DB37T 3129.1-2018 鸭细小病毒感染诊断技术 第1部分：病毒分离鉴定　

DB37/T3129.1—2018鸭细小病毒感染诊断技术第1部分：病毒2018-02-02发布2018-03-02实施IDB37/T3129.1—2018本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东农业大学。本标准起草人：刁有祥、陈浩、唐熠、杨晶。1DB37/T3129.1—2018鸭细小病毒感染诊断技术第1部分：病毒分离鉴定本标准规定了鸭细小病毒样品的采集与保存、病毒的分离和鉴定等的技术要求。本标准所规定的鸭细小病毒分离鉴定和PCR检测方法适用于鸭组织、分泌物、排泄物和病毒培养物2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫3术语和定义3.1也称新型鹅细小病毒，是引起鸭短喙侏儒综合征的病原，该病以生长障碍，短喙、舌外露为特征。3.2用对应某一种抗原的抗体(这里被称为一抗)与细胞孵育结合，在采用对应一抗(也就是抗一抗)的抗体(这里被称为二抗，二抗上偶联有荧光素分子)与细胞孵育结合后在荧光显微镜下观察，出现绿色荧光3.3原代鸭胚肝细胞Duckembryolivercell(DEL)采用胰酶消化法，用15日龄~20日龄SPF鸭胚肝脏制备的原代细胞。4实验室质量控制2DB37/T3129.1—2018则，避免交叉污染。4.3注意个人防护和环境保护，电泳中用到的EB可诱发基因突变，试验中被EB污染的物品要有专用收集处，并通过适当的方式(如焚烧、或送有资质的医用垃圾处理公司)进行无害化处理。垃圾处理公司做最终处理。4.5人员熟悉生物样品处理、细胞培养、以及核酸提取、基因扩增等分子生物学技术。b)PCR仪；c)CO₂恒温培养箱(37℃恒温);d)台式低温高速离心机(最大转速12000r/min);f)电泳槽；h)2°C～8°C冰箱；j)微量移液器(最大量程分别为10μL、20μL、100μL、1000μL),带滤芯的枪头；k)孵化器(37℃恒温);d)dNTPs(2.5mmol/L);h)核酸电泳加样缓冲液，见A.4;i)DNA分子量标准，要求在100bp～2000bp之间，有5条以上的指示条带；3DB37/T3129.1—2018n)细胞培养液(含10%胎牛血清的o)兔抗鸭细小病毒多克隆抗体；p)细胞维持液(含1%胎牛血清的q)SPF鸭胚；扩增目的片段长度为661bp;引物浓度均为50μmol/L。5样品的采集和处理5.1样品的采集采集死亡鸭肝脏、脾和脑等组织，分别处理或混合后进行处理；若是活鸭，则采集泄殖腔拭子。样品置于在密闭容器中冷藏运输，储藏温度不超过4℃,时间不超过24h。5.2样品的保存5.2.1室温条件下样品在1h~2h内处理完毕，未能及时处理的样本在4℃冰箱中存放，不超过24h;也可于-20℃低温条件下保存，不超过30d;-70℃贮存最佳，不超过1年。5.2.2组织研磨液和泄殖腔拭子悬液置于-20℃低温条件下保存，不超过2周；-70℃贮存不超过30d。5.3样品的处理5.3.1在生物安全柜中，取10g~20g样品放入灭菌的研钵中，无菌条件下磨碎。5.3.2用含有抗生素(青霉素(2000IU/mL)、链霉素(2mg/mL)、庆大霉素(50μg/mL)和制霉菌素(1000IU/mL))等渗磷酸盐缓冲液(PBS,pH值7.0~7.4,附录A.1)配成10%～20%(g/mL)的悬液；泄殖腔拭子悬液中抗生素浓度提高5倍。加入抗生素后pH调至7.0～7.4。5.3.3样本组织悬液反复冻融3次，经8000r/min离心10min,取上清并置4℃过夜，次日接种SPF鸭胚或原代鸭胚肝细胞。6病毒分离6.1鸭胚接种6.1.1将处理后的样品上清，每份尿囊腔接种9日龄~11日龄SPF鸭胚3枚~5枚，0.2mL/胚，37℃孵化120h。6.1.2弃去24h内死亡胚，24h~120h内死亡和存活鸭胚置4℃冰箱过夜或-20℃冷冻1h,分别无菌收集尿囊液并进行无菌检查，无菌尿囊液盲传三代。6.2细胞接种6.2.1将处理后的样品上清接种80%生长状况良好的单层原代鸭胚肝细胞，5%CO₂、37℃孵育1h,吸弃上清，用PBS缓冲液轻轻洗涤2次，吸弃后加入细胞维持液。6.2.2当70%以上单层细胞出现细胞病变时，将细胞培养物冻融后，转移至2mL冻存管置于-70℃保存，不超过3年。4DB37/T3129.1—20187病毒鉴定7.1间接免疫荧光法(IFA)取接种病毒60h的鸭胚肝细胞(24孔细胞培养板),用PBS缓冲液轻轻洗涤3次～4次，吸弃液体。加入预冷(-20℃)的甲醇：丙酮(1:1)固定液150μL/孔没过单层细胞，置于-20℃固定10min,吸于湿盒中37℃孵育1h。吸弃后用PBS洗涤3次。加入1:200(抗体稀释液PBST)稀释的FITC标记鼠抗兔抗体(100μL/孔),置于湿盒中4℃孵育1h。加入数滴50%甘油盐水封片(见附录B.2),置于倒置荧光显微镜下，观察是否有绿色荧光信号。7.2PCR检测7.2.1DNA提取7.2.2PCR反应7.2.2.3PCR反应条件：94℃预变性5min;94℃30s、58℃45s、72℃30s,进行30个循环，7.2.3PCR产物电泳7.2.3.1取9μL样品与1μL核酸电泳加样缓冲液混匀后，于1.5%琼脂糖凝胶中电泳，在位于凝胶7.2.3.2加样后，按照5V/cm电压，电泳20min~40min,当加样缓冲液中溴酚蓝电泳过半至凝胶下2/5处时，可停止电泳。7.2.3.3置于凝胶成像仪下观察，根据分子量标准判8结果判定8.1鸭胚肝细胞感染鸭细小病毒，细胞轻微聚集，IFA检测出现绿色荧光信号。当阳性对照IFA检测5DB37/T3129.1—2018结果无效，不能进行判断。8.4在阳性对照出现目的扩增条带，阴性对照无条带出现(引物二聚体除外)时，试验成立。PCR检测结果为阳性表明样品中存在鸭细小病毒，检测结果为阴性时表明样品中不存在鸭细小病毒，见资料性6DB37/T3129.1—2018试剂类型试剂含量琼脂糖0.5×TAE电泳缓冲液加至微波炉中完全融化，待冷至50℃~60℃时加入溴化乙锭(EB)溶液5μL,摇匀。倒入电泳板上，A.2.1配制0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na₂)溶液(pH8.0)试剂类型试剂含量乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na₂·2H₂O)灭菌双蒸水80.0mL氢氧化钠调pH至灭菌双蒸水加至用于配制A.2.2中的50×TAE电泳缓冲液A.2.2配制50×TAE电泳缓冲液试剂类型试剂含量羟基甲基氨基甲烷(Tris)冰醋酸EDTA-Na2溶液(pH8.0)灭菌双蒸水加至用于配制A.2.3中的1×TAEA.2.3配制1×TAE电泳缓冲液试剂类型试剂含量50×TAE电泳缓冲液灭菌双蒸水加至试剂类型试剂含量溴化乙锭灭菌双蒸水加至7DB37/T3129.1—2018试剂类型试剂含量聚蔗糖溴酚蓝0.1g二甲苯青0.1g灭菌双蒸水8DB37/T3129.1—2018(资料性附录)试剂类型试剂含量双蒸馏水加至B.250%甘油盐水试剂类型试剂含量甘油NaCl蒸馏水加至B.3试剂类型试剂含量吐