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文档简介

丙型肝炎病毒(HCV)核酸定量检测标准操作规程(PCR-荧光探针法)1.目的:规范HCV-RNA(PCR)检测操作流程,保证检测结果的准确性。2.应用范围:HCV-RNA荧光定量检测。3.职责:3.1文件编写:实验室技术员。3.2文件审核:实验室主管。3.3文件审批:实验室主任。3.4执行:PCR实验室所有工作人员。4.参考文献:4.1中山大学达安基因股份有限公司丙型肝炎病毒核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)说明书。4.2中山大学达安基因股份有限公司核酸扩增荧光检测系统DA7600型使用说明书。5.内容:5.1检测方法:PCR-荧光探针法5.2实验原理:用一对丙型肝炎病毒特异性引物和一条丙型肝炎病毒特异性荧光探针,配以逆转录液、逆转录酶、PCR反应液、耐热DNA聚合酶(Taq酶)、四种核苷酸单体(dNTPs)等成分,先将RNA逆转录成cDNA,再通过PCR体外扩增法,即高温变性、低温退火、适温延伸进行DNA扩增,并对PCR全过程进行实时监测,从而检测丙型肝炎病毒RNA。主要用于HCV病毒感染的辅助诊断及其疗效监测的标准。5.3性能参数:5.3.1精密度:检测下限为1.0x103copies/ml。5.3.2线性范围:1.0x103~1.0x108copies/ml。5.4标本采集:5.4.1使用标本类型:血清。5.4.2标本采集:由合作单位按照以下要求进行采集,采集后及时分离出血清在2~8℃条件下保存。用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2ml,注入无菌的干燥玻璃管,室温(22~25℃)放置30~60min,全血标本可自发完全凝集析出血清,或直接使用水平离心机,1500rpm离心5min;吸取上层血清,转移至1.5ml灭菌离心管。5.4.3标本保存和运送:分离后的血清在2~8℃条件下保存应不超过72小时,-20℃可保存1个月,要长期保存的需分装后储存于-70℃。应避免反复冻融。标本运送采用0℃冰壶。5.4.4标本拒收标准:污染、严重溶血、脂血类或肝素抗凝剂标本。5.5设备和试剂:5.5.1设备:DA7600荧光定量PCR仪、低速水平离心机、生物安全柜、台式高速离心机、移液器、混匀器、干式恒温器、冰箱(4℃、-20℃)、移动/固定紫外灯、冷冻离心机。5.5.2试剂:5.5.2.1试剂品牌:中山大学达安基因股份有限公司丙型肝炎病毒核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)5.5.2.2试剂批准文号:国药准字2014第3400033号。5.5.2.3试剂组成:组分名称规格数量主要成分核酸提取试剂RNA提取液A200μL/管1二氧化硅、DEPC水RNA提取液B5mL/管2GuSCN、Tris-HCL、EDTA、Triton-100DEPCH2O3ml/瓶1DEPCPCR扩增试剂HCV内标溶液100μL/管1含内标片段的病毒样颗粒及稳定剂HCV反应液A270μL/管1引物、探针、Tris盐酸BufferHCV反应液B30μL/管1Taq酶、逆转录酶、RNasin质控品阴性质控品200μL/管1阴性血浆HCV强阳性质控品200μL/管1HCV阳性血浆HCV临界阳性质控品200μL/管1HCV阳性血浆5.5.2.4试剂保存和有效期:保存于-20±5℃;有效期9个月。5.5.2.6配套提取试剂盒组成:组分名称规格数量离心柱20个/包1收集管80个/包1裂解液4.4ml/瓶1抑制物去除液(浓缩液)7ml/瓶1去离子液(浓缩液)4.4ml/瓶1洗脱液3ml/瓶1蛋白酶K(干粉)22mg/瓶1CarrierRNA(干粉)155ug/管15.5.2.7自备试剂:无水乙醇5.6操作过程:待测样本、阳性质控品、阴性质控品同步处理。5.6.1实验前准备:5.6.1.1抑制物去除液(浓缩液)中加入4.3ml的无水乙醇,并在管盖及管壁上打勾。室温保存。5.6.1.2去离子液(浓缩液)中加入17.6ml的无水乙醇,并在管盖及管壁上打勾。室温保存。5.6.1.3蛋白酶K(干粉)中加入1.1ml的洗脱液,充分混匀,溶解。-20℃保存。5.6.1.4CarrierRNA(干粉)中加入110ul的洗脱液或内标溶液(PCR试剂盒中成分),充分混匀,溶解。-20℃保存。5.6.1.5配制CarrierRNA-裂解工作液(现配现用)1人份20人份裂解液200ul4mlCarrierRNA4ul80ul5.6.2RNA提取:5.6.2.1在1.5ml的无菌离心管中加入50ul的蛋白酶K;5.6.2.2取200ul样本加入离心管中;5.6.2.3再加入200ul的裂解工作液(即已含CarrierRNA的裂解液),盖紧管盖,漩涡震荡15秒以充分混匀,高速离心10秒(防止温育是产生气泡),72℃10分钟;同时将洗脱液置于72℃预热。5.6.2.4加入250ul无水乙醇,盖紧管盖。漩涡震荡15秒。5.6.2.5将混合液全部吸至离心柱,室温下12000g离心1分钟,将离心柱转至新的收集管;5.6.2.6将500ul的抑制物去除液加入离心柱,室温下12000g离心1分钟,将离心柱转至新的收集管;5.6.2.7将500ul的去离子液加入离心柱,室温下12000g离心1分钟,将离心柱转至新的收集管;5.6.2.8重复上一步操作一次;5.6.2.9将离心柱-收集管于室温下14000g离心3分钟以除去残留的乙醇;5.6.2.10将离心柱取出,放入新的1.5ml离心管。打开离心柱盖子,72℃放置2分钟(使用干式恒温器,不能使用水浴锅);5.6.2.11在离心柱的膜上方小心加入72℃预热的洗脱液50ul,盖紧管盖,室温静置1分钟后,14000g离心1分钟。离心管内即为核酸溶液,立即使用或放于-20℃备用。5.6.3排版:根据样本数量编写《PCR实验室DA-7600取试剂、加样、扩增对照图面版表》,注意添加阴性质控,阳性质控。5.6.4加样:5.6.4.1配制HCV单人份扩增体系:取N个(N=待检样本个数+阴性质控平+阳性质控品)PCR反应管,按下表进行配制:组分HCV反应液AHCV反应液B总体积用量27ul3ul30ul将各组分充分混匀,混合好后进行短时离心将管壁上的液体全部离心至管底,之后将30ul扩增体系分装到PCR反应管管中。5.6.4.2根据排版,往上述PCR反应管中加入对应的样本核酸各20ul。盖紧管盖,瞬时离心后上机进行扩增。5.6.5DA7600的设置及结果分析:参见《达安7600荧光定量PCR仪操作、校准及保养规程》及《基因扩增检测及结果分析规程》。5.6.6记录实验数据。5.6.7取出结束后扩增仪内扩增产物需用一次性手套包好、封口后,丢入医疗废物垃圾桶内,以防止扩增管破裂而导致污染。5.6.8关闭扩增仪电源和计算机电源。5.7注意事项:5.7.1PCR荧光检测法比较容易受污染,所以实验过程中应避免反复开盖,所用耗材均需高压灭菌。5.7.2RNA提取步骤建议冰上操作。吸取血清时注意勿带入红细胞。5.7.3试剂使用前要完全解冻,但应避免反复冻融。5.7.4RNA提取液A必须充分混匀后吸取,RNA提取液B需溶解混匀后使用。5.7.5逆转录成cDNA后,需马上进行下一步实验,否则须转移上清至灭菌离心管,保存于-20℃待用。5.8安全防护措施:5.8.1试剂处理:5.8.1.1使用或更换试剂时,务必戴手套;不要用身体直接接触试剂,以免损伤皮肤。5.8.1.2如果皮肤接触了试剂,立即用大量清水冲洗并消毒。5.8.1.3如果眼睛接触了试剂,立即用喷淋器冲洗,并紧急就医。5.8.2仪器使用:5.8.2.1仪器运转中不要触摸加样机构、试剂分注机构、搅拌机构、反应容器清洗机构等可动部分。5.8.2.2仪器通电时不能打开仪器上面、背面、侧面的盖板,不能触摸光源灯的玻璃面。5.8.3生物安全防护:参见《生物安全防护手册》6.相关记录表格:6.1LAB-SOP-PCR-005-T01-001《PCR实验室实验、交接班记录表》6.2LAB-SOP-PCR-015-T01-001《PCR实验室迟发报告登记表》6.3LAB-SOP-PCR-014-T01-001《PCR实验室不合格标本登记表》6.4LAB-SOP-PCR-025-T01-001《PCR实验室DA-7600取试剂、加样、扩增对照图面版表》本SOP文件颁发部门:质管部本SO

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