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DB21DB21/T2549—2015仔猪乳糖酶基因检测技术规程Methodofdetectinglactasegeneinpiglets2015—12—15发布2016—02—15实施辽宁省质量技术监督局发布1本标准主要起草人：田玉民、苏玉虹、朱弘焱、陶晓2本标准规定了仔猪乳糖酶基因启动子和增强子多态性的检测条件、检测步骤和结果判定的技术要件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试GB/T27476.1-2014检测实验室安全收。仔猪的乳糖酶基因位于染色体15q13，预测CDS全长为5793bp，在基3——上游引物F：5'-AAAAAGTTTGGTAAGGACCT-——下游引物R：5'-GGAACTGTTAGGAGGTATGTG-3'——上游引物F：5'-TAAACAAAGCCAAGGACATT-——下游引物R：5'-CTGGGGTGTATGTGCTTGTGG-3'微量移液器、高速冷冻离心机、核酸蛋白测定仪、PCR热循环仪、pH计、精度0.1g分析天平、涡用猪耳号钳子夹取仔猪耳部边缘组织0.5cm3，立即置采用常规的酚-三氯甲烷法提取，并测定DNA溶液浓度。具体方法板的PCR反应作为阴性对照）。PCR扩增产物长度为318bp。用TaKaRaMiniBESTAgaroseGelDNAEx用TaKaRaMiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKitVer.4.Analysis和Sequencher软件包进行测序峰图的多重比对和对多态性位点的判7.4乳糖酶基因5'UTR区增强子SNPG-4加灭菌双蒸水至15μL。可根据需要调整反应体系（注：为保证实验准确性，需设置以板的PCR反应作为阴性对照）。PCR扩增产物长用TaKaRaMiniBESTAgaroseGelDNAEx用TaKaRaMiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKitVer.4.Analysis和Sequencher软件包进行测序峰图的多重比对和对多态性位点的判8结果判定8.1启动子SNPG-308C和A-301G因GA，基因型为纯合子GAGA；如果测序结果仅有等8.2增强子SNPG-797A基因如果测序结果仅有等位基因A，基因型为纯合子AA；如果9废弃物处理550mmol/LTris-HCl,50mmol/LNa2EDTA，SDS3024:1(体积比)4mmol/LMgCl26B.1组织消化B.2DNA提取DNA提取方法：l)弃上清液，使管内酒精挥发干净；根据沉淀情况加入适量（建议40μL）TB.3DNA含量的测定c=A×N×50/1000N——核酸稀释倍数。A

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