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文档简介
赋予生物新的遗传特性的基因工程课
时2目
录重点1基因工程和蛋白质工程PCR技术及应用重点2知识盘查曾经这样考重点1
基因工程和蛋白质工程还会这样考1.归纳基因工程的基本工具提醒若用不同的限制酶切割出不同的黏性末端,则能使目的基因和载体定向连接,避免自身环化和反向连接,提高连接的有效性。细胞和细胞产物磷酸二酯黏性磷酸二酯黏性2.理解掌握基因工程的操作步骤 (1)目的基因的筛选与获取基因文库PCR逆转录(2)基因表达载体的构建——重组质粒的构建RNA聚合酶提醒①启动子和终止子:启动子(DNA片段)≠起始密码子(位于mRNA上);终止子(DNA片段)≠终止密码子(位于mRNA)上。②目的基因插入位置:启动子与终止子之间。③利用乳腺生物反应器生产药物时,应将目的基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起。(3)将目的基因导入受体细胞农杆菌转化法显微注射法(4)目的基因的检测与鉴定提醒PCR技术不仅可用于获取和扩增目的基因,还能用于检测受体细胞中是否含有目的基因或受体细胞中的目的基因是否转录出mRNA。抗原—抗体杂交抗性接种实验3.图示法解读蛋白质工程基因合成
新的蛋白质蛋白质结构
脱氧核苷酸序列1.(2023·新课标卷,6)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具,将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接,以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。C下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是(
)A.质粒和目的基因都用酶3切割,用E.coliDNA连接酶连接B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割,用T4DNA连接酶连接C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割,用T4DNA连接酶连接D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割,用E.coliDNA连接酶连接解析酶3切割后得到的是平末端,应该用T4DNA连接酶连接,A不符合题意;质粒用酶3切割后得到平末端,目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端,二者不能连接,B不符合题意;质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端,用T4DNA连接酶连接,还能保证目的基因在质粒上的连接方向,此重组表达载体的构建方案最合理且高效,C符合题意;若用酶2和酶4切割质粒和目的基因,会破坏质粒上的抗生素抗性基因,连接形成的基因表达载体缺少标记基因,无法进行后续的筛选,D不符合题意。A2.(2024·江西卷,12)γ-氨基丁酸在医药等领域有重要的应用价值。利用L-谷氨酸脱羧酶(GadB)催化L-谷氨酸脱羧是高效生产γ-氨基丁酸的重要途径之一。研究人员采用如下图方法将酿酒酵母S的L-谷氨酸脱羧酶基因(gadB)导入生产菌株E.coliA,构建了以L-谷氨酸钠为底物高效生产γ-氨基丁酸的菌株E.coliB。下列叙述正确的是(
)A.图中表明,可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadBB.E.coliB发酵生产γ-氨基丁酸时,L-谷氨酸钠的作用是供能C.E.coliA和E.coliB都能高效降解γ-氨基丁酸D.可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒解析分析题意,可以从酿酒酵母S中筛选、分离出目的基因gadB,然后利用PCR扩增目的基因,A正确;由题意知,L-谷氨酸钠是生产γ-氨基丁酸的底物,不能用来供能,B错误;将目的基因(gadB)导入菌株E.coliA构建高效生产γ-氨基丁酸的菌株E.coliB,E.coliA和E.coliB均不能高效降解γ-氨基丁酸,C错误;根据题干提供的信息,无法推断出是否有其他酶能够替代NcoⅠ和KpnⅠ,D错误。B3.(2023·重庆卷,12)某小组通过PCR(假设引物长度为8个碱基,短于实际长度)获得了含有目的基因的DNA片段,并用限制酶进行酶切(如下图),再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是(
)A.实验所用引物,其中一个序列为5′-TGCGCAGT-3′B.步骤①所用酶是SpeⅠ和CfoⅠC.用步骤①的酶对载体进行酶切至少获得了2个片段D.酶切片段和载体连接时可使用E.coliDNA连接酶或T4DNA连接酶解析根据扩增所得DNA片段可知,实验所用的两种引物序列为5′-TGCGCAGT-3′和5′-AGCTAGCA-3′,A正确;根据酶切后得到的黏性末端判断,步骤①所用酶是NheⅠ和CfoⅠ,B错误;步骤①用两种酶切割载体(质粒),质粒上至少有两个切口,至少产生2个片段,C正确;目的基因片段和质粒经酶切后产生的均为黏性末端,可用E.coliDNA连接酶或T4DNA连接酶连接,D正确。4.(2024·新课标卷,35)某研究小组将纤维素酶基因(N)插入某种细菌(B1)的基因组中,构建高效降解纤维素的菌株(B2)。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段;再经限制酶切割获得含N基因的片段甲,片段甲两端分别为M1与M2;利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组,得到菌株B2。酶切位点(Ⅰ~Ⅳ)、引物(P1~P4)的结合位置、片段甲替换区如下图所示,→表示引物5′→3′方向。回答下列问题。(1)限制酶切割的化学键是______________。为保证N基因能在菌株B2中表达,在构建片段甲时,应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间,原因是__________________________________________________________________________________________________________________________。磷酸二酯键
保证N基因启动子、N基因、N基因终止子的完整性,确保N基因能够顺利表达(2)CRISPR/Cas9技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G—C和____________________。C—G、U—A、A—T(3)用引物P1和P2进行PCR可验证片段甲插入了细菌B1基因组,所用的模板是____________________;若用该模板与引物P3和P4进行PCR,实验结果是_______________________________。菌株B2的基因组无PCR产物(4)与秸秆焚烧相比,利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是___________________________________________________________________(答出2点即可)。无空气污染;更安全,无火灾隐患;分解效率更高,高效利用秸秆资源等解析
(1)限制酶作用于DNA的磷酸二酯键。由题述可知,该过程是将重组质粒特定位点,接入M1、M2,再利用限制酶切出新的片段甲替换区(M1+启动子+N基因+终止子+M2),再接入B1基因组中,得到B2,因此在M1和M2之间,需要保证N基因完整性,同时需要保证N基因能够正常表达,因此需要把M1接入启动子之前,M2接入终止子之后。(2)根据所给信息,向导RNA需要与对应DNA进行结合,结合期间,RNA的碱基会和DNA的碱基进行互补配对,根据碱基互补配对原则配对方式包括G—C、C—G、U—A、A—T。(3)需要验证是否插入重组后的片段甲,因此所用模板为菌株B2的基因组,如果有PCR产物说明菌株B2中含有N基因,如果没有PCR产物说明菌株B2中不含N基因。因为片段甲被替换,因此在重组片段甲(M1+启动子+N基因+终止子+M2)中,没有引物P4的结合位置,因此使用引物P3、P4进行PCR时,无法获得PCR产物。(4)秸秆焚烧严重污染环境,且有很大的火灾隐患,与此同时,焚烧对于有机物中的能量是极大的浪费,可以从上述角度进行论述。例如:无空气污染;更安全,无火灾隐患;分解效率更高,高效利用秸秆资源等。D1.(2024·九省联考甘肃卷,15)胰岛素可用于治疗糖尿病,我国科学家打破国外技术垄断,研发了拥有自主知识产权的重组人胰岛素药物,下列叙述错误的是(
)A.用PCR技术扩增人胰岛素基因时,每次循环包括变性、复性、延伸三步B.构建人胰岛素基因表达载体时,需使用限制性内切核酸酶和DNA连接酶C.大肠杆菌细胞经Ca2+处理后,更容易吸收重组的人胰岛素基因表达载体D.抗原-抗体杂交法不能检测人胰岛素基因表达载体是否导入大肠杆菌细胞解析用PCR技术扩增人胰岛素基因时,扩增的过程是:目的基因DNA受热变性后解为单链,引物与单链相应互补序列结合;然后以单链DNA为模板,在DNA聚合酶作用下进行延伸,即将4种脱氧核苷酸加到引物的3′端,如此重复循环多次。每次循环一般可以分为变性、复性和延伸三步,A正确;在构建人胰岛素基因表达载体时,首先用一定的限制性内切核酸酶切割含有目的基因的DNA片段和载体,再利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处,这样就形成了一个重组DNA分子,B正确;大肠杆菌细胞经Ca2+处理后,细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,更容易吸收重组的人胰岛素基因表达载体,C正确;抗原-抗体杂交法可以检测人胰岛素基因是否在大肠杆菌中翻译成胰岛素,若抗原-抗体杂交结果为阳性,说明人胰岛素基因在大肠杆菌中表达,则可以说明人胰岛素基因表达载体导入了大肠杆菌细胞中,D错误。2.(2024·重庆市质量检测)烟草是我国一些地区的经济作物之一,提高烟草质量有利于提高经济收入。我国科研团队研究了一种转基因抗盐烟草新品种,抗盐基因的结构和获得转基因抗盐烟草新品种的过程(①~⑤)如图所示。回答下列问题:(1)获得转基因抗盐烟草新品种过程中利用的生物技术有______________________________________________________(答出2项)等。(2)为确保目的基因定向插入质粒,应该选择限制酶________________切割含目的基因的DNA和质粒。在培养基中加入____________(填“氨苄青霉素”或“四环素”)以便于重组DNA分子的筛选。基因工程技术(或重组DNA技术)、植物组织培养技术HindⅢ和SalⅠ氨苄青霉素(3)培育转基因抗盐烟草新品种的核心工作是图中过程________(填序号)。过程②③采用的方法是______________。(4)过程⑤需要用到_______________________等植物激素,在诱导愈伤组织分化成幼苗的过程中,这两种植物激素的比例会发生变化,原因是____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。①农杆菌转化法生长素、细胞分裂素诱导愈伤组织分化成幼苗的过程中,需要诱导生成根、芽等不同组织,而当生长素用量与细胞分裂素用量的比值大时有利于根的分化,当生长素用量与细胞分裂素用量的比值小时有利于芽的分化解析
(1)①~③过程中利用了基因工程技术,烟草细胞→愈伤组织→转基因抗盐烟草幼苗的过程中利用了植物组织培养技术。因此,获得转基因抗盐烟草新品种过程中利用的生物技术有基因工程技术、植物组织培养技术等。(2)抗盐基因(目的基因)中含有限制酶BamHⅠ的切割位点,若用限制酶BamHⅠ切割含抗盐基因的DNA,则会破坏抗盐基因,因此不能用限制酶BamHⅠ切割含抗盐基因的DNA;抗盐基因两端含有限制酶Sal
Ⅰ的切割位点,质粒上也含有限制酶Sal
Ⅰ的切割位点,若用限制酶Sal
Ⅰ切割含抗盐基因的DNA和质粒,然后用DNA连接酶连接,则可能会造成质粒和抗盐基因自身环化,或者使抗盐基因在质粒中反向连接。因此应该用两种限制酶切割含抗盐基因的DNA和质粒,经分析可知,可用限制酶HindⅢ、Sal
Ⅰ切割含目的基因(抗盐基因)的DNA和质粒,以确保目的基因定向插入质粒。由于用限制酶HindⅢ、Sal
Ⅰ切割质粒时,破坏了四环素抗性基因,而氨苄青霉素抗性基因没有被破坏,因此应在培养基中加入氨苄青霉素,以便于重组DNA分子的筛选。(3)基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建,即图中过程①。过程②③采用的方法是农杆菌转化法。(4)过程⑤是再分化,需要用到生长素、细胞分裂素等植物激素。在诱导愈伤组织分化成幼苗的过程中,这两种植物激素的比例会发生变化,这是因为诱导愈伤组织分化成幼苗的过程中,需要诱导生成根、芽等不同组织,而当生长素用量与细胞分裂素用量的比值大时有利于根的分化,当生长素用量与细胞分裂素用量的比值小时有利于芽的分化。3.(2024·湖南雅礼中学调研)金属硫蛋白(MT)是一类低分子量、富含半胱氨酸、具有金属结合能力的普遍存在于生物体内的金属结合蛋白,具有多种生物学功能。近年来,因其与Zn、Cu、Cd等金属的结合能力较强而用于生态修复。科研人员成功地将人MT蛋白基因用农杆菌转化法转入番茄,成功培育转基因番茄。回答下列问题:注:T-DNA中标出的启动子在真核细胞中表达。(1)感受态农杆菌的制备:取保存的农杆菌菌落用________接种于相应的液体培养基中,并置于________中进行振荡培养,完成菌种的活化和扩大培养;取适量菌液置于CaCl2溶液中处理,制得感受态农杆菌。(2)目的基因的获取和转化:取人肝脏细胞,破碎后提取mRNA,在逆转录酶的作用下形成cDNA,经PCR扩增后的产物与Ti质粒连接形成重组质粒(如图),将其与制备好的感受态农杆菌混合,使外源DNA转入细胞;经适宜条件培养一段时间,再加入适宜浓度的________筛选出转化的农杆菌。接种环摇床卡那霉素(3)转化番茄:取番茄子叶进行__________(填“消毒”或“灭菌”)处理后切段,再与转化的农杆菌菌液进行共培养,一段时间后,取出子叶放在________上吸取多余菌液,再将子叶放在适宜的以___________培养基为基础配制的培养基中进行培养。(4)育成转基因番茄:取上述处理的番茄子叶先经________过程形成愈伤组织,将愈伤组织接种到含有特定激素的培养基上,就可以诱导其________成胚状体,长出________,进而发育成完整的番茄植株。消毒无菌滤纸MS脱分化再分化芽和根(5)转基因番茄性状的检测和生产应用:为了检测番茄中是否成功导入目的基因,可依据________________________设计引物进行PCR扩增,再用凝胶电泳技术进行检测,进行此实验的同时应以__________________________作为阴性对照,以导入Ti质粒的番茄作为阳性对照;已知某转基因番茄植株能大量吸收Zn、Cd等,且这些金属元素主要富集在根,生产应用时需对其定期拔除并实施无害处理,原因是__________________________________________________________________________________________________________________________(答出2点即可)。T-DNA片段的(部分)序列未导入Ti质粒的野生型番茄
避免死亡后根等遗体被分解,Zn、Cd等再度返回土壤,造成二次污染;及时拔除植物后,可缓解Zn、Cd等随食物链不断富集的危害解析
(1)取保存的农杆菌菌落用接种环接种于相应的液体培养基中,并置于摇床中进行振荡培养,使其大量繁殖;取适量菌液置于CaCl2溶液中处理,制得感受态农杆菌。(2)由图可知,载体上含有卡那霉素抗性基因和潮霉素抗性基因,但能在农杆菌中表达的是卡那霉素抗性基因,因此,经适宜条件培养一段时间,再加入适宜浓度的卡那霉素筛选出转化的农杆菌。(3)取番茄子叶进行消毒处理,其目的是防止杂菌污染,而后切段,再与转化的农杆菌菌液进行共培养,一段时间后,取出子叶放在无菌滤纸上吸取多余菌液,再将子叶放在适宜的以MS培养基为基础配制的培养基中进行培养,以便获得无菌的外植体。(4)取上述处理的番茄子叶先经脱分化过程形成愈伤组织,再在特定培养基上培养,以诱导其再分化为胚状体,长出芽和根,最后发育成完整的番茄植株。(5)为了检测番茄中是否成功导入目的基因,可依据T-DNA片段的部分序列设计引物进行PCR扩增,再用凝胶电泳技术进行检测,进行此实验的同时应以未导入Ti质粒的野生型番茄作为阴性对照,以导入Ti质粒的番茄作为阳性对照。已知某转基因番茄植株能大量吸收Zn、Cd等,且这些金属元素主要富集在根,生产应用时需对其定期拔除并实施无害处理,这样可以避免死亡后根等遗体被分解,这些元素再度返回土壤,造成二次污染;同时及时拔除植物后,能缓解Zn、Cd等随食物链不断富集的危害。4.(2024·湖南卷,21)百合具有观赏、食用和药用等多种价值,科研人员对其进行了多种育种技术研究。回答下列问题:(1)体细胞杂交育种。进行不同种百合体细胞杂交前,先用__________________去除细胞壁获得原生质体,使原生质体融合,得到杂种细胞后,继续培养,常用____________________(填植物激素名称)诱导愈伤组织形成和分化,获得完整的杂种植株。纤维素酶和果胶酶生长素和细胞分裂素(2)单倍体育种。常用___________________________的方法来获得单倍体植株,鉴定百合单倍体植株的方法是______________________________________________________________________________________________________________。花药(或花粉)离体培养
利用显微镜观察根尖有丝分裂中期细胞中染色体的数目(3)基因工程育种。研究人员从野生百合中获得一个抵抗尖孢镰刀菌侵染的基因pL,该基因及其上游的启动子pL和下游的终止子结构如图a。图b是一种Ti质粒的结构示意图,其中基因gus编码GUS酶,GUS酶活性可反映启动子活性。①研究病原微生物对L的启动子pL活性的影响。从图a所示结构中获取L,首先选用__________________酶切,将其与相同限制酶酶切的Ti质粒连接,再导入烟草。随机选取3组转基因成功的烟草(P1、P2和P3)进行病原微生物胁迫,结果如图c。由此可知:三种病原微生物都能诱导pL的活性增强,其中________的诱导作用最强。HindⅢ、BamHⅠ交链格孢②现发现栽培种百合B中也有L,但其上游的启动子与野生百合不同,且抗病性弱。若要提高该百合中L的表达量,培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种,简要写出实验思路______________________________________________________________________________________________________________________。
利用转基因技术将百合B中L基因的启动子替换为野生百合中L基因的启动子pL解析
(1)因植物细胞细胞壁的成分主要是纤维素和果胶,因此获得原生质体的方法是用纤维素酶和果胶酶对植物细胞进行处理,得到原生质体后使原生质体融合,形成杂种细胞,再用生长素和细胞分裂素诱导愈伤组织形成和分化,从而获得完整的杂种植株。(2)获得单倍体植株的常用方法是花药(花粉)离体培养;鉴定百合单倍体植株的方法是利用显微镜观察根尖有丝分裂中期细胞中染色体的数目,如果染色体数目减少一半,则获得的植株为单倍体植株。(3)①根据目的片段以及质粒上限制酶的识别位点,若要获得pL并连接到质粒上,可选用限制酶HindⅢ、BamHⅠ进行酶切,以替换Ti质粒中的启动子,从而达到根据GUS酶活性反映启动子活性的目的。根据图c的结果可知,交链格孢的每一组转基因烟草中的GUS酶活性都最高可确定其诱导作用最强。②欲培育具有高抗病原微生物百合新品种,可利用转基因技术将百合B中L基因的启动子替换为野生百合中L基因的启动子pL。重点2
PCR技术及应用知识盘查曾经这样考还会这样考1.PCR技术原理与条件DNA半保留复制引物2.PCR技术的过程提醒可通过引物控制PCR扩增的基因片段,并在基因两侧引入限制酶识别序列。复性72℃TaqDNA聚合酶3.DNA的粗提取与鉴定4.DNA片段的电泳鉴定D1.(2024·安徽卷,14)下列关于“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述,错误的是(
) A.实验中如果将研磨液更换为蒸馏水,DNA提取的效率会降低 B.利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异,可初步分离DNA C.DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同,该原理可用于纯化DNA粗提物 D.将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应,可检测溶液中是否含有蛋白质杂质解析若将研磨液更换为蒸馏水,则从细胞核中释放出的DNA量会减少,从而会降低DNA提取的效率,A正确;由于DNA不溶于酒精,但某些蛋白质溶于酒精,所以利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异,可初步分离DNA,B正确;DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同,它能溶于2mol/L的NaCl溶液,利用该原理可纯化DNA粗提物,C正确;二苯胺试剂可以用于鉴定DNA,不能检测出溶液中是否含有蛋白质杂质,D错误。D2.(2024·新课标卷,5)某种二倍体植物的P1和P2植株杂交得F1,F1自交得F2。对个体的DNA进行PCR检测,产物的电泳结果如图所示,其中①~⑧为部分F2个体,上部2条带是一对等位基因的扩增产物,下部2条带是另一对等位基因的扩增产物,这2对等位基因位于非同源染色体上。下列叙述错误的是(
)A.①②个体均为杂合体,F2中③所占的比例大于⑤B.还有一种F2个体的PCR产物电泳结果有3条带C.③和⑦杂交子代的PCR产物电泳结果与②⑧电泳结果相同D.①自交子代的PCR产物电泳结果与④电泳结果相同的占1/2解析由题图可知,P1、P2为纯合子,F1为杂合子,且两对等位基因的遗传符合自由组合定律,假设基因由上到下依此为A、a、B、b,则P1基因型为AAbb,P2基因型为aaBB,F1基因型为AaBb,据此分析选项。①基因型为AaBB,②基因型为Aabb,均为杂合体;F2中,③基因型为AABb,占比1/8,⑤基因型为AABB,占比1/16,③占比大于⑤,A正确;据图分析,图中缺少F2中基因型为aaBb对应的电泳图像,其电泳结果为3条带,分别为第2条带、第3条带和第4条带,B正确;由题图可知,③和⑦对应杂交类型为AABb×aabb,因此后代基因型为AaBb、Aabb,与②(基因型为Aabb)、⑧(基因型为AaBb)电泳结果相同,C正确;①基因型为AaBB,其自交后代基因型及比例为AABB∶AaBB∶aaBB=1∶2∶1,④的基因型为aaBB,因此①自交子代与④电泳结果相同的占比1/4,D错误。D3.(2024·山东卷,5)制备荧光标记的DNA探针时,需要模板、引物、DNA聚合酶等。在只含大肠杆菌DNA聚合酶、扩增缓冲液、H2O和4种脱氧核苷酸(dCTP、dTTP、dGTP和碱基被荧光标记的dATP)的反应管①~④中,分别加入如表所示的适量单链DNA,已知形成的双链DNA区遵循碱基互补配对原则,且在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区。能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有(
)A.①② B.②③ C.①④ D.③④反应管加入的单链DNA①5′—GCCGATCTTTATA—3′3′—GACCGGCTAGAAA—5′②5′—AGAGCCAATTGGC—3′③5′—ATTTCCCGATCCG—3′3′—AGGGCTAGGCATA—5′④5′—TTCACTGGCCAGT—3′4.(2023·江苏卷,22)为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达,运用重组酶技术构建质粒,如图1所示。请回答下列问题:(1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时,配制的两个反应体系中不同的有______________,扩增程序中最主要的不同是______________。(2)有关基因序列如图2。引物F2-F、F1-R应在下列选项中选用________。EGFP基因序列:5′ATGGTGAGCAAGGGC—GACGAGCTGTACAAG3′AnB1基因序列:5′CATGTCCAGCTGCAG—CCAAAACCACAACCA3′图2A.ATGGTG——CAACCA B.TGGTTG——CACCATC.GACGAG——CTGCAG D.CTGCAG——CTCGTC模板、引物退火温度CD(3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后,在重组酶作用下可形成环化质粒,直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比,无需使用的酶主要有________________________________。(4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选,下列叙述错误的有________。A.稀释涂布平板需控制每个平板30~300个菌落B.抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高C.抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落D.抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化限制性内切核酸酶、DNA连接酶ABC(5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计,用不同菌落的质粒为模板,用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增,质粒P1~P4的扩增产物电泳结果如图3。根据图中结果判断,可以舍弃的质粒有________。(6)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒,通常需进一步通过基因测序确认,原因是_____________________________________________________________________________________________。P3、P4电泳只能显示扩增片段的大致长度,不能显示精准的DNA碱基数量,也不能呈现DNA碱基序列解析
(1)不同的PCR反应体系中,模板和引物是不同的;扩增程序中依据不同引物设置不同的退火温度是最重要的环节,恰当地选择退火温度,尽量避免引物与模板的非特异性结合,以保证目的产物的有效扩增。而对于延伸时间而言,以常用的TaqDNA聚合酶为例,催化DNA延伸的速度为1000~2000bp/min,通常在实验室中可根据目的片段大小在30s~2min的时长内大致设置延伸时间,一般不需要精确控制。(2)对于引物F2-F、F1-R,根据图中信息分析,应该包含EGFP尾部和AnB1头部的序列,且反向互补。因此,应选择引物C和D。(3)根据图中示意的同源重组过程,两个插入片段与线性载体在重组酶作用下,可形成环状质粒,直接转化细菌,这一过程省去了传统质粒构建过程中酶切、连接两个过程,所以无需使用限制性内切核酸酶、DNA连接酶。(4)“稀释涂布平板需控制每个平板30~300个菌落”是微生物计数的实验步骤,与抗性平板筛选的目的完全不同,A错误;涂布平板时,培养基已凝固,不会烫死细菌,抗性平板上没有出现菌落,最常见的原因是未能有效实现重组质粒构建,或未能进行有效转化,导致抗性平板上未长出带有抗性质粒的菌落,B错误;由于筛选平板中含有抗生素,在正常的无菌操作过程中,不会出现大量的杂菌污染,C错误;单菌落无需进行纯化,如携带非目标质粒,可通过鉴定排除,D正确。(5)结合图1中的设计目标,从PCR产物电泳结果判断:P3无目的片段,P4产物片段大小不符,故P3、P4可直接丢弃。而P1、P2产物大小与理论值相近,需进一步分析确认。(6)电泳条带依据其和参照分子(Marker)的相对位置,仅能显示扩增片段的大致长度,即不能显示精准的DNA碱基数量,也不能呈现DNA碱基序列,必须通过DNA测序最终确认构建的质粒符合设计。1.(2024·华师一附中调研)中天杨是由我国科学家采用生物转基因技术,历经8年时间培育成功的抗盐碱、耐干旱的杨树新品种。该品种以八里庄杨为实验材料,经转mtl-D基因培育获得。如图为培育“中天杨”的操作流程,①~⑥表示操作过程,该过程中可能用到的限制酶如表所示。注:Ti质粒中的Tetr为四环素抗性基因,Ampr为氨苄青霉素抗性基因。(1)过程①需要的酶是______________________________,过程②需要的工具酶是____________________。采用PCR技术扩增目的基因时,在PCR反应体系需加入引物,引物的作用是______________________________________________,若目的基因扩增3代,则共用引物________个。PCR完成以后,常采用_________________法来鉴定PCR的产物。限制酶Bcl
ⅠEcoRⅠXba
ⅠSau3AⅠBamHⅠ切割位点T↓GATCAG↓AATTCT↓CTAGA↓GATCG↓GATCC逆转录酶和耐高温的DNA聚合酶限制酶和DNA连接酶使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸14琼脂糖凝胶电泳(2)培育转基因杨树的核心工作是___________________,在进行该工作时,应在mtl-D基因的两侧添加限制酶_________________的识别序列。(3)将目的基因导入受体细胞除图示方法外,还有_______________。为了确认目的基因在植物细胞中是否成功表达,从分子水平通常是用________________法进行检测。基因表达载体的构建XbaⅠ、BclⅠ花粉管通道法抗原—抗体杂交解析
(1)过程①以RNA为模板合成DNA并进行PCR,该过程需要逆转录酶和耐高温的DNA聚合酶。过程②是将目的基因与Ti质粒进行连接,需要限制酶切割目的基因和Ti质粒,然后利用DNA连接酶将二者进行连接。采用PCR技术扩增目的基因时,在PCR反应
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