植物工厂化育苗教学课件 6植物组培脱毒

植物组培脱毒——植物工厂化育苗组培脱病毒技术植物通过什么方式侵染到病毒？植物遭受病毒有哪些症状，有哪些危害？为什么用组培技术进行植物脱病毒，植物脱病毒的意义？怎样脱病毒，组培脱毒技术方法？具体园艺植物、农作物脱毒方法。外部症状（外观表现不正常状态植物表现出各种症状）内部症状（组织和细胞病变，新陈代谢等生理机能受到干扰：改变寄主植物的正常代谢活动、干扰呼吸作用，光合作用，酶的活性及激素的代谢细胞病变、筛管坏死等）叶片卷曲不舒展叶片失绿变黄椰子死亡病毒在40年间毁坏了近3000万椰子植株，每年持续毁坏50万株1955年遍布欧美的马铃薯退化病毒带入我国，仅河北中部地区减产50%-70%，给种植者带来巨大经济损失葡萄扇叶病毒一般可减产20-50%，且果品质量下降。利用其枝条做繁殖材料时，则枝条的扦插生根力下降60%以上，且嫁接成活率仅为30-50%草莓皱缩病毒症状：叶片畸形，沿叶脉出现小的、不规则褪绿斑及坏死斑危害：繁殖力下降果实变小。草莓产量大幅度下降，甚至绝产。亚洲、非洲和南美洲等木薯种植区普遍发生，重病田产量损失通常在30-40%之间，严重时毁种绝收。20世纪90年代非洲乌干达等国家发生木薯花叶病，给木薯的质量造成毁灭性的打击，造成当地严重的粮食危机，民不聊生病毒的危害：全世界已发现植物病毒有近788种。由于危害可通过营养体传给后代，病毒对寄主植物可造成毁灭性危害，导致大幅度减产，甚至全株死亡。世界作物生产中，病毒危害程度仅次于真菌。植物生长缓慢，营养器官变小，品质降低，农作物产量下降（马铃薯减产70%-80%）花卉园艺植物花色退化，花朵及花冠冠幅变小，观赏性降低。影响经济价值。植物病害逐渐严重甚至大片死亡。病毒危及表现害症状：变色（花叶、斑驳、明脉）：营养被病毒所利用或病毒造成维管素坏死阻碍营养物质运输，叶绿素形成受阻从而产生，花叶，斑点，黄化等现象。花朵花青素也会因为病毒而改变，花色变成杂色，还有深绿浅绿相间的花叶症坏死斑点：植物对病毒过敏性反应导致细胞和组织死亡，变成枯黄甚至褐色。叶片上常呈现坏死斑点。畸形（卷叶、皱缩，矮化，小果）：植物新陈代谢受或体内生长素受到干扰

病毒在不同植物间的传播病毒是寄生物，生存与繁殖必须在寄主间转移。从一个植株转移或扩散到其他植物进行传播。

介体传播：

介体主要以昆虫为主：蚜虫线虫。还有菌真菌等

昆虫介体：常见的蚜虫，蚜虫是病毒主要传播者。还有叶蝉等

土壤中的介体：土壤中的线虫和真菌传播非介体传播：

机械传播：汁液摩擦传播。农具农机、修建工具使用时对植物的污染。或者植株间接触，或者人和动物活动造成的

无性繁殖材料和嫁接传播：植物体内普遍带有病毒，使用枝条、芽作为砧木进行嫁接，就会把病毒带入作为砧木的植株中还有种子，花粉的传播病毒在植物体内移动方式在一株植物内从一个局部到另一个局部叫移动。病毒在植物体细胞间的移动通过

胞间连丝。

通过输导组织系统转移主要通过韧皮部移动的方向是与营养主流方向一致，可随营养进行上下双向移动。多数农作物，特别是无性繁殖作物，都易受到一种或一种以上病原菌的周身浸染。例如，已知草莓能感染62种病毒和类菌质体，因而每年都必须更新母株。病原菌的侵染不一定都会造成植物的死亡，很多病毒甚至可能不表现任何可见症状。然而，在植物中病毒的存在会减少作物的产量和（或）品质。据报道，当以特定的无毒植株取代了被病毒侵染的母株之后，产量最多可增加300％（平均为30％）。植物脱毒苗的意义：因此，为了提高产量和促进活体植物材料的国际交换，根除病毒和其他病原菌是非常必要的。虽然通过杀细菌和杀真菌的药物处理，可以治愈受细菌和真菌侵染的植物，但现在还没有什么药物处理可以治愈受病毒侵染的植物。植物脱毒苗的意义：由于大部分病毒都不是通过种子传播的，因此，若是使用未受侵染或侵染程度较轻的个体的种子进行繁殖，就有可能得到无病毒植株。不过有性繁殖后代常常表现遗传变异性，在园艺和造林业中，品种的无性繁殖十分重要，而这一般都是通过营养繁殖实现的。如果在一个品种中，并非全部母株都受到了侵染，那么只要选出一个或几个无病株进行营养繁殖，也有可能建立起无病的核心原种。植物脱毒苗的意义：但是，若一个无性系的整个群体都已受到侵染，获得无病植株的惟一办法，就是由该植株的无病毒组织，通过组织培养，再生出无病毒的完整植株。植物脱毒苗的意义：脱毒技术与无病毒苗脱毒就是采用一定的方法除去植物体内病毒的技术，最常采用的组培脱毒技术是茎尖培养；茎尖培养不但可以去病毒，而且可以去掉所有的病原菌(包括细菌、真菌等）。茎尖培养法建立之前，在活体上消除病毒的方法是对整个植株进行热处理。无病毒苗：指不含该种植物的主要危害病毒，即经检测主要病毒在植物体内的存在表现阴性反应的苗木。植物组培脱毒作用：1、能够有效地保持优良品种的优良性状。任何一种优良品种均需有一个稳定地保存其遗传性状的繁殖方法。离体无性繁殖可以很好地保持品种的优良特性，是无性繁殖品种繁育的理想途径。2、快速繁殖品种，使优良品种迅速应用。组培快繁繁殖周期短，不受季节限制，繁殖系数高，繁殖速度是任何其他方法所不能比的。3、生产无病毒种苗，防止品种退化。4、提高农产品的商品率，节约耕地，便于运输。离体繁殖的种苗体积小，易携带，运输十分方便。（1）热处理原理植物组织处于高于正常温度环境时，组织内部病毒受热后盾化，其复制功能受到影响，繁殖就会受影响，以致病毒含量不断降低甚至死亡，从而达到脱毒目的。热处理对葡萄扇叶病毒，苹果花叶病毒，康乃馨病毒等一类的圆形或线形病毒起作用

葡萄扇叶病毒在38度处理30分钟可脱毒。早在1889年，国外有人用热水浸甘蔗种子，得到病毒减轻的甘蔗。热处理脱毒是英国卡尼斯，马铃薯块茎37度，处理20天，卷叶病毒消失。局限性：并非所有病毒对热处理敏感，热处理只对等径的，线状的病毒和类菌质体起作用。延长处理时间，病毒钝化效果好，同时也钝化植物组织中的抗性因子而降低处理效果。热处理后只有部分植物能存活。在大批量生产上仍受限制微茎尖脱毒原理病毒在植物体内分布不均，越靠近生长点，病毒浓度越稀，微茎尖不含植物病毒，特别小的芽原基不含病毒。病毒数量随植株部位及年龄而定，越靠近茎顶端区病毒感染浓度越低，生长点（0.1-1mm区域）则几乎不含病毒或含量少。一个比较早的证明实验，康乃馨斑驳病毒研究：切取康乃馨不同大小的芽，将其汁液稀释到500倍，然后接种到指示植物茎尖上（敏感植物），只有微茎尖不染病毒宽森一团队研究：烟草花叶病毒在番茄中大小不一的茎尖中含量是不一样的任何病毒都有容易侵染的植物，这个植物被侵染后会很快表现出症状---敏感植物。敏感植物就是某病毒的指示植物。看到症状就可以判断这个植物有没有感染上该病毒。为什么用茎尖分生组织可以起到脱毒的作用

病毒的浸染或传播两种途径：一个是胞间连丝一个是输导组织（主要靠维管组织）①病毒易于通过维管系统而移动，特别微小的茎尖输导组织没有形成，不能疏导组织传播

病毒在细胞间移动通过胞间连丝，通过胞间连丝速度很慢，生长点最活跃的部分，生长点较快，病毒复制传播跟不上生长点速度,所以生长点没病毒；②在茎尖分生组织存在高水平内源生长素，可以抑制病毒的增殖。植物脱毒的方法1、通过热处理消除病毒（温热疗法）利用病毒和寄主植物对高温忍耐性的差异，将植株置于高于正常环境的温度（35-40度）种，使植物体内病毒全部或部分钝化，而寄主植物基本不受到伤害，达到脱毒目的。病毒DNA分子进入细胞后随植物细胞DNA一起复制。热处理并不能杀死病毒，只能钝化病毒活性，使病毒在植物体内增殖减缓或增殖停止，失去传染能力。作为一种物理效应可以加速植物细胞的分裂，使植物细胞在与病毒繁殖的竞争中取胜。温水浸渍处理脱毒密闭环境中：将要脱毒的材料置于50度左右热水中浸渍十分钟到数小时，即可使病毒失活。方法简单成本低。适合木本植物和休眠器官，休眠芽效果好。上限55度植物会被杀死。植物脱毒的方法2.热空气处理热空气对活跃生长的茎尖效果较好，既能消除病毒，又能使寄主植物又较高的存活机会。处理方法：把旺盛生长的植物移入到高温生长室中，在35~40℃，光照3000—10000lx处理一定时间即可。处理时间的长短，2-4周或更长时间。温度高，脱毒时间长，脱毒效果越好，植株存活率下降。试验母株在高温生长室中生长一段时间，其顶端分生组织比次生分生组织生长迅速，后切取其茎尖分生组织进行离体培养。植物脱毒的方法注意：连续高温处理会使寄主植物受到伤害，解决办法-----高低温交替恒温处理：36-38度左右。

变温处理：32、38度每隔8h交替一次。植物脱毒的方法热处理的优缺点优点:方法简单，效果明显。缺点:1)具有局限性，不能去除所有病毒。只对圆形病毒（苹果花叶病毒），或对线状病毒（马铃薯卷叶病毒）有效；而对杆状病毒（千日红病毒）无效。2)热处理后只有小部分植株能够存活。极易使植物材料受热枯死，造成损失3)延长热处理时间，病毒钝化效果好，同时也可能会钝化植物组织中的抗性因子而降低处理效果。植物脱毒的方法对于热处理时间长短要慎重决定，时间太长，对于植株有伤害。据报道，在菊花中，热处理的时间由十天增加到30天，可使无毒植株百分数由9％增加到90％处理40天或者更长并不能再增加无毒植株的百分数，却会显著减少能形成植株的茎尖总数。有迹象表明，高温处理除了可以消除病毒之外，也能钝化寄主组织中的抗病毒因子。茎尖脱毒可以使用茎尖为外植体，也可以使用茎的顶端分生组织为外植体。茎尖是由顶端分生组织及其下方的1-3个叶原基一起构成的。茎顶端分生组织是指茎的最幼龄叶原基上方的一部分，最大直径约为100um，最大长度约为250um。茎尖与茎顶端分生组织组培脱病毒外植体取样与消毒为了避免外植体灭菌不彻底导致污染，可以先对外植体进行无菌培养，确立了无菌体系后再进行之后的步骤直接选定的植株上顶芽进行消毒接种。采顶芽与侧芽消毒接种。剪取顶芽梢段3、5厘米，剥去大叶片，用自来水冲洗干净，超净台在75%酒精中浸泡30秒左右，用1-3%次氯酸钠或5-7%的漂白粉溶液消毒10-20分钟，最后用无菌水冲洗材料4-5次。（或茎尖外植体要用75％酒精浸蘸一下或0.1％的次氯酸钠消毒10分钟）。剥取茎尖的具体方法工具：解剖镜（体视显微镜），解剖针，解剖刀。为了防止茎尖变干，要在衬有无菌湿滤纸的培养皿内进行解剖。（微茎尖非常小，容易干燥，）在剖取茎尖时，要把茎芽置于解剖镜下，一手用一把细镊子将其按住，另一手用解剖针将叶片和叶原基剥掉。当形似一个透明闪亮的半球形顶端分生组织暴露出来之后，用一个锋利的长柄刀片将分生组织切下来，上面可以带有叶原基，也可不带，然后用同一工具接种到培养基上。注意，不要太大，以免带有较老的组织。

茎尖培养

23-27℃，1500-5000LX，10-16h，

一般光照培养比暗培养效果好。

培养初期茎尖非常小，弱光。

茎尖生长的叶片开展，光照强度加大。利于叶片光合作用，合成有机物。

培养间应更换新鲜培养基。提高培养基中6-BA的浓度可形成大量从生芽。

生根诱导

诱导生根的方法是将2-3cm高的无根苗转入生根培养基继续培养1-2个月可生根。特点：既可缩短热处理时间，提高植株成活率，又可剥离较大的茎尖，提高茎尖培养的成活率和脱毒率。在草莓中，将热处理（36℃,6周）与茎尖培养结合起来，比单独茎尖培养对于消除温性黄边病菌更有效。在大多数的草莓品种中，热处理还能提高植株的生长速率。马铃薯S病毒单独通过热疗法或单独通过茎尖培养都不容易消除。通过培养经过热处理的植株上的茎尖，已在几个马铃薯品种中消除了这两种非常稳定的病毒。热处理和茎尖分生组织培养结合起来的方法脱毒

香石竹脱毒的具体操作过和如下：（1）热处理

将盆栽植株或离体瓶苗，在36～38℃下处理2周，或每天在36℃16小时和38℃8小时处理共30天，光照为3000lx。（2）表面消毒

选取盆栽香石竹植株叶腋间生出的侧芽为外植体，先用自来水冲洗半小时，用75%的酒精消毒30秒，再用2.5%次氯酸钙或次氯酸钠溶液处理15分钟,取出后用无菌蒸馏水清洗4次,用无菌滤纸吸去多余水分备用。（3）茎尖剥离

在双筒解剖镜下。切除叶片使芽体暴露，用解剖针剥掉幼叶，直到只剩下2个最幼小的叶原基。（4）茎尖培养

用小刀片切下茎尖放入培养基。培养条件为25℃，光照16小时，光照强度为2000lx，平均两周进行一次转接，5～7周可获得单个小植株。影响茎尖脱毒效果的因素（一）培养基（1）MS培养基是常用的较好的适于茎尖培养的培养基之一。（提高钾盐和铵盐利于茎尖生长）不同植物茎尖培养，可以在MS培养基成分上做相应调整。（2）激素使用较大的茎尖外植体（500μm或更长）在不含生长调节剂的培养基中也能产生一些完整的植株。少量的（0.1－0.5mg/L）生长素，细胞分裂素利于茎尖生长注意：避免使用2，4－D，因为它通常能诱导外植体形成愈伤组织，广泛使用的生长素是NAA和IAA，其中NAA由于比较稳定，效果更好。（二）外植体大小

在最适培养条件下，外植体的大小可以决定茎尖的存活率。外植体越大，产生再生植株的机会也就越多。茎尖越小脱毒越好。但是茎尖内营养，水分难长时间维持，成功率低。在实际应用中考虑脱毒又考虑成活率一般0.2-0.5mm,带1-2个叶原基的茎尖作为培养材料。影响茎尖脱毒效果的因素（三）培养条件在茎尖培养中光照培养通常都比暗培养的效果好。温度通常是25℃+2℃。胚珠表面灭菌可以提前进行，灭菌后在无菌培养基培养几天，观察没有污染，灭菌成功后再进行下一步接穗及砧木都是无菌状态砧木—种子组培后得到的实生苗（不带病毒）检验病毒d植物组培脱毒举例：马铃薯全国现有马铃薯播种面积300多万公顷，每年需合格种薯45亿公斤，脱毒原种4亿公斤，脱毒小薯或微型薯45亿粒。我国的马铃薯平均单产仅为13.60吨/公顷，是世界单产最高国这瑞士（48.80吨/公顷）的1/4。最主要的因素就是种薯质量差，品种布局不合理。植物组培脱毒举例1：马铃薯马铃薯病毒的种类：危害有17种之多，如X病毒、S病毒、Y病毒、M病毒、A病毒、花叶病毒、纺锤形块茎病毒等。马铃薯病毒可使块茎产量减少50%~80%。马铃薯的茎尖脱毒1，茎尖消毒一般在室内发芽，芽经热处理（38℃）2周。然后取1厘米的茎尖，水洗干净，无菌条件下先用70％的酒精浸组织15-20秒，再用2％次氯酸钠溶液浸泡4--5min，然后用无菌水冲洗3次。2，取材和接种把消毒芽在解剖镜下逐层剥去幼叶，露出圆滑的生长点，留1-2个叶原基，0.2—0.3毫米，随即接种于MS液体培养基上，每升加0.1mgNAA、0.2mgGA3、0.5BA，2%蔗糖，pH值5.8。马铃薯的茎尖脱毒3，培养条件温度：21~25℃光照度：2000-3000lx光照时间：12h/d2-3周长愈伤组织，4-5周长绿点，3--6月长成2-3厘米小芽，越慢越好，出芽很快的扔掉。马铃薯的茎尖脱毒4，继代和生根培养成功的马铃薯脱毒苗