核酸分子杂交

核酸分子杂交NucleicAcidHybridization1

分子杂交技术就是利用了核酸分子的变性与复性原理，使变性的核酸分子与检测核酸分子在碱基互补的条件下形成杂交双螺旋的过程。

核酸分子杂交技术是目前生物化学和分子生物学研究中应用最广泛的技术之一，也是临床分子检验的重要技术。2第一节核酸分子杂交

的基本原理3变性复性核酸分子杂交是基于核酸分子的变性和复性原理的基础上产生和发展起来的。4DNA变性是指在物理或化学因素的作用下，DNA分子互补碱基对之间的氢键断裂，使双链DNA分子变成两条单链DNA的过程。一、DNA变性与复性5引起核酸变性的因素酸碱热变性剂（尿素酰胺）有机溶剂（乙醇丙酮）62.变性的方法：（1）热变性：温度升高到90~100℃时，双链核酸分子链间的氢键完全断裂。（2）酸碱变性：pH值低于3或高于10时，双链核酸分子链间的氢键断裂。（3）化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使双链核酸分子链间的氢键断裂。7变性后DNA其它理化性质变化生物活性丧失粘度下降密度增加增色效应8波长（nm）相对吸收光值（A值）82℃OD260（A260）9增色效应：DNA变性时，其溶液OD260增高。10

Tm：双链DNA变性一半所需要的温度称为解链温度或融解温度（meltingtemperature,Tm）。不同的DNA具有不同的Tm值，一般为70~85℃，其大小与G+C含量成正比。热变性11121.定义：变性的单链核酸分子在一定条件下按碱基互补原则重新结合为双链核酸的过程，称复性。复

性2.复性过程：（1）单链分子间碰撞形成局部双链（2）局部双链周围的碱基如不配对时，双链重新解离（3）局部双链周围的碱基如配对，则形成中心序列（4）形成完整的双链分子13复性过程中的碱基配对14Hybridization15具有互补序列的两条单链核酸都可互补形成双链，如：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、寡核苷酸/DNA和寡核苷酸/RNA，该特性是体外杂交技术的基础。杂交一词指的是互补的单链DNA或RNA分子复性缔合产生双链的杂交分子的过程。16鸡卵清蛋白成熟mRNA与DNA杂交电镜图DNAmRNA17鸡卵清蛋白基因hnRNA首、尾修饰hnRNA剪接成熟的mRNA鸡卵清蛋白基因及其转录、转录后修饰18

DNA-DNA杂交双链分子变性复性

DNA-RNA杂交双链分子

RNA-RNA杂交双链分子寡核苷酸-DNA或RNA杂交双链分子19二、核酸分子杂交

当两条不同来源的单链核酸分子DNA-RNA或DNA-DNA链之间存在互补的碱基序列时，通过碱基互补配对形成双链杂交体的过程，称为分子杂交（molecularhybridization）或核酸分子杂交

。

DNA-DNA

DNA-RNA

RNA-RNA分类20探针待测核酸

应用：(1)检测特定生物有机体之间是否存在亲缘关系（同源性）；(2)用来揭示核酸片段中某一特定基因的存在与否、拷贝数及表达丰度。21概念：核酸探针是指用放射性核素、生物素或其他活性物质标记的，能与特定的核酸序列发生特异性互补的已知DNA或RNA片段。用途：检测待检核酸样品中的特定基因序列。

(DNA-DNA;DNA-RNA;RNA-RNA)要求：特异性，来源方便核酸探针22标记物放射性标记非放射性标记生物素标记地高辛标记荧光素标记探针(probe)：在核酸变性实验中，为使杂交体与单链核酸分子区分开来所使用的带有标记的单链核酸分子。23FITC异硫氰酸酯TRITC硫氰酸四甲基罗达明人染色体不同荧光素染色结果

同位素，非放射性同位素：荧光染料、地高辛素、辣根过氧化酶、碱性磷酸酶等。24杂交的双方:1.待测核酸序列：可以是克隆的基因征段，也可以是未克隆化的基因组DNA和细胞总RNA。

2.核酸探针：是指用放射性核素、生物素或其他活性物质标记的，能与特定的核酸序列发生特异性互补的已知DNA或RNA片段。探针(已知核酸片断，单链)待测核苷酸序列(单链)25第二节核酸分子杂交

的基本方法26一、核酸分子杂交的种类（一）按照杂交的反应条件分为固相和液相杂交两类：固相杂交

探针

被测DNA（RNA）在固体支持物上杂交液相杂交

探针

被测DNA（RNA）在液体中杂交271.固相分子杂交（solid-phasehybridization）：是将待测的靶核苷酸链预先固定在固体支持物（硝酸纤维素膜或尼龙滤膜）上，然后放入含有标记探针的杂交液中，进行杂交反应后，使杂交分子留在支持物上，故也称为膜上印迹杂交。固体杂交的优点：

未杂交的游离探针通过漂洗可容易除去，膜上的杂交分子容易检测，还能防止靶DNA的自我复性，所以被广泛应用。28

固相杂交原位杂交Southernblot（检测DNA）Northernblot（检测RNA）斑点杂交/狭缝杂交292.液相杂交（solutionhbridization）指使变性的待测核酸单链与已知的核酸单链（探针）在溶液中保温，使之形成杂交复合物。利用层析方法将杂交分子与未杂交分子分开后用液闪仪进行计数或利用紫外吸收特性变化分析杂交结果的分子杂交类型。液相杂交又分为：RNA酶保护分析法、核酸酶S1保护分析法。30（二）根据被测定的对象，分子杂交基本可分为以下几大类：1.Southern杂交：

DNA片段经电泳分离后，从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上，然后与探针杂交。被检对象为DNA，探针为DNA或RNA。2.Northern杂交：

RNA片段经电泳后，从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上或尼龙膜，然后用探针杂交。被检对象为RNA，探针为DNA或RNA。31二、分子杂交技术一般过程☆探针制备及标记（同位素或非同位素）☆待测核酸样品制备（分离，纯化）☆杂交（液相，固相，原位杂交）☆杂交后处理（去掉非特异杂交分子）☆显示结果（显色，发光，放射自显影）☆结果分析32

将琼脂糖电泳分离的DNA片段转移到一定的固相支持物上，然后，与核酸探针杂交，检测DNA的方法。又称之为DNA印迹。

检测靶分子为DNA,检测靶分子是否含有目的基因。可用于基因组基因的定性及定量分析、克隆基因的酶切图谱分析、基因突变分析等。（一）Southern

Blotting33基本步骤DNA制备、酶切电泳分离原位DNA变性DNA转膜预杂交、杂交、洗脱杂交结果检测2.待测DNA样品的电泳分离3.凝胶中核酸的变性4.Southern转膜1.待测核酸样品的制备5.Southern杂交6.杂交结果的检测34提取DNA限制性内切酶消化琼脂糖凝胶电泳碱变性转移到NC膜，高温烘烤与DNA或RNA探针杂交放射自显影Southernblottinghybridization预杂交提取DNA限制性内切酶消化琼脂糖凝胶电泳碱变性转移到NC膜，高温烘烤与DNA或RNA探针杂交放射自显影预杂交35带有DNA片段的凝胶DNA分子限制片段限制性酶切割琼脂糖电泳转膜杂交、显影凝胶滤膜(尼龙膜/硝酸纤维素膜)吸附有DNA片段的膜Southern印迹杂交的技术流程胶内变性36细胞组织化学试剂裂解细胞匀浆器研磨破碎组织中的细胞蛋白酶、RNA酶消化大部分蛋白质和RNA酚/氯仿除去残余蛋白质DNA（100kb±）乙醇1.待测核酸样品的制备37部分消化充分消化限制酶消化EEEEEEHHDNA片段：（最长的DNA片段控制在大约2kb）3820001000500250100750121：DNAmarkerDL2,0002：实验组（EcoRI）0.8~1％非变性琼脂糖凝胶2.待测DNA样品的电泳分离39碱变性：DNA原位变性，形成单链分子，以便进行分子杂交。酸中和：凝胶pH值恢复中性，以便DNA片段转移。3.凝胶中核酸的变性40转移后，各个DNA片段在膜上的相对位置与在凝胶中的相对位置仍然一样，因而称为印迹（blot）。琼脂糖凝胶硝酸纤维素膜印迹（blot）注意：做好方向标记4.Southern转膜41

Southern转膜毛细转移真空转移电转移42

（250-500g）毛细管虹吸印迹法434445预杂交：目的是将膜上所有能与DNA结合的位点全部封闭，降低本底，使背景清晰干净。甲酰胺20×SSCDenhardt氏溶液鲑精DNASDS杂交：预杂交液+探针DNA6.Southern杂交预杂交液5.探针的制备46预杂交prehybridization概念：为了减少探针与广泛存在的非互补核酸的非特异性结合，在杂交前用封闭物将这些非特异性位点封闭。这一杂交前的处理过程称为预杂交。常用的封闭物：（1）变性的非特异性DNA:如鲑鱼精DNA、小牛胸腺DNA，又称为覆盖DNA。（2）高分子化合物：Denhardt溶液，包括聚乙烯吡咯酮、小牛血清白蛋白、聚蔗糖400、脱脂奶粉47洗膜：高低1×SSC:Na+浓度0.2mol/L2×SSC:Na+浓度0.4mol/L0.2×SSC:Na+浓度0.04mol/L0.1×SSC:Na+浓度0.02mol/LNa+浓度48

X-ray片杂交膜放射自显影7.杂交结果的检测非放射性杂化分子的检测49分子杂交实验①②③50DNA分子杂交的应用:

可进行DNA片段的定位和分子量的测定

可用于基因的酶切图谱分析、基因突变分析

可用于检出特异的DNA片段

可用于基因文库和cDNA文库的筛选51525253Southern杂交的应用

检测某一基因的大小、拷贝数、酶切图谱和它在染色体中的位置；检测基因点突变53pancreaskidneyskeletalliverlungplacentabrainheartmuscleGEFmRNASouthernblottinghybridization54

是指待测RNA样品经电泳分离后转移到固相支持物上，然后与标记的核酸探针进行固-液相杂交，检测RNA（mRNA）的方法。（二）NorthernBlot样品是RNA。电泳前，不酶切。电泳前，样品变性。电泳过程中，样品保持变性状态。电泳后，样品不再变性，直接转膜。需要特别注意防止RNA被降解。所有器皿都要进行处理，尽可能除尽RNA酶。5556

Northern印迹杂交流程图Northern印迹杂交56Northernblottinghybridization检测靶分子为RNARNA极易被RNase降解RNA酶抑制剂0.1%DEPC处理水(焦碳酸二乙酯)57与Southern

blotting

hybridization不同之处：不需要限制性核酸内切酶酶切。变性方法不是碱变性，而是采用聚乙二醛和二甲基亚砜、甲醛、甲基氢氧化汞等方法。应用：检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平。比较不同组织或细胞的同一基因的表达情况。Northernblottinghybridization5859（三）Western印迹（Westernblot）又称免疫印迹（immunoblotting），常用的蛋白质检测技术。将聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白区带转到膜上，通过免疫反应，检测能与可以抗体结合的蛋白质。操作程序：蛋白质样品制备→SDS分离→蛋白质的电转移（印迹）→靶蛋白与抗体（一抗与二抗）的结合→显色、分析。59蛋白质样品聚丙烯酰胺凝胶电泳样品marker转膜滤纸滤纸膜凝胶缓冲液转移膜样品marker一抗样品marker二抗样品marker荧光显色剂X胶片曝光样品markerX胶片对照marker的大小位置，分析目的信号。转移膜转移膜Western印迹的基本过程6061Hours04816

WesternblotanalysisofthecleavageofCaspase-3IM9/Bcl-2Cellsweretreatedwith20

Mofgossypolfor4,8and16h.Aftertreatment,cellswereharvestedandlysedinlysisbuffer.50ugofproteinwasloadedineachlaneandtheexpressionofactinwasdetectedasaloadingcontrol.

Western印迹检测蛋白水平61三种印迹技术的比较SouthernblotNorthernblotWesternblot62

将RNA或DNA变性后直接点样于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，再采用特定的探针进行杂交，这种杂交方法称为斑点杂交（dotblotting）或狭缝杂交（slotblotting）。三、斑点及狭缝杂交63多孔过滤加样器加样板支撑板抽真空板接真空泵印迹为圆形的，称为斑点印迹印迹为线状的，称为狭缝印迹64正常对照组实验组1实验组2实验组3用于特定基因表达的定性及定量研究用于基因突变的分析65标记探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交并对其进行检测的一种方法称原位杂交。四、原位杂交

（insituhybridization）检测基因在细胞内的表达与定位检测染色体中特定基因的位置等可用于基因克隆筛选的菌落原位杂交(裂菌)66基本步骤：原位杂交分为：组织、细胞的固定预处理预杂交、杂交杂交结果检测细胞内原位杂交和组织切片原位杂交（10％甲醛等）（蛋白酶、SDS、TritonX-100）（核素和非核素标记探针）67菌落原位杂交68杂交类型检测目的及范围Southern印迹杂交检测经凝胶电泳分离且转移至膜上的DNA分子Northern印迹杂交检测经凝胶电泳分离且转移至膜上的RNA分子Westernblot检测经凝胶电泳分离固定在膜上的蛋白质分子原位杂交检测细胞或组织中的DNA或RNA分子生物芯片批量检测细胞或组织样品中的蛋白质69第三节生物芯片技术70生物芯片生物芯片（biochip）是近年来在生命科学领域中迅速发展起来的一项高新技术，主要是指通过微加工技术和微电子技术在固体芯片表面构建的微型生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、DNA及其他生物组分的准确、快速与大信息量的检测。71DNA芯片

蛋白质芯片

其它芯片生物芯片包括：按用途分：-样品制备芯片

-生化反应芯片-检测芯片72是指将许多特定的DNA片段有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上，然后与待测的荧光标记样品进行杂交，杂交后用荧光检测系统等对芯片进行扫描，通过计算机系统对每一位点的荧光信号做出检测、比较和分析，从而迅速得出定性和定量的结果。该技术亦被称作DNA微阵列(DNAmicroarray)。一、基因芯片基因芯片(genechip)73基因芯片(genechip)

Cy3Cy574许多特定的DNA片段或cDNA片段作为探针Cy3Cy57576是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。二、蛋白质芯片蛋白质分子间的亲和反应蛋白质芯片(proteinchip)蛋白质芯片作用原理77蛋白质芯片(proteinchip)抗原芯片原理图78第四节探针的制备与标记79核酸探针（probe）：

探针是指带有检测标记的，能与被检测核苷酸片段互补的一段已知核苷酸片段。cDNA探针基因组DNA探针寡核苷酸探针RNA探针探针的种类：80一、合成寡核苷酸探针注意原则(1)长度（10-50bp);(2)G:C对含量40%-60%；(3)探针内避免互补；(4)避免同一碱基连续出现；(5)与非靶序列有70%以上同源性或连续8个以上碱基序列相同，最好不用。81(1)标记前后探针基本结构、化学性质相同;(2)特异性强、本底低、重复性好；(3)操作简单、节时；(4)安全、无环境污染。二、标记物1、

一个理想的标记物应满足：822、标记物的种类32P、35S、3H、125I等半抗原：生物素（biotin）、地高辛（Dig）荧光素：异硫氰酸荧光素（FITC）、罗丹明等酶：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等化学发光探针非核素标记物核素标记物83体内标记体外标记化学法酶法三、标记方法缺口平移法随机引物标记法PCR标记法末端标记法84利用标记物分子上的活性基团与探针分子上的基团（如磷酸基团）发生的化学反应将标记物直接结合到探针分子上。化学法：多聚体乙撑亚胺聚苯醌酶（如HRP）交联多聚体乙撑亚胺酶DNA戊二醛交联85酶法：OH5'5'3'

32P-dATP生物素-dUTPorNTP地高辛-dUTPorNTP

荧光素-dNTP86DNaseI5'5'3'3'5