DB32T 4395-2022 小麦土传病毒病病原检测技术规程

小麦土传病毒病病原检测技术规程江苏省市场监督管理局I本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定1黄花叶病毒(wheatyellowmosaicvirus)。CWMV:中国小麦花叶病毒(ChineseWheatMosaicVirus)Dot-ELISA:斑点酶联免疫吸附剂测定(DotEnzyme-linkedImmunosorbentAssELISA:酶联免疫吸附剂测定(Enzyme-linkedImmunosorbentAssay)间接ELISA:间接酶联免疫吸附剂测定(IndirectEnzyme-linkedImmunosoPCR:聚合酶链式反应(PolymeraseChainReRT-PCR:逆转录-聚合酶链式扩增反应(ReverseTranWYMV:小麦黄花叶病毒(WheatYellowMosaicVirus)可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应。颜色反应的深浅与受检样品中抗原的量呈正比，24.3RT-PCR原理将逆转录(RT)和聚合酶链式扩增反应(PCR)相结合的技术。逆转录是在逆转录酶的作用下，以RNA为模板合成与之互补的DNA(complementaryDNA,cDNA)的过程，再利用特异性引物以田间采集疑似小麦黄花叶病和中国小麦花叶病的小麦病株，采用附录C中的特异性引物进行RT-产物长度为182bp的小麦样品则认定为感染CWMY的阳性样品；则认定为阴性样品，阳性样品和阴性样品存放于-80℃低温冰箱；间接酶联免疫吸附剂测定和斑点酶6间接ELISA待检测样品按1:10(克：毫升)加入包被缓冲液，用研钵研磨成浆，8000r/min离心3min,上清3孵育结束后，用聚对苯二甲酸乙二醇酯(PBST)清洗酶标板3次～5次。每孔每次加PBST洗液700μL,每次停留1min～2min。用相应病毒抗血清和抗体稀释缓冲液按照1:2000的比例稀释，每孔加入稀释好的抗体液的OD₄o₅值<0.15,阴性对照孔的OD₄o₅值<0.15,当阴性对照孔的OD₄o5值<0.05时，按0.05计算。阳性对照有明显的颜色反应，且阳性对照OD₄o₅值/阴性对照OD₄o₅值>2,孔的重复性基本一致。6.12.2在满足了6.12.1质量控制要求后，可根据如下数据判断结果：样品OD₄o₅值/阴性对照OD₄o₅值>2,判为阳性；样品OD₄o5值/阴性对照OD₄o₅<2,判为阴性；样品OD₄o₅值阴性对照OD₄o₅值在47.1取样待测样品和对照样品按1:10(克：毫升)加入硫化铅(PBS)磷酸盐缓冲液，用研钵研磨成浆，用相应病毒抗血清和抗体稀释缓冲液按照1:2000的比例稀释，并将硝酸纤维素膜浸入其中，室温孵育30min～60min。将平皿中抗体液倒出，加入PBST20mL洗膜3次～4次，每次3min。显色底物氯化硝基四氮唑兰(NBT)66μL和BCIP338.1植物总RNA提取MiniKit)的操作步骤提取病叶RNA,然后在紫外分光光度计上测定所提RNA的浓度和纯度。56(规范性)间接ELISA试剂9.6,用蒸馏水定容至1000mL。A.2PBST缓冲液(pH7.4)氯化钠(NaCl)8.0g,磷酸二氢钾(KH₂PO₄)0.2g,磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)1.15g,氯化钾(KCl)0.2g,0.5mLTween-20,溶解于900mL蒸馏水中，用盐酸调节pH至7.4,蒸馏水定容A.4抗血清碱性磷酸酶标记抗体，抗体效价：1:2000,-20℃保存。二乙醇胺9.7mL,氯化镁(MgCl₂)0.01g,溶解于80mL蒸馏水中，用盐酸调节pH至9.8,用蒸馏水定容至100mL。A.7底物溶液(现配现用)7(规范性)B.1PBS磷酸盐缓冲液(pH7.2)氯化钠(NaCl)8.0g,磷酸二氢钾(KH₂PO₄)0.2g,磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)1.15g,氯化钾(KCl)0.2g,溶解于900mL蒸馏水中，用盐酸(HCl)调节pH至7.2,蒸馏水定容至1000mL。B.2PBST缓冲液(pH7.4)氯化钠(NaCl)8.0g,磷酸二氢钾(KH₂PO₄)0.2g,磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)1.15g,氯化钾(KCl)0.2g,0.5mLTween-20,溶解于900mL蒸馏水中，用盐酸调节pH至7.4,蒸馏水定容至1000mL。B.3封闭液取脱脂奶粉5g加入到100mLPBST,充分溶解，4℃保存。B.4抗血清病毒特异性抗体，抗体效价：1:2000,-20℃保存。B.5酶标抗体碱性磷酸酶标记抗体，抗体效价：1:2000,—20℃保存。B.6底物稀释缓冲液(pH9.5)Tris·Cl12.11g,氯化镁(MgCl₂)2.38g,氯化钠(NaCl)5.85g,溶解于900mL蒸馏水中，用氢氧化钠调节pH至9.5,用蒸馏水定容至1000mL。B.7底物溶液(现配现用)碱性磷酸酶显