陆生野生脊椎动物种质资源样本采集规范

3陆生野生脊椎动物种质资源样本采集规范本规范规定了省陆生野生脊椎动物种质资源样本采集规范，包括采集许可申请、样本类型、样本信息数据、采集方法、采集程序、临时保存方式、运输方式等。本标准适用于省内相关大专院校、研究机构、自然保护区管理机构、动物园、野生动物繁育机构等，其他机构可参照执行。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。《中华人民共和国野生动物保护法》（2022年12月30日）《中华人民共和国自然保护区条例》（2017年10月7日）《中华人民共和国生物安全法》（2020年10月17日）《全国陆生野生动物资源调查与监测技术规程》（国家林业局，2011年）《陆生野生动物疫源疫病监测防控管理办法》（国家林业局令2013第31号）LY/T2359-2014陆生野生动物疫源疫病监测技术规范3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1陆生野生脊椎动物terrestrialvertebrate行肺呼吸，主要在陆地生境栖息、捕食或繁育的野生脊椎动物。3.2种质资源样本germplasmresourcessample含有物种全部或部分遗传信息的DNA、细胞、精液、血液、组织、器官等。能够中长期保存，用于动物学研究，或用于在未来技术成熟时恢复为完整的动物个体。43.3动物组织tissue形态相同或相似、机能相同或密切相关的细胞群及其分泌物构成的具有一定形态、能完成一定机能的结构。动物组织一般分为四类：上皮组织、结缔组织、肌肉组织、神经组织。3.4组织样本（DNA样本）tissuesampleforDNAextraction保存质量能够满足全基因组（包括线粒体基因组）提取的动物组织。3.5组织样本（RNA样本）tissuesampleforRNAextraction保存质量能够满足RNA提取的动物组织。3.6动物器官organ由几种不同类型组织有机结合形成的、具有一定形态特征和生理机能的结构，如睾丸、卵巢、心脏、肝脏、肺等。4目标与原则规范陆生野生动物种质资源样本采集工作，为动物学研究、动物保护提供科学保障。4.2原则4.2.1合法性原则野生动物为国家所有。无论出于何种目的采集野生动物或其部分样本，应当具备相应条件，符合生物安全管理规范，符合相关法律要求，并得到主管部门的许可。4.2.2科学性原则野生动物种质资源样本采集是科学性、专业性都非常强的工作，必须由专业人员或经过一定专业培训的人员，按照一定的科学规范操作。4.2.3全过程控制原则鉴于大自然中病毒、细菌等微生物无处不在，动物种质资源样本存在被污染风险，因此必须实行全过程控制，从事前准备、样本采集、临时保存、运输过程及保藏，每一步骤均须规范操作，以保证样本的纯洁性。5采集对象55.1陆生野生脊椎动物类别a.哺乳类；b.鸟类；c.爬行类（淡水龟鳖类除外）5.2种质资源样本类别a.遗传物质（DNA）b.生殖细胞（精液、卵细胞）；c.组织（皮肤、肌肉、血液等d.器官（睾丸、卵巢、心脏等）。6申请许可陆生野生脊椎动物归属各级政府林业主管部门管理，采集陆生野生脊椎动物样本（包括野外无主动物尸体）均需获得主管部门的许可。采集国家一级保护野生动物种质资源样本，应当向国家林业主管部门申请许可；采集国家二级保护野生动物种质资源样本，或到国家级自然保护区采集，应当向省级林业主管部门申请许可；采集有重要生态、科学、社会价值的陆生野生动物和省级重点保护野生动物种质资源样本，或到省级、县级自然保护区采集，应当向县级以上林业主管部门申请许可。7采集前准备7.1大型仪器设备包括交通运输工具（车辆）、车载超低温冰箱（-80℃)、车载普通冰箱（-20℃)、液氮罐等（见附录1）。7.2小型器具包括解剖刀、手术剪、镊子、冻存管、冻存盒、白大褂、口罩、乳胶手套、脱脂棉、纱布等（见小型器具应清洗干净、充分消毒，分门别类、整齐摆放于专用工具箱中备用。67.3化学试剂RNAlater、RNase抑制剂、无水乙醇、95%乙醇、去离子水等（见附录3）。化学试剂应封装于专用容器中，分门别类摆放于安全度高的车载专用试剂柜或试剂箱中备用。8采集8.1组织样本采集8.1.1组织样本（DNA样本）根据采集对象种群数量情况，同一地区同一物种挑选1-10个个体。注意同物种样本的采集地应保持一定距离（根据动物类群活动范围浮动）。应在每支冻存管上做好标记，可用标签纸标记采集编号（原始编号）粘贴至冻存管上，或用记号笔在冻存管上标记；优先选择肌肉、内脏等角质化程度低的部位，每个个体采集1份（管）组织材料，每份组织材料约1克（黄豆大小）置于冻存管内；在每份组织材料的冻存管内添加至少5倍体积的无水乙醇完全浸泡；组织材料在2-8℃或更低温度条件下（冷藏）暂存；组织材料以-20℃（冷冻）或更低温度尽快运输至保藏单位，优先使用干冰等温度低的运输条件。8.1.2组织样本（RNA样本）同一地区同一物种挑选1-3个个体。同物种样本的采集地应保持一定距离（可根据动物类群活动范围调整）。解剖取样要及时，在动物个体死亡半小时内完成解剖采样。应在每支冻存管上做好标记，可用标签纸标记采集编号（原始编号）粘贴至冻存管上，或用记号笔在冻存管上标记；每个个体各器官（心、肝、脾、肺、肾等）采集3份（管）组织材料，每份组织材料约1克（黄豆大小）置于冻存管内；在每份组织材料的冻存管内添加至少5倍体积的RNAlater保存剂完全浸泡；组织材料在2-8℃条件下冷藏12小时（过夜）；组织材料在-20℃或更低温度条件下（冷冻）暂存；组织材料以-20℃（冷冻）或更低温度尽快运输至保藏单位，优先使用干冰等温度低的运输条件。8.1.3血液样本7同一地区同一物种挑选1-10个个体。注意同物种样本的采集地应保持一定距离（根据动物类群活动范围浮动）。应在每支采血管上做好标记，可用标签纸标记采集编号（原始编号）粘贴至冻存管上，或用记号笔在采血管上标记；用抗凝采血管对哺乳动物每个个体采集1-5ml血液，对鸟类动物每个个体采集0.5-1ml血液，采血量可根据动物个体大小有所调整；将采血管上下缓慢颠倒混匀；血液样本在2-8℃条件下（冷藏）暂存；血液样本在2-8℃（冷藏）条件下尽快运输至保藏单位；如暂存、运输时间超过1周，血液样本应在-20℃（冷冻）条件下暂存，并以-20℃（冷冻）或更低温度尽快运输至保藏单位，优先使用干冰等温度低的运输条件，避免因反复冻融造成血液样本降解。8.1.4细胞样本在动物个体死亡半小时内完成解剖采样。野外采集细胞样本工作量较大，需要专人操作。采样过程中应注意无菌操作，防止样本污染。每支冻存管上应该做好标记，可用标签纸标记采集编号（原始编号）粘贴至冻存管上，或用记号笔在冻存管上标记；每个个体各器官（心、肝、脾、肺、肾等）采集2-3克组织材料，尽量剔除外层膜及结缔组织；组织材料在75%酒精中浸泡5-10秒；组织材料在1XPBS中清洗3次；组织材料装于含有DMEM的50ml离心管中，在2-8℃条件下（冷藏）运回实验室；在实验室内分离培养细胞，每份细胞样本的细胞数量不少于1x106个；细胞样本应尽快运输至保藏单位。8.2样本信息采集8.2.1数据文字信息采集分类学信息8中文种名（中文物种名称，如“扬子鳄”）拉丁学名（根据物种命名法规命名的学名，包括属名、种本名，如“Alligatorsinensis”）种下名称（即亚种名，若有则须添加，如“Macacathibetanahuangshanensis”）纲名称（中文和拉丁文同时填写）目名称（中文和拉丁文同时填写）科名称（中文和拉丁文同时填写）采集信息采集号（自行命名，但需确保编码原则统一性、编码唯一性，可使用物种简称字母+数字）采集地（填写具体采集地点，至少描述到行政村级行政单位，如“休宁县璜尖乡璜尖村”；若为行车途中采集，须填写道路名称和离最近行政村间的距离，如“杨璜线距璜尖村4km处”。地点按照“中国行政区划网”（）划分标准填写）经度（采集地经度，采用“度”格式，至少要到小数点后4位，例：E118.287859）纬度（采集地纬度，采用“度”格式，至少要到小数点后4位，例：N29.699644）海拔（采集地海拔，保留小数点后两位，如128.49m）采集人（标本具体采集人。如无确切采集人，可填单位或项目考察队、采集队等等）采集时间（注意规定的日期格式“yyyy-mm-dd”，不足位用“0”补齐，之间用“-”连接，如“2022-03-15”）采集方式（直接采集、网捕、灯诱、陷阱等）生境（包括农田、森林、湿地、湖泊、河流等，家养动物不填）保存单位（标本保藏单位全称）标本信息物种鉴定方法（形态学/分子生物学鉴定）鉴定人（标本鉴定人）鉴定时间（注意规定的日期格式“yyyy-mm-dd”，不足位用“0”补齐，之间用“-”连接，如“2023-03-15”）标本号（优先使用标本馆编号）标本属性（正模、配模、副模、地模、普通等等）9标本制作日期（注意规定的日期格式“yyyy-mm-dd”，不足位用“0”补齐，之间用“-”连接，如“2023-03-15”）保藏方式（标本保藏方式，如浸泡、干制、冰冻等等）实物状态（标本实物状态，如完整、破损等。非完整标本可简单描述破损部位，如“尾部缺如”）标本保藏单位标本保藏位置（根据具体情况选择填写）标本联系人联系邮箱组织样品信息组织类型（可填血液、心、肝、脾、肺、肾、肌肉等）组织样品采集号（根据具体情况选填）DNA条码编号（根据具体情况选填）共享方式（如完全开放共享、协议共享、暂不共享等）获取途径（标本获取途径，如既有、采集、交换、捐赠、罚没、购买等）联系人（包括单位、地址、邮编、电话、电子信箱等）类群特有信息如兽类特有、鸟类特有、爬行类特有，可根据各类群情况自行增加字段填写。8.2．2图像信息采集生境照规范.1整体要求野生动物生境照要求体现采样地地貌、植被、水源等，家养动物生境照要求体现饲养环境、喂食情况等；每个采样地拍摄1-3张生境照；照片精度要求在1000万（2775×3700）像素值以上，以保障照片清晰度，保存格式为“jpg”格式。.1命名规范生境照以“采样地（省市县）”+英文半角“-”+阿拉伯数字“序号”+“.jpg”命名；只有一张照片时：采样地-1.jpg，如：省黄山市黄山区-1.jpg有两张及以上照片时：采样地-1.jpg、采集地-2.jpg，如：省黄山市黄山区-1.jpg、省黄山市黄山区-2.jpg；生境照存于一个文件夹内，文件夹按“生境照”格式命名。工作照规范.1整体要求工作照要求体现工作场景、工作方式等；每个采样地拍摄1-3张工作照；照片精度要求在1000万（2775×3700）像素值以上，以保障照片清晰度，保存格式为“jpg”格式。.2命名规范工作照以“工作内容”+英文半角“-”+阿拉伯数字“序号”+“.jpg”命名；只有一张照片时：工作内容-1.jpg，如：采集当地家养动物-1.jpg有两张及以上照片时：工作内容-1.jpg、工作内容-2.jpg；工作照存于一个文件夹内，文件夹按“工作照”格式命名。标本（个体）照规范.1整体要求标本应拍摄成标本外观照，活体动物应拍摄成个体照；每个动物个体拍摄1-3张全身入镜照片，主要鉴别特征局部特写照1-2张；像素大小:照片精度要求在1000万（2775×3700）像素值以上，以保障照片清晰度，保存格式为“jpg”格式。.2具体要求先拍摄个体对应的标签，再拍摄该个体所有角度照片，这样便于后期辨识对应的照片；活体整体照（背面、背侧面和腹面）需在摆拍造景下完成，其余特写对背景无特殊要求（最好选择深色、纯色背景，便于后期图片处理）；摆拍最好在原产地进行，尽可能还原其生境（可选择林缘开阔区域或较安全、动物不易逃脱的地方，需若干人配合)；如拍摄需在室内完成，摆拍造景需根据物种生活习性完成；鉴别特征细节照：光圈要小，景深要浅，形态细节特征须清晰。.3命名规范标本照以“标本号”+英文半角“-”+阿拉伯数字“序号”+“.jpg”命名；只有一张照片时：标本号-1.jpg，如：660315-1.jpg；有两张及以上照片时：标本号-1.jpg、标本号-2.jpg、标本号-3.jpg，如：660315-1.jpg、660315-2.jpg、660315-3.jpg；无标本的活体动物照片命名参照标本照执行，可用“采集号”代替“标本号”命名。汇交规范生境照、工作照、标本（个体）照文件夹存于一个文件夹内，文件夹以“物种采集地省市县”命名，如省黄山市休宁县，同一物种多个采集地的文件夹存于一个文件夹下，以“物种名”命名，同一类群物种存于同一文件夹，以“年份-地点-类群”格式命名，例如“2023-省黄山市徽州区-鸟类”、“2023-省黄山市歙县-蛇类”。图像等大数据以U盘、硬盘等形式汇交至保藏单位。9样本运输样本采集完成、存放于临时保存设备后，应尽快送到保藏机构进行长期保存。运送样本的车辆，应经过检查完全正常，证照、保险、安全设施（包括灭火器等）齐全。样本保存设备应完全固定，不会因车辆颠簸而位移、倾斜。车辆行驶过程中，应尽量选择质量更好的道路。司机连续驾驶达到两个小时，则必须休息20分钟以上。当天驾驶时间不能超过8小时。应有专业人员跟车，定时对样本保存设备进行检查，确保设备全程正常工作。样本到达保藏机构，应第一时间移交，确保以最快速度置入长期保藏设备。附录1动物样本