(高清版)DB43∕T 953-2014 茄科蔬菜病毒病绿色防控技术操作

ofthesolanaceaevegetablevirusdiseases2014-10-21发布2014-11-20实施湖南省质量技术监督局发布I前言 Ⅱ 1 13术语和定义 4发生流行规律 4.1接触传染病毒病流行规律 24.2虫传病毒病流行规律 25病害诊断 25.1病害田间诊断 25.2生物学检测 2 25.4分子生物学检测 2 27防治方法 37.1种苗防治 37.2农业防治 3 4 47.5农药防治 5 59建立防治档案 5附录A(资料性附录)茄科蔬菜病毒病症状 6附录B(规范性附录)病毒病生物学、血清、分子生物学检测 7附录C(规范性附录)农药防治传毒害虫及病毒病一览表 附录D(资料性附录)茄科蔬菜病毒病防治档案 ⅡDB43/T953—2014本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由湖南省植物保护研究所提出。本标准由湖南省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：湖南省植物保护研究所。本标准主要起草人：刘勇、张德咏、张卓、黄志龙、谭新球、文吉辉、孙淑娥、张宇、罗路云。11范围本标准规定了茄科蔬菜病毒病的术语和定义、发生流行规律、病害诊断、本标准适用于辣椒、番茄、茄子等茄科蔬菜病毒病的绿色防控。2规范性引用文件件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。农药安全使用标准农药合理使用准则瓜菜作物种子茄果类绿色食品农药使用准则3术语和定义绿色防控技术Greencontroltechnical物防治、物理防治和科学用药等资源节约型、环境友好型技术来控制农作物病虫害的植物保护措施。某些病毒亦可在发病植株残体中长期存活；病毒在植物体内进行核酸(RNA或DNA)和蛋白外壳复制并4发生流行规律与带毒害虫的传播有关。病毒病由液汁接触和传毒害24.1接触传染病毒病流行规律病毒可在多种植物上越冬，病残体、带毒种子均可成为病毒病的初侵染源，此外，结、排水不良和偏施氮肥都会加重病情发展。4.2虫传病毒病流行规律黄瓜花叶病毒和烟草花叶病毒主要通过蚜虫和烟粉虱等介体传播，在温室大棚较高适合蚜虫和烟粉虱生长繁殖，导致病毒病常年发生；在湖南地区无设施栽培在4月初进行大田定植，由于温度较低，不适合蚜虫、烟粉虱生长、繁殖，田间未见通过虫传病毒病植株；田间虫传病毒病植株开始于5月底6月初，刚开始发病时田间有少量的蚜虫、烟粉虱，随着温度的上升降雨量减少，特别是8月~9月的高温干旱天气，适合蚜虫、烟粉虱的生长、发育和繁殖，田间出现了大量的蚜虫、烟粉虱，随着蚜虫和烟粉虱的迁移，田间茄科蔬菜大面积的5.1病害田间诊断茄科蔬菜病毒病的危害症状有三种表现症状：叶片出现浓绿和淡绿色相同的花斑，幼苗表现矮缩，新叶略曲扭，成株不矮缩，新叶表现花叶，称为花叶型。有的叶片狭长呈线状，色淡卷曲，节间缩短，称条纹型(参见附录A图A1、A2)。5.2生物学检测用于生物学检测病毒的常用鉴别寄主植物有心叶烟、三生烟、本氏烟、苋用摩擦接种的方法对病毒进行接种培养。具体方法和检测结果见附录B.15.3血清学检测(Dot-ELISA检测)在进行生物学检测的同时也使用血清学的方法对所采样品进行检测。具体方法和检测结果见附录5.4分子生物学检测 (RT),转录合成cDNA链，电泳结束后，取出琼脂糖凝胶，使用Alpha凝胶成像系统观察并拍照记录。扩增片段与预期目标条带大小一致，则为阳性样品，表明植物叶片中携带该病毒见附录B.3。6防治原则3降低病虫害暴发几率，积极保护利用自然天低毒、低残留和低污染的农药，将病虫危害损失降到最低限度。7防治方法选用抗病、避病、优质适合当地栽培条件的各类符合国家种子质量的品种。7.1.2种子脱毒、消毒茄科蔬菜种子播种前选择晴天将种子晒(2～3)d,利用太阳紫外线杀死附着在种子表面的病原菌，用55℃温开水侵泡种子0.5h左右，搓去种子表面粘液，用10%的磷酸三钠溶液浸种0.5h左右，捞出后用干净清水冲洗3次催芽。育苗前，彻底清除苗床枯枝残叶和杂草，深耕土壤30cm左右，边耕边撒上生石灰和百菌清进行土壤消毒，并把土块敲碎整理好成高畦，最后用(400～600)倍高锰酸钾溶液喷洒土壤，然后盖好朔料薄膜覆盖密封苗床7d左右再播种，苗床采用50目以上的银灰色防虫网进行覆盖，用来阻止蚜虫、烟粉虱等传毒害虫的侵入，控制由传毒害虫传播而导致的病毒病的发生；在育苗床上使用频振式杀虫灯诱虫、7.2.1合理轮作倒茬理布局和轮作，对茄科蔬菜实行2～3年以上轮作倒茬。时摘除病虫为害的叶片、果实或整株拔除，带出田外深埋叉、农田除草或其他农作时应减少对作物的机械损伤，防止操作病毒病传播。使土壤疏松，有利于植物根系发育，提高植47.2.5土壤消毒定植前，彻底清除田间枯枝残叶和杂草，深耕土壤，边耕边撒上把土块敲碎整理好成高畦，最后用(400～600)倍高锰酸钾溶液喷洒土壤，然后盖好朔料薄膜覆盖密封田块7d左右再定植。作物育苗或田间种植时用40目以上的防虫网构建人工隔离屏障，能够很好的防止传毒害虫对防虫网内作物的传毒，朔料薄膜全程覆盖生产技菜安全越夏，朔料薄膜的使用不仅在冬季能保温，也可以阻隔降雨危害，确保蔬小行高畦，行与行之间挖一条深(10~15)cm,宽(15～20)cm的沟，以利于排水。科学配方施肥，改善土壤的理化性质和营养状况，促进植物健壮成长，增加其对喷施钙肥、硅肥等微量元素或在作物的不同生育期喷施300倍益农光合细菌菌剂诱导植物对病毒病的抗性。能减少化学农药的使用次数和用量，降低农药对环境的污染。科学管水7.3物理防治7.3.1灯光诱杀使用频振式杀虫灯、氖气灯或诱虫灯等诱杀传毒害虫。蔬菜园一般每30亩安装1盏灯。采用频振式杀虫灯及太阳能杀虫灯诱杀害虫。此装置是利用害虫的趋光、趋波、波段、波的频率设定在特定的范围内，近距离用光，远距离用波，加上害虫本扑灯，灯外配以频阵高压电网，害虫触电后达到诱杀成虫的目的。安装时灯底部距离地面1.20m,于蔬在作物育苗或田间种植时用40目以上的防虫网能够很好的防止传毒害虫对防虫网内作物的传毒。在春季和秋季蚜虫发生期，用银灰色地膜覆盖栽培蔬菜或悬挂银灰色膜条，每亩(30～40)条，可7.3.4色板诱杀利用蚜虫、蓟马、烟粉虱等成虫对黄色或绿色有较强趋性的特性，在田间放置30cm×40cm的诱虫黄板或绿板300块/hm²,将黄板或绿板呈棋盘式均匀插置田间，黄板或绿板底部略高出植株顶端20cm左右，黄板或绿板粘满害虫后及时更换。7.4生物防治保护田间有益昆虫，利用生物多样性控制传毒害虫。5田间释放瓢虫、草蛉等捕食性天敌和丽蚜小蜂等寄生性天敌防治蚜虫、蓟马、烟粉虱等传毒害虫。7.4.3生防菌防控利用蚜霉菌、蜡蚜轮枝菌、1.8%阿维菌素乳油、木霉菌等生防菌株防治传毒害虫。在上述措施无法控制在病毒病和传毒害虫经济阀值以下，且病毒病和传毒害虫出现大面积爆发时，采用农药防治。农药使用应符合国家绿色食品农采用高效、低毒、低残留农药防治病毒病，防治病毒病常用药剂的用量及用法见附录C。通过切断传毒介体的传播途径，来控制茄科类蔬菜病毒病发生具有重要作用。蔬菜定植后(1~3)d,将25%噻虫嗪水分散粒剂稀释(1000~1500)倍液按每株50ml灌根处理，对传毒害虫进行预防。交替使用，同一药剂不得连续施用2次；茄科蔬菜病毒病主要传毒介体有蚜虫、烟粉虱等害虫。a)蚜虫农药防治当田间有虫率(5～15)%时开始用药，优先采用植物源农药，防治蚜虫常用药剂的用量及用法见附录C。b)烟粉虱农药防治当田间有虫率(10～15)%时开始用药，优先采用植物源农药，防治烟粉虱常用药剂的用量及用法见附录C。建立茄科蔬菜病毒病防治档案，具体档案记录表格见附录D。6附录A(资料性附录)茄科蔬菜病毒病的危害症状有三种表现症状：叶片出现浓绿和淡绿色相同的花斑，幼苗表现矮缩，新叶略歪扭，成株不矮缩，新叶表现花斑，称为花叶型。有的叶片狭长呈线状，色淡卷曲，节间缩短，图A1辣椒病毒病为害症状图A2番茄病毒病为害症状7附录B(规范性附录)B.1病毒生物学检测B.1.1病毒摩擦接种方法400)目撒到待接种叶的表面(也可直接将金刚砂加在研磨液中),在营养钵内插上标签，注明处理及时间；用手指或研棒、棉球和纱布蘸取少许汁接过种的叶片，将植株放于温室(最好22~25℃)。用缓冲液接种植株作对照；接种后的纯化，将带毒叶片用接种缓冲液研磨后采用摩擦汁液接种的方法斑点剪下，用接种缓冲液研磨再次接种至枯斑寄主，出现单斑症状后再次取下单现斑点后再取单个斑点接种于系统寄主，出现系统症状后再取叶片进行保存和检测。B.1.2病毒的保存干燥的方法处理后，写明标签，存于-80℃冰箱。将经分离纯化后得到的不同病毒的病毒分离物分别接图B1CMV分离物接种至苋色藜上的症状(a):枯斑；接种至心叶烟上的症状(b):系统花叶。图B2TMV分离物接种至心叶烟上的症状(a):枯斑；接种至三生烟上的症状(b):系统花叶。8B.2病毒的血清检测植物叶片称重后，按重量体积比1:10~1:50(g/ml)加入0.01mol/LPBS研磨；8000rpm离心3min;取2ul上清点到硝酸纤维素膜(NC膜);室温干燥10min;NC膜浸入到含5%脱脂奶粉室温封闭30min;NC膜放入5%的脱脂奶粉1:5000倍稀释的单抗中室温孵育(30～60)min;PBST洗膜(3~4)次，每次3min;NC膜放入用5%的脱脂奶粉1:8000倍稀释的碱性磷酸酶标记羊抗鼠IgG二抗wholemolecule中室温孵育(30～60)min;PBST洗膜(4~5)次，每次5min;最后一遍再用PBS洗5min。显色底物NBT66ul和BCIP33ul加到10ml底物缓冲液中混匀，洗好的膜用滤纸吸干后放入底物显色液中反应，待阳性对照显色明显，而阴性没有任何显色时终止反应(显色5～20min),即在自来水中漂洗一下，肉眼观察并记录结果见图B3。图B3CMV和TMV分离物的Dot-ELISA检测结果B.3分子生物学检测B.3.1GB溶液配方采用硅粒吸附法提取植物总RNA。取病叶0.1g,加3mLGB溶液，研磨至匀浆；取500μL研磨液，加100μLNLS,70℃温育10min,不时上下颠倒混匀，冰上放置5min,13000/min离心10min;取300离心1min,倒去上清；加500μL洗涤液(WB:无水乙醇=1:1)洗涤，6000/min离心1min,倒掉上清，重复该步骤；沉淀加ddH₂O150μL,70℃温育4min,1min后将离心管盖打开，随即盖上；13000/min离心3min,取上清，-20℃保存。B.3.3RT-PCR扩增B.3.3.1反转录反转录试剂盒购自全氏金，以硅粒吸附法提取的总RNA为模板，选取随机引物进行反转录(RT),转录合成cDNA链具体反应体系及步骤见表B.1。9上述混合液25℃孵育10min,42℃孵育30min,85℃加热5min,-20℃保存。名称(前引/后引)引物序列片段长度ATTTAAGTGGASGGAAAAVC(K=G或T;W=A或T;V=A,C或G;S=G或C;Y=C或T;R=A或G;B=G,C或T)前引后引酶反应程序94℃预变性4min,94℃,45s;57℃,45s;72℃,Imin,35个循环；72℃延伸7min。94℃预变性4min,94℃,45s;55℃,45s;72℃,1min,35个循环；72℃延伸7miB.3.4琼脂糖凝胶电泳1%琼脂糖凝胶电泳检测，取5HL扩增反应物与2mLSYBRGreen染料、3mLloadingbuffer混匀，电泳结束后，取出琼脂糖凝胶，使用Alpha凝胶成像系统观察并拍照记录。扩增片段与预带大小一致，则为阳性样品，表明植物叶片中携带该病毒见附录图B.4、B.5。图B.4茄科作物携带CMV的检测图B.5茄科作物携带TMV的检测DB43/T953—2014附录C(规范性附录)防治农药安全间隔期(天)防治时期1.5%植物灵乳剂770.5%大黄素甲醚水剂1000倍液720%盐酸吗啉胍.乙酸铜71000倍喷雾70.