DB21T 3273-2020 猪伪狂犬病毒野毒株与gE基因缺失疫苗株TaqMan实时荧光定量PCR鉴别方法　　

DB21DB21/T3273—2020猪伪狂犬病毒野毒株与gE基因缺失疫苗株TaqMan实时荧光定量PCR鉴别方法ATaqManReal-timePCRMethodforDifferentiationofWild-typeStrainfromgE-deletedVaccineStrainofPseudorabiesVirus2020-06-30发布2020-07-30实施辽宁省市场监督管理局发布I 1 1 1 1 1 2 3 4 6 7标准起草单位通讯地址：辽宁省农业发展服务中心（沈阳市皇姑区宁山东路29号），联系电话：1本标准适用于猪血液、组织脏器、精液、鼻腔拭子和细胞培养物等材料中PRV核酸的检测以及PRVNY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技PRV伪狂犬病病毒（pseudorabie荧光PCR仪、高速冷冻离心机（可控温至4℃,离心速度可达12000r/min以上）、组织研磨仪-20℃以下普通冰箱、-70℃以下超低温冰箱、移液器（量程0.1μL～2μL、2μL～20μL、20μL~25.1DNAzol®Reagent：商品化DNA提取试剂，2℃~8℃普通冰箱中保存；或商品化核酸提取试剂盒（如磁珠法核酸提取试剂通常18℃~25℃保存。5.2无水乙醇：-20℃普通冰箱中预冷。5.375%乙醇：用无水乙醇和双蒸水配制，-20℃普通冰箱中预冷。5.4PBS：磷酸盐缓冲液（0.02mol/LpH7.2配制见附录A。5.62×TaqManFastqPCRMasterMix：为商品化探针5.8阳性对照和阴性对照：阳性对照使用PRV野毒株细编号备检；组织脏器使用组织研磨仪或研钵进行处理后3在试剂配制区进行。gD基因和gE基因的反应体系相同。设荧光qPCR反应管数为n，n为待检样品数+阳性对照管数+阴性对照管数，每个反应体系见表1，配制体系时建议按照n+1个反应进行配制，配制反应体系建议在冰盒中进行；配制好的反应液充分混匀后，按照每管18μL分装于PCR反2×TaqManFastqPCRMasterMix上游特异性PCR引物（10μmol/L）下游特异性PCR引物（10μmol/L）TaqMan探针（10μmol/L）灭菌双蒸水4将PCR反应管放入荧光PCR仪内，设置探针：5’端选gD和gE基因荧光qPCR反应条件均为：94℃3min；94℃15s，60℃45s，收集荧光，40个循环。Ct值≤36，且扩增曲线为典型的S型，报告为PRV核酸阳性，但需进一步经gE基因检测来进行PRV野36＜Ct值≤38，判定为可疑，需从提取DNA开始进行一次重复检测。如重复检测结果仍为36≤38，且扩增曲线均呈典型的S型扩增曲线，报告为PRV核酸阳性，但需进一步经gE基因检测来进行PRV536＜Ct值≤38，判定为可疑，需从提取DNA开始进行一次重复检测。如重复检测结果仍为36则判定为PRV核酸阴性，既无PRV野毒也无疫苗毒。针对未免疫缺失gE基因的PRV疫苗(△gE/PRV）的猪只，如果gD基因或gE基因检测结果为阳性，则判定为PRV野毒核酸阳性；如果gD基因和gE基因检6 A.18mmol/LNaOH溶A.2.20.2mol/L磷酸二氢钠溶液：称取磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O）31.21g，先加适量去离子水溶7 FAM-ACCAGCACCGCACGTACAAG-BHQ1FAM-ACCAGACGTCGAAGCCGGA-B