第三章食品添加剂的测定

第三章食品添加剂的测定食品添加剂：是指食品在生产、加工、保藏等过程中所加入的天然物质或化学合成物质。食品添加剂一般无营养价值，只是具有防止食品腐败变质、增强食品感官性状或提高食品质量的作用。就食品卫生需要而言，食品添加剂应具备以下条件：

1．加入添加剂以后的产品质量必须符合卫生要求，各项理化指标应经卫生部门审定，对可能出现有害作用的杂质应限制其最高允许量。

2，确定用于食品的添加剂，必须有足够的、可靠的毒理学资料。并经常根据新的毒性试验报告及使用情况作出新的评价。

3．加入食品后，不得产生新的有害物质，不得破坏食品的营养价值，随食品进入人体后，不分解产生有毒有害物质。

4，在允许使用范围和用量内，人长期摄入后不致引起慢性中毒。合理使用食品添加剂，对防止食品腐败变质、改善食品感官性状、满足人们对食品品种日益增多的需要等多方面，均会起到积极的作用。但是，如果滥用食品添加剂，造成添加剂的污染，则将出观一些卫生问题。

如果使用不合格的添加剂，则可能引起中毒。有些添加剂本身对人就有一定毒性，如果不按卫生标准规定而过量使用时，对食入者的健康也是有害的。我国对食品添加剂的使用品种，使用范围和使用量均有严格规定。目前允许使用并订有使用卫生标准的食品添加剂有：防腐剂、抗氧化剂、漂白剂、发色剂、着色剂、甜味剂、酸味剂、香味剂、凝固剂、疏松剂，增稠剂、增白剂、消泡剂、抗结剂、品质改良剂、乳化剂，香料等类。

第一节防腐剂防腐剂是在食品保存过程中具有抑制或杀灭微生物作用的一类物质的总称。我国目前允许使用的防腐剂有：苯甲酸及其钠盐、山梨酸及其钾盐、二氧化硫、焦亚硫酸钾、焦亚硫酸钠、丙酸钙、丙酸钠，对羟基苯甲酸乙酯(尼泊金乙酯)、对羟基苯甲酸丙酯(尼泊金丙酯)和脱氢乙酸。其使用卫生标准，见表3-1。一、苯甲酸与山梨酸的测定在低pH值环境中，苯甲酸对多种微生物有抑制作用(抑制微生物细胞呼吸酶系统的活性)，抑菌最适pH值范围为2.5-4.0，当pH>5.5时，抑菌效果显著减弱。苯甲酸对霉菌和酵母菌的抑制效果甚差。苯甲酸的毒性较小，狗经口的LD50为2g／kg，大白鼠的MNL为500mg／kg。

苯甲酸进入人体后，大部分与甘氨酸结合生成无害的马尿酸，其余部分与葡萄糖醛酸结合生成苯甲酸葡萄糖醛酸苷而解毒。代谢产物均随尿液排出体外。反应式分别为：

山梨酸(钾)主要通过与霉菌、酵母菌酶系统中的巯基结合而达到抑菌(对厌氧芽胞杆菌无作用)。然而，如果食品中已有大量细菌生长繁殖，再加入山梨酸或其钾盐，不但不能抑制细菌生长，反而会被细菌分解成为养料。山梨酸的毒性试验，白鼠经口的LD50(半致死剂量)为7.9-10.5g/kg。用含4%山梨酸的饲料喂养白鼠，不引起任何病变，当含量超过8%，发现肝脏稍大。山梨酸进入人体后，可以参加正常代谢，最终产物为二氧化碳和水。(一)苯甲酸与山梨酸的理化性质

1.苯甲酸又名安息香酸，白色结晶，熔点121-123℃，沸点250℃。难溶于冷水而易溶于热水和有机溶剂。苯甲酸被加热至100℃即开始升华，容易随水蒸气挥发。苯甲酸具酸性，与氢氧化钠作用生成苯甲酸钠。

苯甲酸钠为白色粉末，易溶于水和酒精，难溶于有机溶剂，与酸作用生成苯甲酸。目前认为，苯甲酸及其钠盐是一种安全的防腐剂，国家食品卫生标准中规定,食品的最大使用量为表3-1

2.

山梨酸又名花揪酸，白色结晶或粉末，熔点133～135℃，沸点270℃，难溶于水，饱和水溶液的pH为3.6，易溶于酒精和有机溶剂，能随水蒸气蒸发。在空气中容易氧化变色，遇碱生成盐。山梨酸钾为白色结晶或粉末，熔点270℃。100m1水中能溶解6.76g，在有机溶剂中较难溶解，放置空气中容易氧化变色。

3.

山梨酸及其钾盐可与微生物酶系统中的巯基结合，从而达到抑制作用，对霉菌的抑制效果优于苯甲酸。山梨酸属不饱和脂肪酸，在人体内直接参加脂肪酸代谢，目前认为是一种较苯甲酸更为安全的食品防腐剂。国家食品卫生标准规定在食品中的最大使用量与苯甲酸大致相同，表3-1。苯甲酸及其钠盐与山梨酸及其钾盐的测定方法相同。它们都可以经分离后用气相色谱法、薄层色谱法测定。禁用的防腐剂如硼酸、硼砂和水杨酸通常只进行定性即可结论，无需定量。(二)苯甲酸与山梨酸薄层色谱法测定1．原理样品酸化后，用乙醚提取山梨酸、苯甲酸。将样品提取液浓缩，点于聚酰胺薄层板上，展开。显色后，根据薄层板上山梨酸、苯甲酸的比移值，与标准比较定性，并可进行概略定量。2.仪器、试剂仪器

(1)吹风机。

(2)层析缸。

(3)玻璃板：10×18cm。

(4)微量注射器：10µL，100µL。

(5)喷雾器。2.试剂

(1)异丙醇。

(2)正丁醇。

(3)石油醚：沸程：30—60℃。

(4)乙醚：不含过氧化物。

(5)氨水。

(6)6N盐酸：取100mL盐酸，加水稀释至200mL。

(7)无水乙醇。

(8)聚酰胺粉：200目。

(9)山梨酸标准溶液：精密称取0.2000g山梨酸，用少量乙醇溶解后移入100mL容量瓶中，并稀释至刻度，此溶液每毫升相当于2mg山梨酸。

(10)苯甲酸标准溶液：精密称取0.2000g苯甲酸，用少量乙醇溶解后移入100mL容量瓶中，并稀释至刻度，此溶液每毫升相当于2mg苯甲酸。

(11)展开剂。①正丁醇—氨水—无水乙醇(7：1：2)。②异丙醇一氨水—无水乙醇(7：1：2)。

(12)显色剂：0.04％溴甲酚紫的50％乙醇溶液，用0.1N氢氧化钠溶液调至pH=8。

(13)4％氯化钠酸性溶液：于4％氯化钠溶液中加少量6N盐酸酸化。4．操作方法

(1)样品提取：称取2.5g事先混合均匀的样品，置于25mL带塞量筒中，加0.5mL6N盐酸酸化，用15、10mL乙醚提取两次，每次振摇1分钟，将上层醚提取液吸入另一个25mL带塞量简中，合并乙醚提取液。用3mL4％氯化钠酸性溶液洗涤两次，静止15分钟，用滴管将乙醚层通过无水硫酸钠滤入25mL容量瓶中。加乙醚至刻度，混匀。吸取10.0mL乙醚提取液分两次置于10mL带塞离心管中，在40℃的水浴上挥干，加入0.10mL乙醇溶解残渣，备用。

当样品加酸酸化后，其中的苯甲酸钠转变为苯甲酸。山梨酸钾转变为山梨酸。以乙醚萃取，经挥干乙醚，加适当的溶剂溶解残渣，便可进行测定。在提取苯甲酸、山梨酸之前应先进行样品处理，目的是防止提取过程出现乳化现象而损失苯甲酸、山梨酸，并消除苯甲酸、山梨酸以外的酸性物质给测定带来的误差。具体处理方法有：

1，除酒精因酒精既可溶于乙醚，又可溶于水，当用乙醚提取苯甲酸、山梨酸时便容易乳化，故应先加热挥去酒精，再将样品酸化后用乙醚提取苯甲酸、山梨酸。

2，除脂肪因脂肪易溶于乙醚，而脂肪酸也能消耗碱，当用酸碱滴定法分析苯甲酸、山梨酸时会带来正误差。通常在碱性条件下用乙醚萃取出脂肪，然后再加酸酸化，并用乙醚提取苯甲酸、山梨酸。

3．除蛋白质蛋白质是高分子化合物，结构中既有亲脂基团，又有亲水基团，当用乙醚提取苯甲酸、山梨酸时，蛋白质的存在就容易乳化而给分离苯甲酸、山梨酸带来困难。除蛋白质的方法很多，举例如下：

(1)盐析：在样液中加入大量中性盐如氯化钠，由于在溶液中生成大量带电荷离子而吸引水分子，破坏蛋白质的水化膜，并中和蛋白质的电荷，从而使之聚沉。

(2)加蛋白质沉淀剂：许多金属离子(如Zn2+、Cu2+、Hg2+、Pb2+)及一些生物碱(如单宁苦味酸)均能与蛋白质生成难溶物质而沉淀。

(3)透析：由于蛋白质分子大，不能透过半透膜，苯甲酸、山梨酸则可以自由通过，从而达到分离目的。以上的处理方法应随样品的组成而适当选用。

(2)测定①聚酰胺粉板的制备：称取1.6g聚酰胺粉，加0.4g可溶性淀粉，加约15mL水，研磨3—5分钟，立即倒入涂布器内制成10×18cm、厚度0.3mm的薄层板两块，于室温干燥后，于80℃干燥l小时，取出，置于干燥器中保存。②点样：在薄层板下端2cm的基线上，用微量注射器点1µL、2µL样品液,同时各点1µL、2µL山梨酸、苯甲酸标准溶液。③展开与显色：将点样后的薄层板放入预先盛有展开剂①或②的展开槽内，展开槽周围贴有滤纸，待溶剂前沿上展至10cm，取出挥干，喷显色剂，斑点成黄色，背景为蓝色。样品中所含山梨酸，苯甲酸的量与标准斑点比较定量(山梨酸、苯甲酸的比移值依次为0.82，0.73)。

4.计算苯甲酸或山梨酸(g/kg)=(m1×1000)/(m×10/25×V2/V1×

1000)

式中

m1—为样品斑点中苯甲酸或山梨酸的含量，mg；

m—样品质量，g；

V1—为残渣用无水乙醇溶解后定容体积，mL；

V2—测定时点样的体积，mL；

10—测定时吸取乙醚提取液的体积，mL；

25——样品乙醚提取液总体积，mL；

例在测定酱腌菜中苯甲酸含量时，称取2.5g样品，制成25mL乙醚提取液。取

10.0mL乙醚提取液，挥干乙醚后用0.1mL乙醇溶解残渣。然后按薄层色谱法测定，已知样品液lµL与标准溶液1µL(含苯甲酸2µg)斑点相同，计算样品中苯甲酸含量。代入公式5.注意事项①食品中山梨酸、苯甲酸测定方法较多，目前偏向于仪器分析。一般说来是将样品酸化后用乙醚提取进行测定，测定方法有薄层层析、气相色谱法、高效液相法。②用薄层层析分离山梨酸和苯甲酸，理想的吸附剂为聚酰胺粉。③食品中山梨酸、苯甲酸的测定还可用水蒸气蒸馏后，再进行紫外测定，因在225nm处，山梨酸对苯甲酸测定有干扰，所以用重铬酸钾先将山梨酸氧化，再进行蒸馏分离，取蒸馏液在225nm处测定苯甲酸。二、二氧化硫(亚硫酸盐)的测定二氧化硫是使用已久的防腐剂，也是很好的漂白剂。防腐：二氧化硫溶于水成亚硫酸，对细菌和霉菌均有较强的抑制作用。防腐作用主要是由于亚硫酸具有还原性，可以阻断微生物正常的生理氧化过程，从而起到抑制微生物生长繁殖的作用。它对水果之类食品，可以抑制其氧化酶的活性，防止因氧化酶作用而引起的营养成分破坏和颜色改变。

漂白：我国生产的白木耳用硫磺熏蒸，就是利用硫燃烧产生的二氧化硫的漂白作用。二氧化硫的盐酸副玫瑰苯胺比色法:

二氧化硫被四氯汞钠吸收液吸收后，形成一种稳定的配合物，再与甲醛及盐酸副玫瑰苯胺作用生成紫红色物质，其颜色深浅与二氧化硫含量成正比，通过比色，可以计算出样品中二氧化硫的含量。

漂白剂常用于某些食品，如蜜饯、糖果、糕点、各种食用糖(白糖、冰糖、液体葡萄糖等)和某些淀粉制品(如粉丝)的脱色和漂白。允许使用的漂白剂有亚硫酸钠、低亚硫酸钠、焦亚硫酸钠和亚硫酸氢钠，硫磺也被允许用于一些食品的熏蒸漂白。由于这些物质能分解产生二氧化硫，故具有漂白作用。测定二氧化硫残留量，通常选用副玫瑰苯胺比色法，如二氧化硫含量较高，可以用直接碘量法测定。

副玫瑰苯胺比色法

1.原理食品中残留的二氧化硫被四氯汞钠溶液提取后生成稳定络合物，再与甲醛和盐酸副玫瑰苯胺作用生成紫红色产物。颜色深浅与二氧化硫含量成正比，进行比色测定。反应式

2.仪器、试剂分光光度计。

(1)．四氯汞钠溶液称取氯化汞27.2g和氯化钠11.7g溶于水中，稀释至1000m1。放置过夜，如有浑浊，过滤后使用。

(2)．0.2％甲醛溶液吸取无聚合沉淀的36％甲醛溶液0.55ml，加水稀释至100mL。

(3)．盐酸副玫瑰苯胺溶液称取副玫瑰苯胺(又名对品红、碱性品红)0.1g于乳钵中，加少量水研磨溶解，转入500ml容量瓶中，加盐酸至充分摇匀后刚使溶液由红变黄即可，加水稀释至刻度，密塞保存。

(4)4.12g/L氨基磺酸铵溶液。

(5)乙酸锌溶液称取乙酸锌22g，加水溶解后加入3mL冰乙酸，用水稀释至100mL。

(6)亚铁氰化钾溶液称取11g亚铁氰化钾，加水溶解并稀释至100mL。

(7)0.1mol/L碘溶液

(8)淀粉指示剂称取1g可溶性淀粉，加10mL冷水调成悬浮液，倒入正在沸腾的100mL水中，放冷备用。

(9)二氧化硫标准贮备溶液称取亚硫酸氢钠0.5g，溶于200mL四氯汞钠溶液中，放置过夜，取上清液用定量滤纸过滤后供标定用。标定原理：加入过量的碘溶液，该碘溶液被亚硫酸氢钠还原，剩余的碘溶液用硫代硫酸钠标准溶液滴定，反应方程式如下；方法：准确吸取亚硫酸氢钠溶液10mL于碘量瓶中，加水100mL，准确加入0.1mol/L碘溶液20mL，冰乙酸5mL混匀。在暗处放置2min后，以淀粉溶液作指示剂，用0.1mol/L硫代硫酸钠标准溶液滴定至终点。另取100mL水，作试剂空白试验。计算：

式中：Vo为空白试验消耗标准溶液的体积(mL)；V2为标定时消耗标准溶液的体积(m1);V1为用于标定的亚硫酸氢钠溶液的体积(mL)；

c为硫代硫酸钠标准溶液的量浓度(mol/L)；

32.03为与1.00mL硫代硫酸钠标准溶液[c(Na2S2O2)=1．000mol／L]相当的以mg表示的二氧化硫的质量。

(10)二氧化硫标准使用液临用前，准确吸取二氧化硫标准贮备液适量，用四氯汞钠溶液稀释，使lml相当于2μg二氧化硫。

(11)0.1mol/L硫代硫酸钠标准溶液。

(12)0.5N氢氧化钠溶液。

(13)0.5N硫酸。

3.操作步骤

(1)样品处理

①称取水溶性固体样品如白砂糖5～10g，以少量水溶解后移入100mL容量瓶中，加入4mL0.5N氢氧化钠溶液，5分钟后加入4mL0.5N硫酸后，加入20mL四氯汞钠溶液，以水稀释至刻度。

②如为不溶性固体样品，如饼干、粉丝，可称取5—10g研细磨匀的样品，以少量水湿润后移入100mL容量瓶中，加入20mL四氯汞钠溶液，浸泡4h以上。如上层溶液不澄清，可加入乙酸锌溶液2.5mL，混匀放置片刻，再加入2.5mL亚铁氰化钾溶液，最后加水稀释至100mL，过滤备用。

③液体样品如葡萄酒等可直接吸取5-10mL样品，置于100mL容量瓶中，以少量水稀释，加20mL四氯汞钠吸收液，摇匀，最后加水至刻度，摇匀，必要时过滤备用。

2．测定准确吸取样品处理液0.5～5mL于具塞比色管中。另取同样比色管8支，分别加入二氧化硫标准使用液0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.0、1.5、2.0mL。向样品和标准各管中补加四氯汞钠溶液至10mL，再各加入lmL氨基磺酸铵溶液，lmL0.2％甲醛溶液及lmL盐酸副玫瑰苯胺溶液，摇匀，放置20min。用lcm比色杯，用零管调节零点，于550nm处测定吸光度，绘制标准曲线比较。4、计算

式中；m1为测定用样品液中二氧化硫的含量(mg)；V1为样品处理液的总体积(mL)，V2为测定用样品液的体积(mL)；m为样品质量(g)。5、注意事项(1)加入氨基磺酸铵溶液可消除样品中亚硝酸盐的干扰。(2)配制盐酸副玫瑰苯胺溶液时，盐酸的加入量不可过多，以溶液刚变黄色为度。(3)亚硫酸能与食品中的醛，酮、糖以结合形的亚硫酸存在，测定此类样品时，可先加碱液使其从结合形释放出来，再用酸将碱中和后测定。(4)二氧化硫标准使用液的浓度随放置时间逐渐降低，必需临用前用新标定的二氧化硫标准溶液稀释。(5)直接比色法，显色时间和温度对显色有影响，所以在显色时要严格控制显色时间和温度一致，显色时间10-30分钟内稳定，温度10-25℃显色稳定，高于30℃测定值偏低。第二节甜味剂甜味剂是以增加食品甜味为目的的食品添加剂。甜味剂品种很多，根据其来源可分为人工甜味剂和天然甜味剂两大类。人工甜味剂主要是一些具甜味但又不是糖类的化学物质，甜度一般是蔗糖的数十倍至数百倍，不具有任何营养价值。人工甜味剂品种很多，但由于许多都有较大的毒性而不能作为食品添加剂用。我国目前允许使用的人工甜味剂有糖精钠，环己基氨基磺酸钠，天门冬酰苯丙氨酸甲酯和天门冬酰胺酸钠。

天然甜味剂主要是从植物组织中提取出来的甜味物质，近年也采用人工合成法获得。常见的天然甜味物质有甘草、甜叶菊糖苷、麦芽糖醇、D—山梨糖醇液。我国目前允许使用的甜味剂的使用卫生标准见表3-2。

一、糖精(钠)的测定糖精是我国目前允许使用的人工甜味剂之一。毒性试验，小白鼠腹腔注射，LD50(半致死剂量)为17.5g/kg，大白鼠经口，MNL(最大无作用剂量)为500mg/kg。糖精钠是糖精的钠盐，它们在酸碱溶液中能互相转化；(一)糖精(钠)的理化性质糖精的化学名为邻-磺酰苯甲酰亚胺，系白色晶体，在水中溶解度较小，能溶于乙醚、氯仿，不溶于石油醚．糖精对热稳定性稍差，不过在中性或碱性溶液中短时间加热基本无变化。糖精钠为含两分子结晶水的白色结晶，在空气中能慢慢风化，大约失去一半结晶水而成为白色粉末。味苦，易溶于水，可溶于50倍体积的乙醇中，在其他有机溶剂中溶解度很小。糖精钠水溶液的甜度约为蔗糖的300～500倍，但长时间放置，溶液的甜味将降低。

经过动物试验和对人体使用糖精钠的观察认为，糖精钠并无实际危害作用。由于糖精钠不是食品正常成分，也无营养价值，并且糖精钠及合成中间产物对动物和人体的致癌作用目前尚不能作结论等原因，所以对糖精钠的使用宜持慎重态度，婴儿代乳食品中禁止添加糖精钠。糖精钠的分析方法中，薄层色谱法可供定性和半定量。紫外分光光度法可以作为糖精钠的精确定量方法。(二)、食品中糖精(钠)的薄层色谱法测定1原理食品中的糖精钠在酸性溶液中被有机溶剂提取，提取液经浓缩后进行薄层色谱分离，显色后与标准糖精钠斑点比较定量。本实验条件下，糖精的Rf值约为0.3。

2仪器、试剂

(1)薄层色谱装置。

(2)紫外光分析灯，波长254nm。

(3)电热干燥箱，

(4)电热恒温水箱。

(5)玻璃喷雾器

(6)微量注射器

(7)展开槽

(8)6mol／L盐酸溶液。取100ml盐酸，加水稀释至200ml.(9)40g/L氢氧化钠溶液。

(10)0.02mol/L氢氧化钠溶液。

(11)100g／L硫酸铜溶液。

(12)乙醚不含过氧化物

(13)无水硫酸钠使用前于500℃灼烧3～4h，密塞放冷备用。

(14)无水乙醇及95％乙醇。(15)硅胶G薄层板称取2g硅胶G，加入适量水研磨片刻，涂成厚0.25～0.3mm、大小为10×20cm的薄层，室温晾干，于110℃活化1h使用。

(16)糖精钠标准溶液精密称取于120℃干燥4h后的无水糖精钠0.1702g，用无水乙醇溶解后移入200ml容量瓶中，加95％乙醇至刻度。此溶液lml相当于含两分子结晶水糖精钠lmg。

(17)展开剂苯+乙酸乙酯+36％乙酸(12+7+1)或三氯甲烷：丙酮：甲酸(9：3：0.1)。将以上三种溶剂加入分液漏斗中振摇，静置分层后弃去下层水液，有机层供展开用。

(18)显色剂称取溴甲酚绿和溴酚蓝各0.1g，用无水乙醇溶解并稀释200mL。3操作方法

(1)样品处理①不含蛋白、脂肪等成分的液体样品，如饮料、冰棍、汽水；含二氧化碳的饮料应加热除去二氧化碳后称取，含酒精的饮料在称样后，加入等体积水稀释，滴加40g/L氢氧化钠溶液碱化，于水浴上蒸除酒精。称取样品10g(含糖精钠1～2mg)，加适量水稀释并移入分液漏斗，加入盐酸溶液2mL酸化，用乙醚30、20、20mL提取三次，合并醚提取液，以酸性水(5mL水滴入6mol/L盐酸2滴)洗涤。弃去水层。取醚液通过无水硫酸钠层滤入蒸发皿中，用10ml乙醚冲洗硫酸钠层，洗液并入蒸发皿中，置热水浴上缓缓挥干。放冷，准确加入无水乙醇2mL溶解残渣，将无水乙醇溶液倒入具塞刻度试管内，密塞供薄层点样用。

②含蛋白、淀粉较少的样品：如酱油、果汁、果酱、固体果汁粉等。称取20g或吸取20mL均匀的样品(含糖精钠1—2mg)置100ml容量瓶中，加水至约60mL，加硫酸铜溶液20mL，混匀，再加40g/L氢氧化钠4.4mL，加水至刻度，混匀。静置30min，过滤，取50mL滤液于分液漏斗中，加盐酸溶液2mL酸化，以后按本节样品处理(1)项下相应步骤操作。③含多量蛋白、脂肪、淀粉的样品：如糕点、饼干,称取25g均匀样品，放入透析用的玻璃纸袋中，加入0.02mol/L氢氧化钠液50mL，调匀后扎紧袋口，放入盛有200mL0.02mol／L氢氧化钠液的烧杯中，盖上表面皿，透析过夜。

量取125ml透析液(相当于12.5g样品)，加约0.4mL盐酸溶液使成中性，加20mL硫酸铜溶液，混匀，加40g/L氢氧化钠液4.4mL，混匀放置30min。待蛋白质沉淀，过滤，量取滤液120mL(相当于原样品10g)置分液漏斗中，加入6mol/L盐酸2mL酸化，用乙醚30、20、20mL提取三次，以后操作按不含蛋白、脂肪等样品的相应处理步骤进行。

(2)．测定取薄层板一块，在距底边2cm起始线上点糖精钠标准溶液3、5、7、10μl，点样品处理液10、20μl，点间距lcm。将点好的薄层板用展开剂展开，至溶剂前沿移动约10cm，取出薄层板自然挥干。

在紫外线灯下，观察糖精的荧光点，并将样品斑点与标准斑点比较定量。观察荧光后，将板放在90℃干燥箱中10～15min，取出喷显色剂使板面均匀湿润，糖精斑点显亮黄色，薄层板底色为黄色或淡蓝色，比较样品与标准斑点定量。4计算

式中:m1为样品斑点中糖精钠的含量(mg)；V1为溶解残渣后定容体积(mL)；V2为样品斑点点样的体积(mL)；m-样品的质量(体积),g(mL)[为被乙醚提取的样品液相当于原样品的质量(g)]。5注意事项

(1)除了用碱性硫酸铜溶液沉淀蛋白质外，还可以使用50g／L中性醋酸铅溶液沉淀，再用磷酸钠沉淀过量的铅离子。沉淀剂的用量可以随需要按比例增加。

(2)除了用乙醚作提取溶剂外，氯仿一苯(95+5)混合溶剂也是较好的提取溶剂。

(3)用无水乙醇溶解残渣时，可以用乳头滴管充分冲洗蒸发皿壁，以助溶解完全。如乙醇挥发损失，可将溶液移入具塞刻度试管中定容。

4．喷显色刑后，薄层板的底色以淡蓝色为宜，酸度太大，底色呈黄色，糖精斑点仍为容易分辨的亮黄色。

(三)食品中糖精(钠)的紫外分光光度法测定1原理食品中的糖精钠，在酸性溶液中用有机溶剂提取，经薄层色谱分离后，溶于碳酸氢钠溶液中，在波长的紫外区测定吸光度，与标准比较定量。

2仪器、试剂

(1)紫外分光光度计。

(2)其它仪器同薄层色谱法。

(3)20g／L碳酸氢钠溶液。

(4)糖精钠标准溶液精密称取于120℃干燥4h后的糖精钠0.1702g，置于200ml容量瓶中，加20g／L碳酸氢钠液溶解，并稀释至刻度。此液lml相当于含两分子结晶水糖精钠lmg。

(5)其它试剂同薄层色谱法。3操作方法

(1)样品处理同薄层色谱法样品处理操作方法。

(2)测定①薄层色谱分离；取薄层板一块，在距底边2cm处点样线的中间，点200～400μl样品处理液(含糖精钠0.1～0.5mg)成一条横条状。在点样线距右端1.5cm处点10μl糖精钠标准液。将点好的板用展开剂展开，至溶剂前沿移动10cm，取出薄层板挥干。在紫外灯下观察，将板上样品糖精钠条状斑处的薄层刮入小烧杯中；同时刮下一块与样品条状斑大小相同的空白薄层入另一小烧杯中作对照用。往小烧杯中各加5.0mL碳酸氢钠溶液，于50℃加热助溶，移入离心管中，以3000r／min离心2min，取上清液备测。

②制备标准曲线；吸取0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0ml糖精钠标准液分别于100ml容量瓶中，各加碳酸氢钠溶液至刻度，混匀，于波长270nm处测定吸光度，绘制标准曲线。③分光光度计测定；取样品离心液、试剂空白离心液于270nm处测定吸光度，与标准比较。4计算

式中：ρ为测定样品液中糖精钠的质量浓度(mg／m1)；ρ0为测定空白液中糖精钠的质量浓度(mg／m1)；V1为溶解残渣后定容体积(m1)；V2为点样用样品乙醇液体积(m1)；m为被乙醚提取的样品液相当于原样品的质量(g);[样品的质量（体积），g(ml)];V3为溶解刮下糖精钠时所用2%碳酸氢钠溶液体积(m1)。5注意事项本方法可以同时测定苯甲酸。样品提取、点样(在板上点10μL0.1mg／mL苯甲酸标准溶液)、展开等测定方法均同糖精钠的测定。紫外分光光度法定量时，从薄层板刮下的苯甲酸斑点，溶于10.0mL2％碳酸氢钠溶液中，取5.0mL置于50mL容量瓶中，加lmL6N盐酸，摇匀，加水稀释至刻度，于波长225nm测吸光度。

标准曲线制备：取0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL苯甲酸标准溶液(0.1mg／mL)分别置于100mL容量瓶中，加2％碳酸氢钠溶液至10mL，加lmL6N盐酸溶液，振摇，加水稀释至刻度，同样品溶液测定。第三节着色剂着色剂是以使食品着色为目的的食品添加剂。食品的颜色是食品感官性状的重要指标。若食品具有诱人的色泽，可以刺激食欲。为了强化食品的感官性状，满足人们对食品多样化的要求，经常要对食品进行着色。着色剂品种繁多，根据其来源将其分为天然着色剂和人工着色剂。我国目前允许使用的着色剂有近三十种，常用的着色剂列于表3—3。一、常见的天然着色剂天然着色剂主要从植物组织中提取，对人体基本无害，少数还具有一定的营养价值。缺点是色泽不够鲜艳，色调不易随意调配，着色力弱，且易退色。常见的天然着色剂有姜黄素、虫胶色素、红花黄色素、叶绿素铜钠、β-胡萝卜素、酱色等。二、人工着色剂的测定人工着色剂又称人工合成色素，常以苯、甲苯、萘等为原料，先制备色素的中间体，再将一种或两种中间体进行磺化、偶合、偶氮化等化学反应而成制。缺点是对人有一定毒性。人工着色剂的主要优点是：色泽鲜艳，着色力强，色调多，且成本低廉。(一)我国目前允许使用的人工着色剂1胭脂红2苋菜红3柠檬黄4靛蓝5日落红6赤藓红7亮蓝8新红(二)人工着色剂的测定

1．原理水溶性酸性染料在酸性条件下被聚酰胺吸附，而在碱性条件下解吸附，(或酸性溶液中，用聚酰胺吸附色素使与食品中其他成分分离，经过滤、洗涤、并在碱性溶液中解吸)，再用纸色谱法或薄层色谱法进行分离后，与标准比较定性、定量。

2．试剂

(1)聚酰胺粉(尼龙6)：200目。

(2)硫酸：1：10。

(3)甲醇—甲酸溶液：6：4。

(4)甲醇。

(5)20％柠檬酸溶液。

(6)10％钨酸钠溶掖。

(7)石油醚：沸程60—90℃。

(8)海沙：先用1：10盐酸煮沸一刻钟，用水洗至中性，再用5％氢氧化钠溶液煮沸15分钟，用水洗至中性，再于105℃干燥，贮于具玻璃塞的瓶中，备用。

(9)乙醇—氨溶液：取lmL氨水，加70％乙醇至100mL。

(10)50％乙醇溶液。

(11)硅胶G。

(12)pH6的水：用20％柠檬酸调节至pH6。

(13)盐酸：1：10。

(14)5％氢氧化钠溶液。

(15)碎瓷片：处理方法同海沙。(16)展开剂①正丁醇：无水乙醇：1％氨水(6：2：3)：供纸色谱用。②正丁醇：吡啶：1％氨水(6：3：4)：供纸色谱用。③甲乙酮：丙酮：水(7：3：3)：供纸色谱用。④甲醇：乙二胺：氨水(10：3：2)：供薄层色谱用。⑤甲醇：氨水：乙醇(5：1：10)：供薄层色谱用。⑥2.5％柠檬酸钠：氨水：乙醇(8：1：2)；供薄层色谱用。

(17)色素标准贮备溶液(以下商品作为标准以100％计)。胭脂红：纯度60％；苋菜红：纯度60％；柠檬黄：纯度60％；靛蓝：纯度40％；日落黄：纯度60％；亮蓝：纯度60％。

精密称取上述色素各0.100g，用pH6的水溶解，移入100mL容量瓶中并稀释至刻度。此溶液每毫升相当于1mg商品色素。靛蓝溶液需在暗处保存。

(18)色素标准使用液：临用时吸取色素标准溶液各5.0mL，分别置于50mL容量瓶中，加pH6的水稀释至刻度。此溶液每毫升相当于0.1mg商品色素。

3．仪器

(1)分光光度计

(2)微量注射器或血色素吸管。

(3)展开槽。25×6×4cm。

(4)层析缸。

(5)滤纸：中速滤纸，纸色谱用。

(6)薄层板：5×20cm。

(7)电吹风机。

(8)水泵。

4．操作方法

(1)样品处理①果味水、果子露、汽水：吸取50.0mL样品于100mL烧杯中。汽水需加热驱除二氧化碳。②配制酒：吸取100.0mL样品于烧杯中，加碎瓷片数块，加热驱除乙醇。③硬糖、蜜饯类、淀粉软糖：称取5.0或10.0g粉碎的样品，加30mL水，温热溶解，若样液pH值较高，用20％柠檬酸溶液调至pH4左右。

④含蛋奶的制品

a．奶糖：称取10.0g粉碎均匀的样品，加30mL乙醇-氨溶液溶解，置水浴上浓缩至约20mL，立即用1：10硫酸调溶液至微酸性，再加1.0mLl：10硫酸，加lmL10％钨酸钠溶液，使蛋白质沉淀，过滤，用少量水洗涤，收集滤液。

b.蛋糕类：称取10.0g粉碎均匀的样品，加海沙少许，混匀，用热风吹干样品(用手摸已干燥即可以)，加入30mL石油醚搅拌，放置片刻，倾出石油醚，如此重复处理三次，以除去脂肪，吹干后研细，全部转入G3垂融漏斗或普通漏斗中，用乙醇一氨溶液提取色素，直至色素全部提完，以下按“奶糖”项自“置水浴下浓缩至约20mL”起依法操作。(2)吸附分离将处理后所得的溶液加热至70℃，加入0.5—1.0g聚酰胺粉充分搅拌，用20％柠檬酸溶液调pH至4，使色素完全被吸附，如溶液还有颜色，可以再加一些聚酰胺粉。将吸附色素的聚酰胺全部转入G3垂融漏斗或玻璃漏斗中过滤(如用G3垂融漏斗过滤，可以用水泵慢慢地抽滤)。用20％柠檬酸酸化至pH4的70℃水反复洗涤，每次20mL，边洗边搅拌，若含有天然色素，再用甲醇—甲酸溶液洗涤1～3次，每次20mL，至洗液无色为止。再用70℃水多次洗涤至流出的溶液为中性。

洗涤过程中必须充分搅拌。然后用乙醇一氨溶液分次解吸全部色素，收集全部解吸液，于水浴上驱氨。如果为单色，则用水准确稀释至50mL，用分光光度法进行测定。如果为多种色素混合液，则进行纸色谱或薄层色谱法分离后测定，即将上述溶液置水浴上浓缩至约2mL后移入5mL容量瓶中，用50％乙醇洗涤容器，洗液并入容量瓶中并稀释至刻度。

(3)定性①纸色谱取色谱用纸，在距底边2cm的起始线上分别点3—10μL样品溶液、1—2μL色素标准溶

液，挂于分别盛有2.(16)．①、2(16).②、的展开溶剂的层析缸中，用上行法展开，待溶剂前沿展至15cm处，将滤纸取出于空气中晾干，与标准斑比较定性。也可取0.5mL样液，在起始线上从左到右点成条状，纸的右边点色素标准溶液，依法展开，晾干后先定性后供定量用。靛蓝在碱性条件下易褪色，可用2．(16)．③展开剂。

②薄层色谱

a．薄层板的制备称取1.6g聚酰胺粉、0.4g可溶性淀粉及2g硅胶G，置于合适的研钵中，加15mL水研匀后，立即置涂布器中铺成厚度为0.3mm的板。在室温晾干后，于80℃干燥1小时，置干燥器中备用。

b.点样离板底边2cm处将0.5mL样液从左到右点成与底边平行的条状，板的右边点2μL色素标准溶液。

c．展开苋菜红与胭脂红用2．(16)．④展开剂，靛蓝与亮蓝用2．(16)．⑤展开剂，柠檬黄与其他色素用2．(16)．⑥展开剂。取适量展开剂倒入展开槽中，将薄层板放入展开，待色素明显分开后取出，晾干，与标准斑比较，如比移值相同即为同一色素。

(4)定量①样品测定将纸色谱的条状色斑剪下，用少量热水洗涤数次，洗液移入10mL比色管中，并加水稀释至刻度，作比色测定用。

将薄层色谱的条状色斑包括扩散的部分，分别用刮刀刮下，移入漏斗中，用乙醇—氨液解吸色素，少量反复多次至解吸液无色，收集解吸液于蒸发皿中，于水浴上挥去氨，移入10mL比色管中，加水至刻度，作比色用。②标准曲线制备分别吸取0.0、0.50、1.0、2.0、3.0、4.0mL胭脂红、苋菜红、柠檬黄、日落黄色素标准使用溶液，或0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL亮蓝、靛蓝色素标准使用溶液，分别置于10mL比色管中，各加水稀释至刻度。

上述样品与标准管分别用lcm比色杯，以零管调节零点，于一定波长下(胭脂红510nm，苋菜红520nm，柠檬黄430nm，日落黄482nm，亮蓝627nm，靛蓝620nm)，测定吸光度，分别绘制标准曲线比较或与标准色列目测比较。

(5)计算5注意事项

(1)提取样品及纯化色素的过程中，靛蓝在碱性溶液中容易被破坏褪色，除注意尽快用乙酸调节pH至6外，可改用0.1—0.5％氨水溶液提取和解吸。

(2)展开时应根据同时存在的几种色素选择展开剂。例如，使用展开剂②时苋菜红与胭脂红的比移值比较接近，用展开剂④可将二者很好地分开；使用展开剂①时柠檬黄和靛蓝不易分开，展开剂⑥可将二者很好地分开。

(3)靛蓝在碱性溶液中容易分解，可以用异丁醇：无水乙醇：水(3：2：2)展开。例：测定桔子汽水中的色素含量时，吸取样品50.0mL。经样品处理和吸附分离后制成5mL50％乙醇溶液。取此样液0.5mL进行纸色谱分离、定性。所得色斑与标准胭脂红，柠檬黄斑点比移值(Rf值)相同，将红、黄色斑剪下后分别进行比色测定，其结果红色样斑溶液吸光度与标准胭脂红0.1mg相当；黄色样斑溶液与标准柠檬黄0.05mg相当。试问该样品中含有那种色素。含量各是多少?

解：因为经纸色谱分离后所得色斑与标准色素相同，因此样品中所含色素为胭脂红和柠檬黄。第四节抗氧化剂

为了防止油脂酸败，即防止油脂中不饱和脂肪酸的氧化，常在油脂或含油脂较多的食品中加入抗氧化剂。抗氧化剂有天然物质和化学合成物质两大类。我国允许使用并制订有使用卫生标准的合成抗氧化剂有4种，它们的允许使用范围及用量。见表3-5。

以上4种抗氧化剂，一般认为毒性较小，较为安全。

BHA的LD50为2.9g／kg(大鼠经口)，ADI（人体每日容许摄入量）值为0~0.5mg／kg(暂定)；

BHT的LD50为1.70～1.97g／kg(大鼠经口),ADI（人体每日容许摄入量）值为0~0.5mg／kg；

PG的LD50为3.8g／kg，(大鼠经口)，ADI（人体每日容许摄入量）值为0~0.2mg／kg；异抗坏血酸钠的ADI（人体每日容许摄入量）值为0~5mg／kg(以异抗坏血酸计)。除上述4种较安全的抗氧化剂外，许多天然香料也具有抗氧化作用，如丁香，花椒,茴香，姜和桂皮等。一、食品中BHA与BHT的测定1．原理样品中的丁基羟基茴香醚(BHA)和二丁基羟基甲苯(BHT)用石油醚提取，通过硅胶柱使BHA与BHT分离，BHA与2,6-二氯醌氯亚胺-硼砂溶液生成蓝色。BHT与α,α’-联吡啶-氯化铁溶液生成桔红色，与标准比较定量。

2．试剂

(1)0.01％2,6-二氯醌氯亚胺乙醇溶液：用无水乙醇配制，盛于棕色瓶中，置冰箱保存，三天后须弃去重配。

(2)四硼酸钠(硼砂)缓冲液：称取0.6g硼砂、0.7g氯化钾、0.26g氢氧化钠，加无水乙醇至500mL。放置过夜使溶解。必要时可用滤纸过滤。

(3)0.2％α,α’--联吡啶溶液：称取0.2gα,α’--联吡啶，加2mL乙醇，溶解后加水稀释至100mL。

(4)0.2％三氯化铁溶液：临用新配。

(5)30％乙醇：量取无水乙醇30mL，加水稀释至100mL。

(6)无水乙醇。

(7)石油醚：沸程30～60℃。

(8)硅胶：不活化。

(9)BHA标准储备溶液：精密称取0.050gBHA，加少许无水乙醇溶解后，移入100mL棕色容量瓶中，加无水乙醇至刻度，混匀，避光保存，此溶液每毫升相当于

0.5mgBHA。

(10)BHA标准使用液：临用时吸取1.0mLBHA标准溶液于50mL棕色容量瓶中，加无水乙醇至刻度，混匀，避光保存，此溶液每毫升相当于

10μgBHA。(11)BHT标准储备溶液：精密称取0.100gBHT，加少量无水乙醇溶解后，移入100mL棕色容量瓶中并稀释至刻度。避光保存，此溶液每毫升相当于1.0mgBHT。

(12)BHT标准使用液:临用时精密吸取1.0mLBHT标准溶液于100mL棕色容量瓶中，加无水乙醇至刻度，混匀,避光保存，此溶液每毫升相当于10μgBHT

。3.仪器