DB21T 3094-2018 种猪场欧洲型猪蓝耳病净化技术规范　

DB21Thetechnicalspecificationsforremovingeuropeangenotypeporcinandrespiratorysyndromeinbreedingpigfarm辽宁省市场监督管理局发布I 1 1 1 1 1 1 1 1 2 3 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 5 5 5 6娜、夏伟、邵奎龙、路畅、李红伟、郭雪峰、孙洪广、1种猪场欧洲型猪蓝耳病净化技术规范鉴别猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病性与经典毒株欧洲型猪蓝耳病（EuropeanGenotypePorcineReproductiveandRespiratorySyndrome；EU-PRRS）：由欧洲型猪繁殖与呼吸综合）：4净化群的建立4.1采样数量和采样时间4.1.1假定健康猪群24.1.2可疑感染猪群种公猪、种母猪分别按100%比例采血，或同时按104.1.3感染猪群种公猪、种母猪、后备猪分别按100%比例采血，或同时按100%比例采集精液，连续采集2次，间隔4.2检测方法4.2.1检测试剂和仪器本技术规范中使用的试剂，除另有说明外，所用试剂均为分析纯；所有试剂均用无RNA酶的容器分本技术规范中需应用下列试剂和材料：Trizol（RNA抽提试剂，外观为粉红色，分装至棕色瓶中，于4℃~8℃保存）、氯仿（4℃预冷）、异丙醇（4℃预冷）、75%乙醇（用新开启的无水乙醇和DEPC水配制20℃预冷）、DEPC水（1000mL双蒸水中加入1mLDEPC，室温下持续搅拌过夜，121℃高压灭菌25min）、RNA酶抑制剂（40U/μL）、TaqDNA聚合酶（5U/μL）、dNTP(2.5mmoU/μL）、三羟甲基氨基甲烷-乙酸电泳缓冲液（TAE）、溴化乙锭（EB）、DL2000DNAMarker、上游引物：5,-,TAACCGAGCATACGCTGTGAGAAAG-3,，下游引物：5,-CAAATTAACTTGCACCCTGACTGGC-本技术规范中使用的设备包括：PCR扩增仪，高速冷冻离心机（离心力在12000g以上），核酸电泳仪和水平电泳槽，组织均浆机或研钵，凝胶成像系统、微量4.2.2样品的采集与处理4.2.2.1组织样品：按照GB/T27517淋巴结、扁桃体、肺脏、脾脏、肾脏、胸腺等组于组织匀浆器或研钵中充分匀浆或研磨，再加04.2.2.2血清或抗凝血：用无菌注射器自耳静脉或前腔静脉釆集血液3mL～5mL2mL～3mL，再自耳静脉或前腔静脉采集等量血液快速混匀后转入无菌处理的样品在2℃~8℃条件下保存应不超过24h；若需长期保存，应放置-70℃冰箱，但应避免反复冻4.2.2.4RNA提取及cDNA合成：按照Trizol提取试剂说明书提取总RNA，按照反转录试剂盒说明书进325µL4.2.2.6电泳：将PCR扩增产物8µL与2µL上样缓冲液混4.2.2.7结果判定）；4.3处理比例、母猪按25%比例采血或同时按相同比例采集活体猪扁桃体样品，再次进行欧洲型猪蓝耳病病毒核酸检测。欧洲型猪蓝耳病病毒核酸检测全部阴性，可视为假定欧洲型猪蓝耳病阴性猪45.2后备猪的检测猪蓝耳病病毒保持阴性，样品采集、检测方法5.4病死猪的检测法同4.2。如若检出欧洲型猪蓝耳病病毒核酸阳性，应重新对种猪群种猪场应符合下列所有条件，即达到欧洲型猪蓝耳病净化检测阴性后方可启运引进，引进后隔离饲养45～607.2.1收集病死猪及母猪所生产的弱仔、死胎、流产胎儿，进行欧洲型猪蓝耳病病毒核酸检5态下，要选用无刺激或刺激性小的消毒药进行舍内环境病死猪及母猪所生产的死胎、流产胎儿按GB16548的要求，粪便按NY/T1168的要求进行无害化处6A.2.10.5mol/L乙二铵四乙酸二钠（EDTA）溶液（pH8.0）A.2.2TAE(三羟甲基氨基甲烷－乙羟基甲基氨基甲烷（Tris分析纯）0.5mol/L乙二铵四乙酸二钠（EDTA）溶液微波炉中完全融化，加溴化乙锭（EB）溶液20μL。7用磁力搅拌器室温下持续搅拌过夜，分瓶包装后121℃高压A.6上样缓冲液A.7电泳缓冲液（1倍）灭菌双蒸水A.8磷酸盐缓冲液（0.01mol/L，pH7.4，PBS）氯化钠（NaCl）氯化钾（KCl）磷