第9章 催化策略(刘建华)

BiochemistrySixthEditionChapter9:CatalyticStrategies(催化(cuīhuà)策略）Copyright©2007byW.H.FreemanandCompany

Berg•Tymoczko•Stryer共七十八页国际象棋和酶都使用策略，国际象棋通过比赛发展策略，而酶则通过进化建立酶促反应机制。右边是能够酶切肽键(tàijiàn)的活性位点，由三个氨基酸残基（化学键是白色）构成。用黑色化学键表示的底物分子如同左边比赛中已经落入圈套的国王，面临被裂解的命运。共七十八页酶催化效率高、特异性强、条件温和。这些特征的基础是什么？介绍(jièshào)四类酶促反应的机制：丝氨酸蛋白酶、碳酸脱水酶、限制性核酸内切酶、和核苷单磷酸激酶。前三类将水分子加成到底物分子上，第四类避免水分子的加成。经过大量的实验研究（包括蛋白质结构测定、定点突变），发现：酶的催化机制基本策略是结合能、诱导匹配、和一些特殊的催化策略，协助底物形成转化态共七十八页每类酶的催化机制能解决各种化学反应(huàxuéfǎnyìng)所面临的问题。蛋白酶：将缺乏催化剂和pH7.0几乎不发生的反应(蛋白质水解）进行下去。碳酸脱水酶：将化学反应加速到能够与其他快速生理过程融合的水平。限制性内切酶：实现酶切反应的高度特异性。NMP激酶：把磷酸基团从ATP转移给另一个核苷酸（而不会转移到水分子）。共七十八页酶采用的几个基本的催化原则底物与酶结合启动催化。结合能是酶和底物之间形成大量弱相互作用所释放的自由能。这种结合能既可建立底物特异性，又能增加酶促效率。当底物转化成转化态，底物与酶之间完全互补。因此底物和酶之间的相互作用稳定转化态，从而降低(jiàngdī)反应的活化自由能。结合能对底物和酶分子的结构变化都有促进作用，使它们相互间匹配度更高（诱导匹配），有助于催化反应。共七十八页酶通常采用(cǎiyòng)下列一种或几种策略催化特定化学反应。共价催化。共价催化的活性位点有活泼基团，通常是很强的亲核基团。在酶促过程中亲核基团能暂时性共价连接底物。胰凝乳蛋白酶就采用这种策略。酸碱催化。酸碱催化中，水分子之外的物质提供质子或接受质子。接近催化。很多酶有两个不同的底物，将两种底物置于一个酶分子的同一结合面能显著增加反应速度。金属离子催化。金属离子起催化作用的方式有几种：有的是配位作用产生OH-离子（亲核试剂）；有的本身是亲电试剂，稳定带负电荷的中间体；还有的作为底物与酶结合的桥梁，增加结合能、将底物置于酶分子合适位置适于催化。共七十八页蛋白酶能促进非常难于(nányú)发生的反应共七十八页图9.1胰凝乳蛋白酶的特异性。裂解(lièjiě)芳香氨基酸或大的疏水氨基酸（已经用桔色涂出）C-端肽键（用红色标出）。共七十八页图9.2胰凝乳蛋白酶具有一个(yīɡè)高度活泼的丝氨酸。用DIPF

处理，胰凝乳蛋白酶分子28个丝氨酸残基中195位丝氨酸与DIPF反应，导致胰凝乳蛋白酶失活。共七十八页图9.3颜色底物。胰凝乳蛋白酶水解(shuǐjiě)

N-乙酰-L-苯丙氨酸-p-硝基苯酚酯产生黄色产物对硝基苯酚。在pH7.0，对硝基苯酚解离。共七十八页停留法(stopped-flowmethod)

检测反应(fǎnyìng)的起始状态，能够在毫秒范围内混合酶和底物、跟踪毫秒时间内的反应(fǎnyìng)结果。结果显示起始状态迅速形成一种颜色产物，随后缓慢（即进入稳态）（图9.4）。这些结果提示：酶促反应过程有两个步骤，第一步很快，第二步很慢。图9.4胰凝乳蛋白酶催化的动力学。酶水解N-乙酰-L-苯丙氨酸-p-硝基苯酚酯有两个(liǎnɡɡè)阶段：快速（稳态前）阶段和稳态阶段。共七十八页胰凝乳蛋白酶促水解反应的两个步骤涉及酶与底物的共价结合（图9.5）。第一步，底物的酰基与酶共价结合，同时释放对硝基苯酚或胺类（如果底物是酰胺键）。酶-酰基复合物称为酰化酶中间物。第二步，酰化酶中间物水解，释放底物的羧酸(suōsuān)组分和游离酶。酶酰化并释放对硝基苯酚的速度很快，但是水解酰化酶“恢复”游离酶的速度很慢。图9.5共价(ɡònɡjià)催化。胰凝乳蛋白酶水解有两个阶段：（A）酰化形成酰化-酶中间体；随后(B)去酰化释放游离酶。共七十八页图9.61967年DavidBlow

解析了胰凝乳蛋白酶的三维结构。球状、三条多肽链、二硫键连接在一起(yīqǐ)。酶促活性位点有Ser195，位于酶表面的裂缝中（图9.6）。活性位点的结构说明Ser195特别活泼（图9.7）。共七十八页Ser195的侧链与His57的咪唑环形成氢键(qīnɡjiàn)，咪唑环的NH又与Asp102形成氢键，活性位点氨基酸残基这样的排布称为催化三联体。这种排布使Ser195特别活泼。组氨酸残基定位Ser残基侧链，极化Ser侧链的羟基（去质子）。底物存在时，His57侧链接受Ser195侧链羟基的质子，因此His57是碱催化剂。Ser195丢失氢离子，产生烷基氧离子，其亲核性比羟基大得多。Asp102协助His57定位，通过氢键和静电相互作用使His57更能接受Ser195的质子。共七十八页第一阶段反应（酶的酰化）：第1步：底物与酶结合。第2步：His57（碱催化）接受Ser195质子，后者的氧亲核攻击目标肽键的羰基碳原子，使这个碳从平面结构转化成四面体结构。羰基碳原子的四面体结构不稳定（因为羰基原来的氧原子带有负电荷），但是(dànshì)氧负离子与酶蛋白的氧负离子洞的NH基团（图9.9）相互作用稳定，从而稳定羰基碳原子四面体（转化态）。第3步，四面体崩溃产生酰化酶。His57的正电荷侧链给要断裂肽键的氨基提供质子（酸催化）。第4步，断裂肽键的氨基成分离开酶共七十八页共七十八页第二阶段是酶的脱酰反应。酰化酶酯键的水解反应基本上是重复第2至第4步。第5步：水分子占据先前底物氨基成分所在的位置(wèizhi)。第6步：His57（作为碱催化剂）的咪唑环吸收水分子的质子，产生的OH-离子攻击酰基的碳原子，形成四面体碳原子。第7步：His57作为酸催化剂，提供质子导致四面体碳原子崩溃，断裂形成羧基。第8步：释放羧酸产物和游离酶。共七十八页共七十八页图9.8胰凝乳蛋白酶水解肽键的催化反应可以解释共价催化和酸碱催化机制。反应(fǎnyìng)过程包括8步：（1）底物结合；（2）丝氨酸亲核攻击肽键的羰基碳原子；（3）四面体崩溃；（4）氨基组分释放；（5）水分子结合；（6）水分子亲核攻击酰化酶中间体；（7）四面体崩溃；（8）羧酸成分释放。虚线表示氢键。共七十八页图9.9氧负离子洞。胰凝乳蛋白酶促反应的氧负离子中间体用氧负离子洞稳定。氧负离子洞的肽键(tàijiàn)NH与氧负离子中间体形成氢键（绿色虚线）。共七十八页该机制(jīzhì)能解释胰凝乳蛋白酶促反应的所有特征，但不能解释这个酶的底物特异性。

酶与底物类似物和抑制剂形成复合物的三维结构，发现酶分子有一个相对疏水的深口袋，成为S1口袋，适于长的非极性氨基酸侧链。适当侧链与该口袋结合将邻位肽键定位于断裂位点（图9.10）。胰凝乳蛋白酶的底物特异性几乎完全取决于肽键N-端的氨基酸侧链。共七十八页图9.10胰凝乳蛋白酶特异性口袋。胰凝乳蛋白酶底物结合口袋用相对疏水的残基构建、很深，有助于结合长的疏水性(shuǐxìng)残基如苯丙氨酸（绿色）侧链。活性位点195位Ser定位在断裂肽键。构成结合位点的关键残基已经标出。共七十八页其他蛋白酶的底物(dǐwù)特异性更为复杂。这些酶分子表面还有其他口袋识别底物(dǐwù)分子的其他残基。断裂肽键的N-端残基分别称为P1，P2，P3（从C-断向N-端编号），断裂肽键C-端氨基酸残基分别是P1',P2',P3'（从N-端向C-端编号）。相应地，结合这些位点的口袋对应地称为S1,S2或S1',S2'等。图9.11蛋白酶和底物先互作用的命名方法。底物与酶潜在的相互作用位点用红色的P表示。酶分子(fēnzǐ)相应的结合位点用S表示。断裂肽键（用红色标出）是这种命名的参考位点。共七十八页图9.12胰蛋白酶和胰凝乳(nínɡrǔ)蛋白酶的结构类似性。将胰凝乳蛋白酶（红色）置于胰蛋白酶（蓝色）之上，显示两者相似度很高。此处仅显示a-碳原子骨架。两种蛋白质分子之间a-碳原子误差是1.7A。共七十八页图9.9胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶(yídànbáiméi)、和弹性蛋白酶的S1口袋。有些氨基酸残基在决定这些酶的特异性方面起关键作用。用颜色标出了这些残基的侧链和活性位点的丝氨酸。共七十八页枯草杆菌蛋白酶（不是胰凝乳蛋白酶同源(tónɡyuán)物）也有催化三联体活性位点和氧离子洞，但是这个酶的氧离子洞的一个氨基来自天冬酰胺残基的侧链而不是肽链骨架（图9.14）。枯草杆菌蛋白酶属于另一蛋白酶家族，在古生菌、细菌、和真核生物发现了这一蛋白酶家族成员。图9.14枯草杆菌的催化三联体和氧负离子洞。氧负离子洞的两个氨基分别来自肽链骨架(gǔjià)氨基和Asn155的侧链氨基。这两个氨基能够稳定活性中心Ser221亲核攻击肽键碳原子所形成的氧负离子。共七十八页小麦羧肽酶II有催化三体，但是这个酶与胰凝乳(nínɡrǔ)蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶都没有明显的类似性（图9.15）。图9.15羧肽酶II。小麦羧肽酶II的结构（右边），有两条肽链（分别用蓝色和红色标出）。活性中心的催化三体（左边）与胰凝乳蛋白酶的组成相同。但是该酶与胰凝乳蛋白酶没有相似之处。形成氧离子洞的氨基酸残基用黄色涂出。该蛋白质属于(shǔyú)另一蛋白家族，包括乙酰胆碱酯酶和脂质酶。在这些酶中，用组氨酸活化的亲核试剂可能是半胱氨酸而不是丝氨酸。共七十八页最后，还有一类蛋白酶活性位点的丝氨酸或苏氨酸不是用天冬氨酸-组氨酸对活化，而是用赖氨酸侧链氨基(ānjī)或肽链N-端氨基活化。因此，蛋白酶活性中心的催化三体在进化过程中产生的时间点至少有三个。这类催化策略在水解肽及相关化学键方面尤为有效。共七十八页定点(dìnɡdiǎn)突变研究

共七十八页定点突变也能研究氧离子洞对催化反应的重要性。Asn155突变成甘氨酸能消除(xiāochú)枯草杆菌氧负离子洞的一个氨基，kcat值降至野生型酶的0.2%，Km值增加两倍。这些结果显示天冬酰胺的NH基团在稳定羰基碳四面体中间物以及形成该四面体的转化态方面起重要作用。共七十八页其他(qítā)种类的肽水解酶:半胱氨酸蛋白酶组氨酸残基活化半胱氨酸，后者亲核攻击肽键（与丝氨酸蛋白酶的丝氨酸相似)。木瓜蛋白酶(papain)是研究最深入的半胱氨酸蛋白酶。与该酶同源的哺乳动物蛋白酶有组织蛋白酶（cathepsins)，在免疫系统和其他系统起作用。Caspases也是半胱氨酸蛋白酶，负责细胞凋亡，但是Caspases的结构与木瓜蛋白酶没有关系。因此在进化过程中，半胱氨酸蛋白酶至少(zhìshǎo)独立出现两次。共七十八页其他(qítā)种类的肽水解酶:天冬氨酸蛋白酶天冬氨酸蛋白酶活性位点中心有一对天冬氨酸，联合作用活化水分子，后者攻击肽键。一个天冬氨酸去质子，攻击水分子（使之脱去质子）。另一个天冬氨酸有质子，极化(jíhuà)肽键使肽键对亲核攻击敏感。这类蛋白酶包括肾素，HIV蛋白酶。共七十八页活性位点有金属离子（几乎都是锌离子）。金属离子活化水分子，后者亲核攻击肽键(tàijiàn)的羰基。嗜热细菌蛋白酶（thermolysin）和消化酶羧肽酶A是锌离子蛋白酶。嗜热菌蛋白酶是锌蛋白酶家族成员。这个家族很大，包括基质金属蛋白酶（负责组织重构和组织降解）。但是羧肽酶A不属于这一家族。其他种类(zhǒnglèi)的肽水解酶:金属蛋白酶共七十八页讲到此.共七十八页图9.19HIV蛋白酶是二聚体天冬氨酸蛋白酶。两个亚基完全相同（分别用蓝色和黄色表示）。每个亚基（有99个氨基酸）给活性位点提供一个Asp。底物(dǐwù)结合后关闭结合口袋的扇翼结构。共七十八页图9.20

Indinavir

是HIV蛋白酶抑制剂。Indinavir(crixivan)的结构与HIV蛋白酶底物多肽的结构比较(bǐjiào)。底物断裂化学键用红色标出。共七十八页Indinavir的醇与四面体中间(zhōngjiān)物很相似，其它基团与酶分子识别位点S2,S1,S1’,和S2’结合。在活性位点，indinavir采用的构型接近于酶蛋白的二重对称结构。结合抑制剂后可变翼盖住HIV蛋白酶活性位点。抑制剂中心醇羟基与活性位点两个Asp相互作用。抑制剂的两个羰基与水分子形成氢键(在图9.21没有绘出)，而水分子又与两翼的肽键NH基团形成氢键。这种互作模式不可能出现(chūxiàn)在抑制剂与细胞天冬氨酸蛋白酶（如肾素）之间。这些决定indinavir抑制HIV的特异性。共七十八页碳酸脱水酶：37℃，中性pH，没有催化剂，CO2的水合速度常数相当于一级反应速度k1=0.15s-1。而碳酸脱水生成CO2的逆反应速度是k-1=50s-1（更快）。相应的平衡常数K1=5.4x10-5，即平衡时[CO2]/[H2CO3]是340:1。

CO2水合和HCO3-脱水常常与快速过程（尤其是运输过程）偶联。几乎所有生物都有碳酸脱水酶。碳酸脱水酶能够将反应速度增加到自动反应的合理速度之上。1.血液流过肺，碳酸脱水酶将HCO3-

脱水生成CO2。相反，碳酸脱水酶能够将CO2水合生成HCO3-

，产生眼泪或其它分泌液。2.HCO3-和CO2是不同酶促反应的产物或底物。快速转化HCO3-和CO2才能保证这些分子处于合适的浓度水平。3.这些酶促反应非常重要(zhòngyào)。碳酸脱水酶突变会导致骨质硬化（osteopetrosis）(密度过高，贫血)和精神障碍。共七十八页碳酸脱水酶能加速CO2水合生成(shēnɡchénɡ)HCO3-。活性最高的碳酸脱水酶水合CO2的速度达到kcat=106s-1，即一个酶分子每秒能转化100万分子。基本的物理过程如扩散和质子转移达不到这么高的水合速率，因此酶促反应必需采用特别的策略获得如此巨大的（prodigious）速度。共七十八页碳酸脱水酶含有催化活性必需的锌离子在碳酸脱水酶发现（1932年）10年后，发现这个酶有锌离子，证实酶活性必需锌离子—发现的第一例含锌离子的酶（当时的重大发现）。现在知道，生物体内超过1/3的酶要么有金属离子，要么用金属离子作为辅助因子。金属离子有几个性质增加反应活性：带正电荷；能形成相对强但相当(xiāngdāng)活泼的化学键；有的金属离子有多种氧化状态。金属离子的化学反应性质提供了进化过程中很多酶利用金属离子进行催化的理由。人类基因组至少有7种碳酸脱水酶（每种酶都有自身基因）。这些碳酸脱水酶序列一致性明显，是同源酶。共七十八页x-射线(shèxiàn)晶体学研究提供锌离子的详细而又直接的信息。碳酸脱水酶II是红细胞的主要成分，是研究得最深入（图9.22），也是活性最高的碳酸脱水酶之一。共七十八页催化经过锌离子活化水分子：锌离子复合物有利于二氧化碳水合。pH值对酶促二氧化碳水合反应(fǎnyìng)的影响（图9.23）。共七十八页在pH8，反应速度接近最大值。pH值降低，反应速度迅速下降。在pH7.0反应速度降低一半，提示pH7.0失去(shīqù)一个基团(pKa=7.0)的一半，这个基团对催化反应很重要。而且这个曲线显示，高pH值（脱质子）形成该基团能有效地催化。尽管有些氨基酸，如组氨酸的pKa值接近7，但是不同证据提示负责转化的基团不是氨基酸而是锌结合的水分子。图9.24锌离子结合(jiéhé)水分子的pKa值。与锌离子结合使水分子的pKa值从15.7降低至7。共七十八页（1）锌离子有利于水分子释放H+离子，产生氢氧根离子。（2）二氧化碳底物结合于酶活性位点，并被定位于与氢氧根反应(fǎnyìng)的位置。（3）氢氧根攻击二氧化碳，产生碳酸氢根离子（HCO3-）。（4）释放HCO3-后，又产生催化活性位点结合另一个水分子。共七十八页合成类似物有四个氮原子与锌离子结合（碳酸脱水酶是三个配位键）。一个水分子与锌离子还能形成(xíngchéng)配位键。直接测定显示锌结合水分子的pKa值是8.7，没有碳酸脱水酶结合水分子的pKa值那么低（但比游离水分子的pKa值显著降低）。在pH9.2，这个类似物催化二氧化碳水合速度提高100倍以上。尽管催化速度比碳酸脱水酶低很多，但是模型系统的实验结果暗示锌结合氢氧根离子的机制是正确的。碳酸脱水酶进化使之能够利用锌结合的氢氧根离子作为强催化剂。共七十八页图9.27水脱质子的动力学。碳酸脱水酶中锌离子结合(jiéhé)水分子的脱质子反应和结合(jiéhé)质子反应的动力学。共七十八页图9.28缓冲液对脱质子(zhìzǐ)反应的影响。缓冲液组分B协助锌结合水分子脱质子。共七十八页图9.29缓冲液浓度对碳酸脱水酶催化(cuīhuà)二氧化碳水合反应速度的影响。随着缓冲液1,2-二甲基苯咪唑浓度的增加，二氧化碳水合反应速率增加。缓冲液使酶催化产生很高的反应速率。共七十八页图9.30组氨酸质子穿梭。（1）His64消除锌离子结合水的质子，产生(chǎnshēng)亲核氢氧根离子和质子化组氨酸；（2）缓冲液B从这个组氨酸移去质子，再生没有质子化的组氨酸。共七十八页同一进化(convergentevolution)使不同的碳酸脱水酶产生锌结合位点与人碳酸脱水酶同源的碳酸脱水酶叫a-碳酸脱水酶，常见于动物、一些细菌和藻类。另有两类碳酸脱水酶，与a-碳酸脱水酶没有序列类似性。b-碳酸脱水酶见于高等植物和很多细菌，包括E.coli。光谱和结构研究(yánjiū)显示b-碳酸脱水酶的锌离子与一个组氨酸和两个半胱氨酸残基结合，但是这个酶蛋白的总结构与a-碳酸脱水酶无关。在植物中，这些酶有助于CO2积累，CO2对光合成的Calvin循环是非常关键的。古生菌Methanosarcinathermophila的碳酸脱水酶属于第三类碳酸脱水酶，即g-碳酸脱水酶。晶体结构显示g-碳酸脱水酶锌离子的三个结合位点与a-碳酸脱水酶非常相像。但是锌离子的三个结合位点处于三聚体g-碳酸脱水酶三个亚基之间的界面（图9.31）。酶蛋白分子有非常显著的左手b-螺旋结构（b-链扭曲成左手螺旋），与a-和b-碳酸脱水酶的结构不同。因此，在进化过程中至少有三次同一进化。产生锌离子配位键结合的碳酸脱水酶。共七十八页图9.31g-碳酸脱水酶。（左边）g-碳酸脱水酶的锌离子位点。锌离子与三个组氨酸和一个水分子结合。（中间）这个蛋白的三聚体结构。三个亚基分别是A，B，和C。每条链主要是左手b-螺旋。（右边(yòubian)）从顶部观察这个三聚体，显示该蛋白呈三重对称。锌离子位置由绿色表示，处于亚基界面之间。共七十八页图9.32用修饰保护DNA。EcoRV的识别序列（左边），和免受这个限制酶断裂(duànliè)DNA的甲基化位点（右边）。限制性核酸(hésuān)内切酶：共七十八页图9.33磷酸二酯键水解。所有限制性核酸内切酶催化DNA磷酸二酯键水解的产物是磷酸处于(chǔyú)5’-端。断裂化学键用红色标出。共七十八页机制(jīzhì)一（共价中间体，产物构型与底物相同）共七十八页机制二（直接(zhíjiē)水解），构型转换共七十八页用两种亲核试剂攻击磷所形成的产物(chǎnwù)支持流水线替代正确。共七十八页硫代磷酸的EcoRV底物（图9.34）。然后用富含18O标记(biāojì)水分子水解。18O相应于磷原子的位置确定磷原子的构型是维持还是转换。结果显示，磷原子构型转换了一次，证明水分子直接攻击导致磷酸二酯键断裂。酶促反应过程没有共价中间体这一步。共七十八页图9.35DNA裂解(lièjiě)得立体化学。EcoRV酶促反应断裂磷酸二酯键导致磷原子构型完全翻转（此时磷原子与一个硫原子，一个18O原子，一个16O原子，和一个与核苷酸连接的16O原子结合）。这一结果强烈提示限制性内切酶促反应是水分子直接攻击磷原子。共七十八页在Mg2+或类似的二价阳离子存在的情况下，将酶蛋白与底物分子结晶能够直接观察酶蛋白与底物之间的复合物是不可能的。因为酶蛋白能够裂解底物。但是，可以通过几种途径观察酶蛋白与金属离子形成的复合物。一条途径是没有Mg2+或类似的二价阳离子时，将酶蛋白与识别(shíbié)序列（即配体）混合后结晶。由于缺乏金属离子，能够长出相应得晶体。然后将相应得蛋白质晶体置于含有金属离子的溶液中浸泡。另一种方案是用活性很低的突变酶与相应的底物、金属离子一道结晶。最后用Ca2+替代Mg2+，将酶蛋白、底物和金属离子一道结晶（Ca2+作为辅助因子，酶蛋白的催化活性很弱）。所有这些操作都是使酶促反应不发生，从而能够确定金属离子的位置。由于每个活性位点有三个金属离子。多个金属离子在活性位点的具体作用仍在研究中。一个金属离子结合位点在所有结构（指前面不同方法所获得的结构）都出现。这个金属离子与蛋白质两个天冬氨酸和接近核酸断裂位点的一个磷氧基团形成配位键。该金属离子协助水分子定位，并活化水分子（类似碳酸脱水酶的Zn2+活化水分子），结合的水分子攻击磷原子（图9.36）。共七十八页图9.36EcoRV核酸(hésuān)内切酶的一个Mg2+结合位点。镁离子活化水分子，协助水分子定位，使之能够攻击磷原子。已经(yǐjing)断裂共七十八页图9.37EcoRV识别序列(xùliè)的结构。（A）识别序列是围绕轴（绿色）的旋转对称序列。（B）EcoRV识别序列的倒置重复具有二重旋转对称。共七十八页限制性核酸内切酶也有相应的对称结构(jiégòu)：二聚体酶的两个亚基也是二重旋转对称结构(jiégòu)。酶与识别序列结构(jiégòu)匹配有助于酶对DNA配体（即底物）的识别。蛋白质与带有识别序列的DNA分子形成的复合物结构证实酶与底物分子结构相似（图9.38）。酶紧紧地拥抱DNAs。共七十八页图9.39EcoRV拥抱DNA底物分子(fēnzǐ)之间形成的氢键。右边EcoRV分子的一个DNA结合环（绿色）与配体DNA分子之间的结合。图B显示与CG碱基对形成氢键的EcoRV酶蛋白分子的氨基酸残基，图C显示与TA碱基对形成氢键的EcoRV酶蛋白分子的氨基酸残基共七十八页图9.40识别位点的扭曲。DNA用球-棒模型表示。DNA双螺旋轴用红线表示(biǎoshì)。与酶结合发生明显扭曲。B型DNA双螺旋轴是直的(没有绘出)。共七十八页图9.41EcoRV与配体及非配体DNA分子的结合。非配体DNA(橘色)和配体DNA(红色)与EcoRV酶蛋白分子的结合。注意非配体DNA与蛋白质结合因距离太远，无法(wúfǎ)构建完整的Mg2+结合位点。共七十八页图9.42与非配体DNA相比，配体DNA与EcoRV的结合能高。配体DNA与EcoRV分子结合多余的结合能（与非配体DNA-EcoRV复合物相比）用于DNA扭曲，从而构建(ɡòujiàn)出完整的催化活性位点。共七十八页甲基化，无法(wúfǎ)扭曲。图9.43腺嘌呤甲基化。腺嘌呤甲基化阻止EcoRV与配体DNA之间形成氢键(qīnɡjiàn)，因此阻止了DNA的酶促断裂。共七十八页基因水平转移(zhuǎnyí)证据：进化关系疏远的生物，限制酶序列一致性高。遗传密码与宿主很不相同。图9.44II类限制性内切酶的保守核心结构。用颜色重点(zhòngdiǎn)标出每个酶蛋白二聚体的单一亚基含有形成活性位点区域（蓝色）的四个保守结构元件。共七十八页核苷单磷酸激酶催化磷酸基团转移核苷单磷酸激酶（NMPkinase）用腺苷酸激酶作为代表。这些酶催化核苷三磷酸（NTP，通常是ATP）末端的磷酸基团转移给核苷单磷酸(NMP)的磷酸（图9.45）。NMP激酶的主要挑战是将NTP的磷酸转移给NMP，但不促进磷酸转移给水分子（即NTP水解反应）。利用诱导匹配(pǐpèi)来解决这个问题。而且，金属离子在这个过程中起关键作用。但是，金属离子与底物而不是与酶蛋白形成复合物。共七十八页图9.45核苷单磷酸激酶转移(zhuǎnyí)磷酸基团。这些酶催化磷酸转移反应将核苷三磷酸（此处是ATP）和核苷单磷酸（NMP）转化成两个核苷二磷酸。共七十八页图9.46腺苷酸激酶和