宜腹腔注射；2、强调同一只动物上；3、增加部分严重的反应指标。2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容六.降压物质检查法定义2010版与2005版区别修订背景2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容六.降压物质检查法

定义：本法系比较组胺对照品（S）与供试品（T）引起麻醉猫血压下降的程度，以判定供试品中所含降压物质的限度是否符合规定2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容2010版与2005版区别2010版2005版1、经验证保持活性符合要求的条件下

如无沉淀析出2、制备配制3、按品种项下规定的限值，且供试品溶液与对照品稀释液的注入体积应相等的要求，制备适当浓度的供试品溶液。按品种项下规定的限量，配成适当浓度的供试品溶液。试验时，一般要求供试品溶液与对照品稀释液的注入体积应相等2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容2010版与2005版区别4、一般为13.3～20.0kPa一般为13.3~16.0kPa5、每次注射应在前一次反应恢复稳定以后进行，且相邻两次注射的间隔时间应尽量保持一致相邻两次注射的间隔时间应一致（3~5分钟），每次注射应在前一次反应恢复稳定以后进行6、则判定即认为2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容

修订背景1、强调对照品的降压活性要符合要求2、强调猫的正常血压范围为13.3~20.0kPa3、强调每次注射应在前一次反应恢复稳定以后进行，而不强调要3~5分钟之内。

2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容七.生物检定统计法定义：生物检定统计法主要叙述的是应用生物检定时必须注意的基本原则、一般要求、实验设计及统计方法。2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容

2010版与2005版区别2010版2005版1、生物检定法是利用生物体包括整体动物、离体组织、器官、细胞和微生物等评估药物生物活性的一种方法。它以药物的药理作用为基础，以生物统计为工具，运用特定的实验设计在一定条件下比较供试品和相当的标准品或对照品所产生的特定反应，通过等反应剂量间比例的运算或限值剂量引起的生物反应程度，从而测定供试品的效价、生物活性或杂质引起的毒性

生物检定法是利用药物对生物体或其离体器官组织等所起的药理作用来检定药物效价的方法，用于无适当理化方法进行检定的药物2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容2010版2005版2、可信限和可信限率可信限3、效价的可信限率为可信限的高限与低限之差除以2倍平均数（或效价）后的百分率：

———2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容2010版2005版5、但删除个别结果应符合“特异反应剔除”的要求

—2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容2010版2005版6、如果ｎ次实验结果的不均一性并非个别实验结果的影响,则按(42)式、(43)式计算校正权重W′，如经公式（43）计算结果为负值，可以删除减号后面一项，计算近似的Sm2和各次实验的W′。用W′和∑W′代替公式（37）（38）中W和∑W计算M、Sm

，再按(39)式、(40)式、(41)式计算M的FL、PT及其FL

(42)

(43)

f=n-1

如果n次实验结果的不均一性并非个别实验结果的影响，则按（42）或（43）式计算n个M的不加权均值M及其SM，再按（39）式、（40）式、（41）式计算的M的FL、PT及其FL2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容2010版2005版7、经特异反应剔除计算（公式10），无个别删除结果

—8、合并计算中M=lgPT

—9、Sm2合并计算中各次实验间的差方

—10、W′合并计算中各次实验结果的校正权重

—2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容2010版2005版11、计算结果为负数,可删除减号后面项，Sm2=0.001007计算各次实验结果的差方Sm2、差方和（SM2+Sm2）、校正权重W’、ΣW’M,见表7-2

—2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容2010版与2005版区别12、对结果不均一时进行了举例：如胰岛素测定结果不均一时计算表及计算方法2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容

修订背景1、生物检定法的概念2、可信限率的定义及公式3、（42）、（43）公式修订4、Sm2(各次实验差方)及W′(校正权重)的定义5、合并计算时Ｍ＝lgPT2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容八.中药注射剂安全性检查法

应用指导原则2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容八.中药注射剂安全性检查法

应用指导原则中药安全性检查项目的设定安全性检查方法和检查限值确定2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容八.中药注射剂安全性检查法

应用指导原则本指导原则为中药注射剂临床使用的安全性和制剂质量可控性而定。中药注射剂安全性检查包括：热原（或细菌内毒素）、异常毒性、降压物质、过敏反应物质、溶血与凝聚等项。根据处方、工艺、用法及用量等设定相应检查项目进行适用性研究。·2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容（一）中药安全性检查项目的设定

静脉用注射剂：应设热原（或细菌内毒素）、异常毒性、过敏反应、溶血与凝聚等安全性检查项，必要时考虑降压物质检查项。（功能主治中具有与升压相关内容的注射剂除外）中药注射剂中致热成分复杂，可能干扰细菌内毒素检查，一般首选热原检查项，如该药本身具有清热的药理作用或对家兔有毒性反应，也可选择细菌内毒素检查项。

肌内注射用注射剂：应设异常毒性、过敏反应等检查项。2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容（二）安全性检查方法和检查限值确定方法适用性（设定限值前研究）确定限值应进行三批以上供试品的检查验证2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容1.热原-细菌内毒素检查方法适用性（设定限值前研究）热原检查应做适用性研究，求得对家兔无毒性反应、不影响正常体温和无解热作用的剂量。细菌内毒素检查应进行干扰试验，求得最大无干扰浓度。检查方法

参照热原检查法（附录ⅩⅢA）或细菌内毒素检查法（附录ⅩⅢD）。品种项下可以增加稀释浓度、调节pH和渗透压或缓慢注射等排除干扰或影响的特殊规定。

2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容设定限值--热原检查限值根据临床一小时内最大用药剂量计算。热原检查限值可参照临床剂量计算，一般为人用每公斤体重每小时最大供试品剂量的3～5倍，供试品注射体积每公斤体重一般不少于0.5mL，不超过10mL。限值剂量应不影响正常体温。

2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容设定限值--内毒素检查限值根据临床一小时内最大用药剂量计算内毒素检查限值按规定要求计算，由于药物和适应症(如抗感染、抗肿瘤、心血管药等急重病症用药、儿童老人用药、复合用药、大输液等)的不同，限值可适当严格，至计算值的1/3～1/2，以保证安全用药。细菌内毒素测定浓度应无干扰反应。2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容2.异常毒性检查

方法适用性（设定限值前研究）可参考文献数据，并经单次静脉注射给药毒性试验确定该注射剂的急性毒性数据（LD50或LD1及其可信限）。可由多个实验室或多种来源动物试验求得LD50和LD1数据。注射速度0.1ml/秒，观察时间为72小时。如其它给药途径或延长观察时间应进行相应途径或相应观察时间的急性毒性试验。

检查方法参照异常毒性检查法（附录ⅩⅢE）。对动物、给药途径和给药次数、观察指标和时间等，方法和限值有特殊要求时，可在品种项下另作规定。

2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容设定限值限值应低于该注射剂本身毒性的最低致死剂量考虑到实验室间差异、动物反应差异和制剂的差异，建议限值至少应小于LD1可信限下限的1/3(建议采用1/3～1/6)，如难以计算最低致死量，可采用LD50可信限下限的1/4(建议采用1/4～1/8)。如半数致死量与临床体重剂量之比小于20，可采用LD50可信限下限的1/4或LD1可信限下限的1/3。静脉注射最大剂量0.8ml/20g仍未见毒性反应或死亡，可以此作为检查限值。

2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容3.降压物质检查

方法适用性（设定限值前研究）供试品按一定注射速度静脉注射不同剂量，观察供试品对猫血压反应的剂量反应关系。

供试品与对照品注射体积应相同，通常为0.2～1ml/kg，求得供试品降压物质检查符合规定的最大剂量（最大无降压反应剂量）。检查方法参照降压物质检查法（附录ⅩⅢF）。2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容设定限值临床单次用药剂量的1/5～5倍作为降压反应物质检查剂量限值，急重病症用药尽可能采用高限。特殊情况下，如供试品有一定降压作用，则可按最大无降压反应剂量的1/2-1/4作为限值剂量。供试品原液静脉注射1ml/kg剂量未见降压反应，该剂量可作为给药限值

2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容4.过敏反应检查方法适用性（设定限值前研究）测定供试品对豚鼠腹腔(或皮下)和静脉给药的无毒性反应剂量。可采用注射剂的半成品原辅料进行致敏和激发研究，确定致敏方式和次数在首次给药后14、21、28天中选择最佳激发时间。检查方法参照过敏反应检查法（附录ⅩⅢG）。

2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容设定限值致敏和激发剂量应小于该途径的急性毒性反应剂量,适当参考临床剂量一般激发剂量大于致敏剂量。常用腹腔或鼠鼷部皮下注射途径致敏，每次每只0.5ml,每只1ml静脉注射激发。如致敏剂量较小，可适当增加致敏次数，方法和限值的特殊要求应在品种项下规定。2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容5.溶血与凝聚检查

方法适用性（设定限值前研究）对注射剂原液和稀释液进行溶血与凝聚实验研究,指标除目测外，可增加比色法和显微镜下红细胞计数方法,确定无溶血和或凝聚的最大浓度检查方法参照溶血与凝聚检查法（附录ⅩⅢH）。2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容设定限值以无溶血和凝聚的最大浓度的1/2作为限值浓度一般应高于临床最大使用浓度。2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容

修订背景

1、增加了中药安全性检查项目的设定原则。2、增加了限制前研究（即方法适用性研究），使方法更具科学性、可操作性。3、安全性检查法内容省略，检查限值设定更加具体明确。4、家兔热原检查法检查限值由人用每公斤体重每小时最大供试品剂量的1-3倍修改为3-5倍。2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容九.化学药品注射剂安全性检查法

应用指导原则2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容化学药品注射剂安全性检查法

应用指导原则化学药品（包括抗生素、生化药品）安全性检查项目的设定安全性检查方法和检查限值确定化药与中药注射剂安全性检查法应用指导原则的异同点2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容化学药品注射剂安全性检查法

应用指导原则本指导原则为化学药品注射剂临床使用的安全性和制剂质量可控性而定。化学药注射剂安全性检查包括异常毒性、细菌内毒素（或热原）、降压物质（或组胺物质）、过敏反应等项。根据处方、工艺、用法及用量等设定相应的检查项目进行适用性研究。2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容（一）化学药品（包括抗生素、生化药品）安全性检查项目的设定1、静脉用注射剂应设细菌内毒素（或热原）检查项。所用原料系动物来源或微生物发酵液提取物，组分结构不清晰或有可能污染毒性杂质，且又缺乏有效的理化分析方法的静脉用注射剂，应考虑设立异常毒性检查项。

2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容安全性检查项目的设定1、静脉用注射剂所用原料系动物来源或微生物发酵提取物时,组分结构不清晰，且有可能污染异源蛋白或未知过敏反应物质的静脉用注射剂，如缺乏相关的理化分析方法且临床发现过敏反应，应考虑设立过敏反应检查项。所用原料系动物来源或微生物发酵提取物时,组分结构不清晰或有可能污染组胺、类组胺样降血压物质的静脉用注射剂，应考虑设立降压物质或组胺类物质检查项。2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容安全性检查项目的设定2、肌内注射用注射剂所用原料系动物来源或微生物发酵提取物时,组分结构不清晰或有可能污染毒性杂质，且又缺乏有效的理化分析方法的肌内注射用注射剂，应考虑设立异常毒性检查项。2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容安全性检查项目的设定2、肌内注射用注射剂所用原料系动物来源或微生物发酵提取物时,组分结构不清晰或有可能污染异源蛋白或未知过敏反应物质的肌内注射用注射剂，如缺乏相关理化分析方法且临床发现过敏反应，应考虑设立过敏反应检查项。临床用药剂量较大，生产工艺易污染细菌内毒素的肌内注射用注射剂，应考虑设细菌内毒素检查项2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容安全性检查项目的设定3、特殊途径的注射剂椎管内、腹腔、眼内等特殊途径的注射剂，其安全性检查项目一般应符合静脉用注射剂的要求，必要时增加其它安全性检查项目，如刺激性检查、细胞毒性检查。2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容安全性检查项目的设定4、注射剂辅料注射剂辅料使用面广，用量大，来源复杂，与药品的安全性直接相关。在质量控制中，应根据辅料来源、性质、用途、用法用量，配合理化分析方法，设立必要的安全性检查项目。2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容安全性检查项目的设定5、其它原料和生产工艺特殊的注射剂必要时应增加特殊的安全性检查项目，如病毒检查、细胞毒性检查等。

2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容（二）安全性检查方法和检查限值确定

---组胺检查法定义：本法系将一定浓度的供试品和组胺对照品分别观察出现的收缩反应幅度并加以比较，以判定供试品是否符合规定的一种方法。不合格供试品表明含有组胺和类组胺物质，在临床上可能引起血压下降和类似过敏反应等严重的不良反应。2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容（二）安全性检查方法和检查限值确定

---组胺检查法检查方法

参照本附录“附组胺类物质检查法”设定限值前研究在确定限值前，应考察供试品对组胺对照品引起的离体豚鼠回肠收缩反应的干扰（抑制或增强），求得最大无收缩干扰浓度。若供试品的处方、生产工艺等任何有可能影响试验结果的条件发生改变时，需重新进行干扰试验。2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容组胺检查法干扰试验

按组胺类物质检查法，依下列顺序准确注入供试品稀释液加对照品稀释液低剂量、对照品稀释液低剂量、供试品稀释液加对照品稀释液高剂量、对照品稀释液高剂量（dSL+T、dSL、dSH+T、dSH

），重复一次，如dSL+T及dSH+T所致的反应值与dSL及dSH所致的反应值基本一致，可认为供试品不干扰组胺物质检查；同时应进行本法与降压物质检查法符合性的研究。否则该品种不适合设立组胺物质检查项，建议设立降压物质检查项。2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容组胺检查法限值确定

除特殊要求外，原则上与降压物质检查限值一致，以临床单次用药剂量的1/5～5倍量和每千克体重0.1μg组胺剂量计算注射剂含组胺类物质检查限值，其计算公式为：限值L=K/M，其中K值为人每千克体重接受的组胺量（0.1μg/kg），M为降压物质检查限值（mg/kg、ml/kg、IU/kg）。供试品剂量应低于最大无收缩干扰剂量。抗肿瘤药、心血管病药等急重病症用药应采用高限。2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容组胺类物质检查法定义本法系比较组胺对照品（S）与供试品（T）引起豚鼠离体回肠收缩的程度，以判定供试品中含组胺类物质的限度是否符合规定。

2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容

增订背景1．降压物质检查法使用的动物为猫，现在猫来源复杂、而且难以得到，动物数量、质量都难以保证。因此使用组胺检查法作为体外替代方法。2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容增订背景2．许多中药注射剂品种在做降压物质检查时，存在一过性降压现象，如清开灵注射液、复方苦参注射液等，但在临床使用时并不存在降压现象；还有一些活血化瘀类中药注射剂品种如红花注射液，丹参注射液，红花黄色素注射液等，本身具有扩张血管的作用，在做降压物质检查时，在与临床剂量等同的情况下，血压出现大幅度下降的情况。究其原因，是中药注射剂的成分复杂，还是其本身扩张血管的作用，尚不清楚。因此，在中药注射液的安全性评价中是否增加降压物质检查项一直存在争议。2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容增订过程组胺检查法是豚鼠离体回肠收缩法在药品检验领域的应用。豚鼠离体回肠收缩法本身是一种成熟的药理实验方法，在基础药理研究领域应用广泛，其作用机制、拮抗剂与激动剂的类型与剂量等基础研究均细致深入。本法在借鉴的基础上，对试验条件、结果判定等进行了明确与改良。2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容附组胺检查法营养液组成特点A液：试验当日，取氯化钠160.0g、氯化钾4.0g、氯化钙（按无水物计算）2.0g、氯化镁（按无水物计算）1.0g与磷酸氢二钠（含12个结晶水）0.10g，加注射用水700ml使溶解，再加入注射用水适量，使成1000ml。B液：取硫酸阿托品0.5mg、碳酸氢钠1.0g、葡萄糖（含1个结晶水）0.5g，加适量注射用水使溶解，加A液50.0ml，混合后加注射用水使成1000ml。B液应临用前配制，并在24h内应用。2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容结果判定方法如供试品溶液引起回肠收缩：则分别计算dSL、dT所致反应的平均值。若dT

所致反应的均值不大于dSL

所致反应的均值，即判定供试品组胺类物质检查符合规定；若dT

所致反应的均值大于dSL所致反应的均值，即判定供试品组胺类物质检查不符合规定。2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容结果判定方法如供试品不引起回肠收缩：则在供试品溶液中加入组胺对照品高、低剂量，并按下列次序准确注入dSH、dSL+T、dSH+T、dSL,重复一次。若供试品组胺溶液产生的收缩与对应组胺对照液高、低剂量的收缩基本一致，可判定供试品组胺类物质检查符合规定；若供试品组胺溶液产生的收缩与对应组胺对照液高、低剂量产生的收缩不相符，即减少或无收缩，或不能重复出现，则此检查结果无效，应进行供试品的降压物质检查。2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容技术要求与注意事项

动物要求1、实验证实纯种动物对组胺的反应更为灵敏，收缩值高，灵敏度也较为稳定。因此使用纯种动物是保证实验顺利的基础。2、动物体重应严格控制在250-350g，动物体重过大、过小灵敏度均难以重复。3、禁食时间对豚鼠的肠道平滑肌功能有直接影响，故动物禁食应控制在24h左右，禁食后未使用的动物近期内不应用于本实验。2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容技术要求与注意事项肠管处置1、剖腹取出回肠一段（选用远端小肠，因为此段最敏感），注意避免因牵拉使回肠受损，肠系膜不必要全部分离，容易损伤肠管，少带一些血管组织，肠管更有活力。2、新鲜取出的肠管宜立刻浸泡至营养液B中。3、肠管剪取2～3cm长，具体长度应依据浴桶高度取舍。2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容技术要求与注意事项4、剪取后立即使其在营养中平衡一段时间，并在20分钟内开始给予组胺。

5、离体肠管可以保存于B液中，至2-8℃冰箱中冷藏，通入氧气，24h内可以使用。冰箱中保存的离体肠管使用时宜挂在浴桶内1h左右后再开始试验。

2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容技术要求与注意事项预负荷对于准确记录组胺引起的回肠收缩值十分重要，调零后应预加负荷1g左右，调节使其对收缩的反应最为灵敏。在肠管平衡的过程中，因肠管松弛，预加的负荷值会降低，必要时应调整使其对收缩的反应最为灵敏。但在确定了dSH、dSL后，则不应调整，否则可能引起dSH、dSL的收缩高度改变，失去意义。2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容技术要求与注意事项干扰的判断干扰的判断是试验过程的重要影响因素。试验中有时灵敏度的下降与样品干扰引起的回肠收缩降低难以区分，应静置或冲洗浴筒使灵敏度恢复后重新试验。2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容技术要求与注意事项

建议先取一段肠管，以组胺对照液10-9、10-8、10-7、10-6g/ml…依次给予，观察肠管收缩，以确定所用动物的最佳剂量范围；要注意的是如果组胺对照液的浓度过高，有可能使肠管收缩难以恢复，应更换肠管。2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容（三）化药与中药注射剂安全性检查法应用指导原则的异同点

1.安全性检查法和检查限值确定中异常毒性检查、细菌内毒素、热原检查、降压物质检查、过敏反应检查两者一致。2.化学安全性检查项目设定原则中增加了特殊途径的注射剂、注射剂辅料及其它。3.化学注射剂增加了组胺类物质检查项,而中药注射剂增加了溶血与凝聚检查。2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容十、中药生物活性测定

指导原则生物活性测定法是以药物的生物效应为基础，以生物统计为工具，运用特定的实验设计，测定药物有效性的一种方法，从而达到控制药品质量的作用。其测定方法包括生物效价测定法和生物活性限值测定法。2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容概念控制中药有效性的一种方法；方法基础：生物效应；方法工具：统计学；目的：控制质量；分类：定量法—生物效价测定法定性法—生物活性限值测定法2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容背景中药的药材来源广泛、多变，制备工艺复杂，使得中药制剂的质量控制相对困难中药往往含有多种活性成分和具有多种药理作用，仅仅控制少数成分不能完全控制其质量和反映临床疗效为了使中药的质量标准能更好地保证每批药品的临床使用安全有效，有必要在现有含量测定的基础上增加生物活性测定，以综合评价其质量。2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容（一）基本原则

符合药理学研究基本原则

应符合药理学研究随机、对照、重复的基本原则；具备简单、精确特点；判断标准应明确。体现中医药特点

建立的方法，其测定指标应与该中药的“功能与主治”相一致。品种选择合理

研究的中药材或中成药应功能主治明确，优先考虑适应症明确，成分单一的中药注射剂品种，对急重症用药、保护品种应重点进行研究。方法科学可靠

优先选用生物效价测定法，不能建立生物效价测定的品种可考虑采用生物活性限值测定法2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容体现中医药特色

难度大；判定指标和中医的“功能主治”如何衔接？多功能主治中药指标的选择。2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容品种选择合理功能主治明确；适应症单一；中药注射剂；急重症用药；保护品种；新药？2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容方法科学可靠

生物效价法生物活性限值测定法2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容（二）基本内容

1、实验条件试验系选择供试品选择标准品或对照品选择2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容试验系的选择

应与试验原理和测定指标密切相关；背景资料清楚、影响因素少、检测指标灵敏、成本低廉；实验动物的要求。尽可能使用小鼠和大鼠，应遵循“优化、减少、替代”的“3R”原则。2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容供试品的选择

工艺稳定、质量合格（目前的标准要求）；饮片应基源清楚；使用三批供试品（方法学研究时）。2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容标准品和对照品选择

首选中药标准品；可考虑化学药作为对照品；生物效价测定法必须要有标准品测定相对效价；生物活性限值测定法用对照品作为验证。2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容2、实验设计

设计原理设计类型剂量设计

给药途径给药次数指标选择2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容设计原理

所选实验方法的原理应明确；所选择的检测指标应客观、专属性强；能够体现供试品的功能与主治或药理作用；如果选择机理研究也应考虑指标的专属性2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容设计类型

采用生物效价测定法，应按中国药典二部附录“生物检定统计法”的要求进行实验设计研究；采用生物活性限值测定法，试验设计可考虑设供试品组、阴性对照组或阳性对照组，测定方法需建立动物模型时，应考虑设置模型对照组。重现性好的试验，也可以不设或仅在复试时设阳性对照组。2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容剂量设计

如采用生物效价测定法，供试品和标准品均采用多剂量组试验，并按生物检定的要求进行合理的剂量设计，使不同剂量之间的生物效应有显著性差异。如采用生物活性限值测定法，建议只设一个限值剂量，限值剂量应以产生生物效应为宜；但在方法学研究时，应采用多剂量试验，充分说明标准中设定限值剂量的依据。2010年版《中国药典》生物