分子生物学第五章原核转录

中心法则1954年首次提出的“中心法则”1970-1980年的“中心法则”21世纪后修正的“中心法则”转录相关的一些概念转录:在RNA聚合酶的作用下，以一段DNA链为模板合成RNA，将DNA携带的遗传信息传递给RNA的过程。其后果是合成一条鱼DNA链序列完全相同（除T/U）的RNA单链。编码链（codingstrand）:与mRNA序列相同的DNA链称为编码链，又叫有义链（sensestrand）。模板链（templatestrand）:根据碱基互补的原则指导RNA合成的DNA链称为模板链，又叫反义链（antisensestrand）。转录的基本特点1. 转录的不对称性:在RNA的合成中，DNA的二条链中仅有一条链可作为转录的模板，称为转录的不对称性。 模板链并非永远在同一条单链上

转录的方向性:RNA聚合酶与DNA聚合酶聚合方向一样是5-3方向，模板是3-5方向。转录有起始和终止位点: 转录单元:可被RNA聚合酶转录成完整的RNA的一段DNA序列包括启动子和终止子；一个转录单元可能包括多个基因(?)原材料:NTPsAtranscriptionunitisasequenceofDNAtranscribedintoasingleRNA,startingatthepromoterandendingattheterminator.转录起点是指与新生RNA链第一个核苷酸相对应DNA链上的碱基,通常为嘌呤。在原核中90%为嘌呤,A或G；把起点5’末端的序列称为上游（upstream）,把其3’末端的序列称为下游（downstream）。转录与复制的比较相同点:体现在酶学和化学上，反应的方向，以DNA为模板，起始延伸终止三阶段；不同点:不同点聚合酶；不同的底物；转录不需要引物，能够起始新链的合成，而且保留5‘端3磷酸；产生的RNA不需要与DNA模板结合；正确率比复制低；转录对某个基因的重复的转录，产生多个拷贝，复制1:1；终止方式RNA聚合酶RNA聚合酶是催化RNA合成的大分子:RNA聚合酶的反应条件需双链DNA模板;转录时，按5’3’方向合成RNA链；以4种NTP（A，U，G，C）为底物；不需引物，能够起始新链的合成，而且保留5‘端3磷酸。2.2原核生物中的RNA聚合酶原核生物中由一种RNA聚合酶催化所有RNA(mRNA,rRNA和tRNA)的合成。核心酶:2，β；β’；ω亚基RNA聚合酶全酶σ亚基:启动子的识别RNA聚合酶是目前已知的最大的酶之一。大肠杆菌RNA聚合酶的组成分析亚基基因分子量亚基数组分功能αrpoA365002核心酶核心酶组装，启动子识别βrpoB1510001核心酶β和β‘共同形成RNA合成的活性中心，形成磷酸二酯键β'rpoC1550001核心酶ω？110001核心酶与DNA模板结合σrpoD700001σ因子存在多种σ因子，用于识别不同的启动子核心酶与DNA序列结合是随机的,平均结合常数是2×1011；全酶因为包含σ亚基与特异序列（启动子）的结合能力提高,降低与随机序列结合的能力。核心酶与全酶的区别RNA聚合酶RNApolymerasescomeindifferentforms,butsharemanyfeaturesRNApolymerasesperformsessentiallythesamereactioninallcells1.识别启动子,核心酶通过结合不同的σ因子能够识别不同的启动子2.结合DNA使之解链,并具有解旋和重新螺旋化DNA的作用3.RNA聚合作用4.识别转录终止信号5.与转录因子相互作用调节转录速度6.在转录受阻时候进行自身调整,借助辅助因子回复和维持RNA的合成BacteriahaveonlyasingleRNApolymeraseswhileineukaryoticcellstherearethree:RNAPolI,IIandIII转录起始位点:新生RNA链第一个核苷酸对应的DNA上碱基，+1转录的起始与转录的频率:转录起始后RNA聚合酶通过启动子的时间代表该启动子的强弱，启动子强，通过的时间短，转录频率高；细菌RNApolymerase与转录相同的方向为下游，标记为+1，+2，+3……，与转录相反的方向为上游，标记为-1，-2，-3…；提纯被保护的片段后却发现，RNA聚合酶并不能重新结合或并不能选择正确的起始点，表明在保护区外可能还存在与RNA聚合酶对启动子的识别有关的序列。根据终止作用是否需要ρ因子（释放因子，是实现终止作用的蛋白质辅助因子），可以分为:转录单元:可被RNA聚合酶转录成完整的RNA的一段DNA序列包括启动子和终止子；细菌RNApolymerase依赖于ρ因子的终止子（弱终止子）依赖于ρ因子的终止子（弱终止子）模板链（templatestrand）:根据碱基互补的原则指导RNA合成的DNA链称为模板链，又叫反义链（antisensestrand）。1975年，Pribnow和Schaller将RNA聚合酶全酶与模板DNA结合后，用DNaseI降解DNA，得到41～44个核苷酸对的DNA片段。在原核中90%为嘌呤，A或G；“Crabclaw”shapeofRNAP

(TheshapeofDNApolis__)结合DNA使之解链，并具有解旋和重新螺旋化DNA的作用与转录因子相互作用调节转录速度其后果是合成一条鱼DNA链序列完全相同（除T/U）的RNA单链。结论:-10区有助于dsDNA解开，-35区有助于启动子与DNA聚合酶全酶的结合（sigma因子介导）。Activecentercleft序列分析发现，在被保护区内有一个由5个核苷酸组成的保守序列，是聚合酶结合位点，称为Pribnow区，其中央大约位于起点上游10bp处，所以又称为–10区。在某些细菌中含有识别不同启动子的σ因子,以适应不同生长发育阶段的要求,控制不同基因转录的起始。RNApolymerases的亚基细菌RNApolymeraseThecoreenzymealonesynthesizesRNAaabb’waab’wRPB3RPB11RPB2RPB1RPB6相同的颜色代表两个酶的同源区原核生物真核生物b“Crabclaw”shapeofRNAP

(TheshapeofDNApolis__)Activecentercleft启动子的结构和功能启动子是一段位于结构基因5’端上游区的保守的DNA序列,能活化RNA聚合酶,使之与模板DNA准确地相结合并具有转录起始的特异性。启动子位于转录起始位点（+1）上游,因此不被转录。-10区的发现1975年,Pribnow和Schaller将RNA聚合酶全酶与模板DNA结合后,用DNaseI降解DNA,得到41～44个核苷酸对的DNA片段。序列分析发现,在被保护区内有一个由5个核苷酸组成的保守序列,是聚合酶结合位点,称为Pribnow区,其中央大约位于起点上游10bp处,所以又称为–10区。其保守序列为TATAAT,位于-10bp左右,其中3′端的“T”十分保守。A.T较丰富,易于解链。它和转录起始位点I一般相距5bp。-35区的发现提纯被保护的片段后却发现，RNA聚合酶并不能重新结合或并不能选择正确的起始点，表明在保护区外可能还存在与RNA聚合酶对启动子的识别有关的序列。从噬菌体的左、右启动子PL及PR和SV40启动子的–35bp附近找到了另一段共同序列:TTGACA。与-10区序列相隔16-19bp。-10区和-35区在转录起始中的作用利用定点诱变技术突变启动子，研究-10、-35区的功能。结果:-10区的突变不影响RNA聚合酶与启动子的结合速度，但是降低双链DNA解链速度；-35区的突变降低RNA聚合酶与启动子的结合速度，但是不影响降低双链DNA解链速度。结论:-10区有助于dsDNA解开，-35区有助于启动子与DNA聚合酶全酶的结合（sigma因子介导）。－10区和－35区的最佳距离在原核生物中,－10区和－35区的最佳距离大约是16～19bp,17bp转录效率最高,约2个螺距,过大或过小都会降低转录活性。-10区和-35区之间的序列不重要,关键是距离。可能与RNAPol本身的大小和空间结构有关。结构典型,都含有识别（R）,结合（B）和起始（I）三个位点；序列保守,如-35序列,-10序列结构都十分保守；位置和距离都比较恒定；直接和多聚酶相结合；常和操纵子相邻；都在其结构基因的5端；决定转录的启动和方向。转录过程-起始（Initiation）转录起始:RNA聚合酶与dsDNA的结合启动子:位于结构基因5’-端上游区的DNA序列，能够活化RNA聚合酶，使之与模板准确结合转录起始位点:新生RNA链第一个核苷酸对应的DNA上碱基，+1转录开始的部位记做+1,称为转录起始点；与复制起始点（ori）不同,ori为一个区域,转录起始点为一个碱基；与转录相同的方向为下游,标记为+1,+2,+3……,与转录相反的方向为上游,标记为-1,-2,-3…；转录的位点没有0。起始阶段三步骤:1. 封闭二元复合物closedcomplex2. 开放二元复合物opencomplex3. 稳定三元复合物StableternarycomplexRNA聚合酶含盖在起始点的上游70bp处，这种结构由DNA.RNA聚合酶构成，叫做二元闭合复合体。当DNA双链变成单链时，称为二元开放复合体，这个阶段是不可逆的。解旋区域：－9---＋13。转录泡。聚合酶全酶的σ因子从复合物上释放，合成9nt的RNA，由RNA聚合酶-DNA-新生RNA形成的复合物为三元复合物。此时RNA聚合酶一直处于启动子区，转录进入延伸阶段。Transcriptionbubble三元复合物的去向流产式起始:合成并释放2—9个核苷酸的短RNA转录物；形成转录延伸复合物:尽快释放亚基，而后尽快通过上游启动子区，延伸RNA链至完成转录。转录的起始与转录的频率:转录起始后RNA聚合酶通过启动子的时间代表该启动子的强弱，启动子强，通过的时间短，转录频率高；反之转录频率低。转录过程-延伸（Elongation）RNA聚合酶沿模板DNA移动,按照5’－3’方向合成RNA链的过程。RNA聚合酶覆盖35--40bp区域,解旋区域大概是17bp,RNA合成时与DNA形成DNA－RNA杂合体,DNA重新螺旋之后,RNA被挤出DNA－RNA杂合体,仅在3‘端有20—30nt与酶或DNA结合。原核生物的RNA聚合酶（核心酶）按照5’－3’方向延伸RNA链,解旋区域也随之移动,即边解旋,边合成,边重新螺旋。转录过程-终止（Termination）RNA聚合酶延伸到终止位点时，转录结束，包括转录泡瓦解，RNA聚合酶和DNA.RNA分开等。终止子即转录终止位点，即提供终止信号的DNA序列。根据终止作用是否需要ρ因子（释放因子，是实现终止作用的蛋白质辅助因子），可以分为： 不依赖ρ因子的终止子（强终止子） 依赖于ρ因子的终止子（弱终止子）不依赖

因子的终止子终止位点上游一般存在一个富含GC碱基的二重对称区,RNA形成发夹结构；在终止位点前面有一段由4-8个A组成的序列,RNA的3’端为寡聚U。发夹式结构和寡聚U的共同作用使RNA从三元复合物中解离出来。该类终止子也有回文区，但是不富含GC，回文结构后无寡聚U序列，主要存在于噬菌体，细菌中少见；核心酶与DNA序列结合是随机的，平均结合常数是2×1011；模板链（templatestrand）:根据碱基互补的原则指导RNA合成的DNA链称为模板链，又叫反义链（antisensestrand）。RNA聚合酶覆盖35--40bp区域，解旋区域大概是17bp，RNA合成时与DNA形成DNA－RNA杂合体，DNA重新螺旋之后，RNA被挤出DNA－RNA杂合体，仅在3‘端有20—30nt与酶或DNA结合。Transcriptionbubble与转录相同的方向为下游，标记为+1，+2，+3……，与转录相反的方向为上游，标记为-1，-2，-3…；转录的不对称性:在RNA的合成中，DNA的二条链中仅有一条链可作为转录的模板，称为转录的不对称性。产生的RNA不需要与DNA模板结合；opencomplex不需引物，能够起始新链的合成，而且保留5‘端3磷酸。转录的起始与转录的频率:转录起始后RNA聚合酶通过启动子的时间代表该启动子的强弱，启动子强，通过的时间短，转录频率高；把起点5’末端的序列称为上游（upstream），把其3’末端的序列称为下游（downstream）。流产式起始:合成并释放2—9个核苷酸的短RNA转录物；在原核中90%为嘌呤，A或G；利用定点诱变技术突变启动子，研究-10、-35区的功能。其后果是合成一条鱼DNA链序列完全相同（除T/U）的RNA单链。破坏终止位点RNA的茎-环结构；转录的不对称性:在RNA的合成中，DNA的二条链中仅有一条链可作为转录的模板，称为转录的不对称性。发夹式结构和寡聚U的共同作用使RNA从三元复合物中解离出来。编码链（codingstrand）:与mRNA序列相同的DNA链称为编码链，又叫有义链（sensestrand）。结合最弱的碱基配对A:U

解链更容易终止效率与二重对称序列和寡聚U的长短有关,长度长效率高依赖于

因子的终止子因子:六聚体蛋白，具有NTP酶活和解螺旋酶活，能水解各种核甘三磷酸促使新生RNA链从三元转录复合物中解离出来，从而终止转录。各亚基具有ATPase结构域和RNA结合域。RhofactorpursuesRNApolymerasealongtheRNAandcancauseterminationwhenitcatchestheenzymepausingatarho-dependentterminator.Howdoesrhofactorwork?依赖于

因子的终止子作用机制该类终止子也有回文区,但是不富含GC,回文结构后无寡聚U序列,主要存在于噬菌体,细菌中少见；因子结合于转录物终止位点上游新生RNA链的5‘端的装载位点,6个亚基组成六聚体；结合RNA之后激活ATPase活性,水解ATP推动因子六聚体沿RNA5-3方向靠近转录泡,速度比RNAPOL快；当RNA聚合酶到达终止子区域,转录产物形成发夹结构,使RNApol暂停延伸,因子追上转录泡；终止子与因子共同作用使转录终止；因子的RNA-DNA解螺旋酶活性使转录产物从DNA模板上释放出来。抗终止阻止或影响终止子的形成或作用,使RNA聚合酶能够顺利通过该区域继续转录。