(高清版)DB43∕T 954-2014 辣椒炭疽病室内抗性鉴定技术规程

2014-10-21发布2014-11-20实施前言 Ⅱ 12术语和定义 13接种体准备 13.1培养基制备 13.2接种体分离 2 23.4接种体保存 23.5接种体复壮 23.6接种孢子制备 24室内抗性鉴定方法 3 34.2鉴定材料准备 34.3鉴定室设置 34.4对照品种选择 34.5接种方法 3 3 35.1调查时间 35.2调查方法 36抗病性评价 36.1评价标准 3 46.3抗性评价 4附录A(资料性附录)辣椒炭疽病的症状 5附录B(资料性附录)分离物菌落形态和分生孢子 6附录C(规范性附录)分离物PCR检测方法 7附录D(规范性附录)辣椒抗炭疽病病情分级标准、评价标准、抗性评价统计表 工I本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由湖南省植物保护研究所提出。本标准由湖南省农业标准化委员会归口。本标准起草单位：湖南省植物保护研究所。本标准主要起草人：刘勇、张卓、张德咏、谭新球、彭静、罗路云、满益龙。1辣椒炭疽病一般由5种病原菌引起，即红色炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides=Gloeosporiumpiperatum),黑色炭疽病菌(C.coccodes=C.nigrum)、黑点炭疽病菌轮纹，上生小黑点的圆型或不规则型病斑，干燥时呈现膜状且易破裂。病菌呈褪绿呈水渍状，慢慢扩大，病斑中间灰白色，周围褐色。在果实上，渐扩展为褐色凹陷，圆形或不规则形状，病斑上生有黑点，为病原菌分生孢呈不规则或梭形病斑，纵裂凹陷。在我国辣椒种植区，辣椒炭疽病是一病后可引起(30～85)%产量损失(参见附录A图1)。2以L为列：称取琼脂(15～20)g,用自来水定容到1000mL,煮沸后用量筒盛或烧杯盛培养基，然后分装在三角瓶或其他容器中121℃,灭菌30min后取出，冷却后贮存备用。器中121℃,灭菌30min后取出，冷却后贮存备用。的次氯酸钠中浸泡2min,用灭菌水清洗3次后，用灭菌滤纸吸干病健块的水分，用灭菌镊子夹着病健参见附录C.2),经过对获得的DNA进行电泳分析，分离物的DNA提取成功(参见附录C图1),将分离物的DNA进行PCR扩增(定性参见附录C.3),扩增产物用1%琼脂凝胶电泳检测，获得了1条550bp左右的清晰条带(参见附录C图2),经测序后得到的rDNAITS序列提交至GenBank,BLAST结果表明与红心管上，于28℃人工气候箱中黑暗培养3d,在斜面上加一层灭菌矿物油(超过斜面顶部1cm)后置接种前需要进行病原物接种体的复壮。常用的复壮方法为：将接种体培养在PDA培养基上、于34室内抗性鉴定方法4.1鉴定设计鉴定材料选择红色成熟果，每个品种或资源材料设3次重复，每次重复一半接种用无菌水配制的病原菌分生孢子悬浮液1μ1(1×10⁵个/mL)、一半接种的无菌水1μl,每次重复不少于6个果。4.2鉴定材料准备选取形状和成熟度一致、无病无虫危害的健康果实，将果实用清水洗净，晾干干，放入75%的酒精中浸泡2min,用1%次氯酸钠溶液中浸泡2min(2000mL烧杯),用无菌水洗3次(2000mL烧杯),然后在超净工作台中晾干。4.3鉴定室设置人工接种鉴定室应具备人工控制温度(0℃~50℃)、相对湿度(0%~100%)、光照(OLX~12000LX)4.4对照品种选择以亚蔬中心提供的抗辣椒炭疽病品种PBC602和中国农业科学院蔬菜花卉所提供的感辣椒炭疽病品种茄门厚皮辣椒分别作为室内抗病性鉴定的阳性和阴性对照品种，以各鉴定材料与对照相比的相对抗性来判定各鉴定材料的相对抗性。4.5接种方法在每个果实的中央部用微量注射器细刺破表皮后注入1μL用无菌水配制的病原菌分生孢子悬浮液当全部接种完毕后，放入鉴定室内28℃黑暗保湿(相对湿度为100%)24h,以后每天光照12h,相对湿度为(80～100)%,温度控制在28℃。5.1调查时间接种后(5～7)d进行病情调查按照附录D表1对症状的描述，逐一观察果实每一接种处的病斑扩展情形，逐个果实观察发病情况，记载各病级病果数，并将发病结果记入附录D表3。6抗病性评价6.1.1以参鉴品种的病情指数分别与对照品种的病情指数进行比较，以3次重复病情指数平均数与对4照病情指数进行比较，以此作为抗性划分依据。6.1.2在辣椒炭疽病抗性鉴定中，参鉴品种应进行3次鉴定实验，实验以感病对照品种的病情指数>30(该值为参考数值),参鉴品种的空白对照的病情指数为0,即参鉴品种空白对照果实不发病，该抗性6.2数据处理病情指数计算见式(2)6.3抗性评价根据品种3次鉴定实验的平均病情指数，按照附录D表2评价辣椒各品种的抗病性，并将结果统计在附录D表35ab6附录B(资料性附录)将培养7d后的分离物进行肉眼观察，菌落形态刚开始为橙红色，后变为褐色或深灰色，圆形，边缘整齐，菌落轮纹的分界线明显，菌丝呈白色，湿度大的情况下，菌落表面溢出淡红色孢子堆。在电子显微镜下观察其分生孢子盘无刚毛，分生孢子椭圆形，无色，单胞，大小为13.5×4.2Hm,符合辣椒炭疽菌的形态特征。图1皿内分离物菌落形态图2分离物分生孢子7附录C(规范性附录)分离物PCR检测方法C.1试剂及配方C.1.1TE缓冲液配方C.1.2DNA抽提液配方1%CTAB(w/v)(十六烷基三乙基溴化铵)C.1.4TAE电泳缓冲液(PH8.5)配方(50×)100μg/mL蛋白酶K冰乙酸20%(质量浓度)Ficoll1.9%(质量浓度)SDS0.25%(质量浓度)溴酚蓝将培养(5～7)d的分离物，用干净灭菌手术刀刮菌丝与一干净灭菌的1.5mL离心管中，加500H1TE缓冲液混匀，加入10%SDS溶液30H1和10mg/ml蛋白酶K(PK)3H1混匀，37℃水浴孵育1h℃水浴孵育1h。加入100μ1Nacl(5M)混匀。加入80H1CTAB/Nacl混匀，65℃水浴10min。加入等体积的氯仿/异戊醇混合液混匀，12000r/min离心15min。取上清至新1.5mL离心管。加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混合液(25:24:1)混匀，12000r/min离心15min。取上清至新1.5mL离心管，加入等体积的氯仿/异戊醇混合液混匀，12000r/min离心5min。取上清至新1.5mL离心管，加入2/3体积异丙醇，放入-20℃冰箱1h。12000r/min离心10min。去上清，用吸水纸吸干离心管口，沉淀用70%冷乙醇洗涤(轻轻来回倒置离心管)12000r/min离心10min。去上清，用吸水纸吸干离心管口，55℃干燥15min。缓冲液溶解DNA沉淀，用1%的琼脂糖凝胶，按比例混匀电泳上样缓冲液和DNA,将混有上样缓冲液的DNA加至样品孔中，用DNAMaker做分子量的标记，进行电泳分析，电泳结束后，在凝胶成像分析仪下观察是否提取出DNA电泳带，拍摄并记录实验结果，经过对实验结果的观察，分离物DNA提取成功(见图4),剩下的DNA在-20℃保存。8C.3.1PCR引物见表C.1表1检测辣椒炭疽病的PCR引物引物名称引物序列C.3.2辣椒炭疽菌采用的PCR反应体系见表C.2TaqDNA聚合酶(2.5U/H1)引物TIS4(25μmol/H1)引物TIS5(25μmol/μ1)模板DNA(100/Hl)总体积C.3.3PCR反应循环参数95℃预变性5min;95℃变性30s;56℃退火30s,72℃延伸45s,进行30个循环；最后72℃延伸10min,并置于4℃保存。C.3.4PCR扩增产物的检测扩增产物用1%琼脂凝胶电泳检测，按比例混匀电泳上样缓冲液和PCR产物，将混有上样缓冲液的PCR扩增产物加至样品孔中，用DNAMaker做分子量的标记，进行电泳分析，电泳结束后，在凝胶成像9物的ITS片段均在(500~750)bp之间的一条特异性扩增条带(583bp),与预期目的片段长度基本一致(图5)。相同(图6)。Select:AllNoneSelected:0EJN198429.1附录D(规范