DB37T 4460-2021 规模化牛场气溶胶中口蹄疫病毒、牛病毒性腹泻病毒和牛传染性鼻气管炎病毒实时荧光定量RT-PCRPCR检测技术规程　　

37Real-timefluorescencequantitativeRT-PCR/PCRdetectiontechniqueforfoot-and-mouthdiseasevirus,bovineviraldiarrheavirusandrhinotracheitisvirusinaerosoloflarge-scalecattlefarms2021-12-27发布I本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起1规模化牛场气溶胶中口蹄疫病毒、牛病毒性腹泻病毒和牛传染性鼻气管炎病毒实时荧光定量RT-PCR/PCR检测技术规程GB/T6682分析实验室用水规格GB/T27401实验室质量控制规范动物4缩略语AGI：全玻璃液体冲击式采样器25.1除非另有说明，在检测中使用的试剂均为分析纯，水应符合GB/T5.2体积比25:24的酚：氯仿溶液，应2℃~8℃保存见A.1。5.3体积比24:1的氯仿：异戊醇溶液，应2℃~8℃保存见A.2。5.7TE缓冲液，配制见A.6。录B。6.4冰箱，2℃~8℃和-20℃两种。应用空气微生物采样箱，使用国际标准的AGI采集样本。样品采集后立即用1%甲醛溶液灭活处理。3所提取物为气溶胶采集液，可能含有病毒。操作者必须带口罩和一次性手套，RNA提取尽量在人少），可采用经验证的病毒RNA提），13000r/min、15min，取上），可采用经验证的病毒核酸提取试剂盒，按照试剂盒使用说明书提避免移液器取样损失，建议按n+1个反应配制，计算好各试剂的使用量，加入一适当体积小管中，充分4在样品处理区进行。分别向上述PCR管中加入样本核酸提取步骤中制备的RNA溶液5μL和9结果判定9.1结果分析条件的设定9.2质控标准9.3结果判定检测通道均无Ct值，且无特征性扩增曲线，9.3.3可疑5溶液配制取Tris-饱和酚有机相（下层溶液）50mL和氯仿48mL混匀，2℃~8℃保存。取氯仿48mL和异戊醇2mL混匀，2℃~8℃保存。称取6.055gTris置于100mL烧杯中，加A.40.5mol/LEDTA（pH加0.1%DEPC水定容至50mL，高压灭菌后，降至室温，4℃保存。A.72mol/LNaAc（PH5.6ATGACACAGGAAAACATTCCFermentasRevertAidTMFirstStrandcDNASynthesisKit说明书进行反转录cDNA。以cDNA为模板7/30sec，72℃/30sec，33个循环；第三阶段，72℃/5min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，回收目的取牛病毒性腹泻病毒细胞培养物200μL，参照7.2.1提取病毒RNA，RNA按照FermentasReverFirstStrandcDNASynthesisKit说明书进行反转录cDNA。以cDNA为模板进行PCR扩增，PCR反应液见序结果BLAST比对同B.3，正确的重组质粒命名为pEAST-T3-BVDV，作为检测牛病毒性腹泻病毒的阳性质B.5牛传染性鼻气管炎病毒阳性质粒标取牛传染性鼻气管炎病毒的细胞培养物200μL，参照7.2.2提取病毒DNA。以牛传染性鼻气管炎病载体克隆、重组质粒筛选、DNA测序及测序结果BLAST比对同B.3，正确的重组质粒为阳性，将其命名为pEAST-T3-IBRV，作为检测牛传染性鼻气管炎病毒的阳性质粒标准8空气微生物采样箱，Porton空气微生物采样器，三），设备安装：首先安装三脚架，空气微生物采样器放置高度为距地面1.5m，将30mL灭菌气口上，另一端连接到Porton空气微生物采样器收集参数：采用液体冲击式采样方式，采样流量为12.5L/min，采样时间为30min。样品的灭活处理与分装：气溶胶采样器采集结束后，直接将30mL样本收集到50mL离心管内，采样送往有条件的实验室进行荧光定量PCR检测，采集的两份样品，一份用于直接检测，另一份-20℃保存气溶胶现场采集完毕后，立