生物化学 课件 第12章 基因工程与常用的分子生物学技术

生物化学第十二章基因工程与常用的分子生物学技术目录第一节基因工程第二节常用的分子生物学技术学习目标1．掌握基因工程的概念。2．熟悉基因工程的基本原理和临床应用；核酸杂交、印迹和PCR技术的原理和临床应用。3．了解基因诊断、基因治疗等新医疗方法；基因测序和基因芯片技术。第一节基因工程一、基因工程的概念基因工程（geneticengineering）又称基因拼接技术或DNA重组技术，即将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法进行改造和重新组合，构建杂种DNA分子，然后导入微生物或真核细胞内，使重组基因在细胞内克隆、表达，产生出人类需要的基因产物，或者改造、创造新特性的生物类型。核心内容：DNA片段的重组和细胞内克隆特点跨物种性基因工程将外源DNA分子进行重新组合且引入到新的寄主生物中进行繁殖，使之具有了跨越天然物种屏障的能力，克服了固有的生物种间限制，扩大和带来了定向改造生物的可能性，这是基因工程的最大特点。无性扩增少量的外源目的基因在寄主细胞中可大量扩增和高水平表达。二、基因工程的原理和过程（一）基因工程的基本工具限制性核酸内切酶简称限制酶，是进行DNA分子剪切的“手术刀”，能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，使较大的DNA分子成为一定大小的DNA片段。二、基因工程的原理和过程（一）基因工程的基本工具DNA连接酶是DNA分子进行拼接的“针线”，恢复被限制酶切开了的两个核苷酸之间的磷酸二酯键，将DNA片段进行连接、重组。二、基因工程的原理和过程（一）基因工程的基本工具载体载体是重组DNA分子的“运输车”，需具备下列条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存；②具有一至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段插入；③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。基因工程常用的载体有：质粒、噬菌体和动、植物病毒等。（二）基因工程的基本过程完整DNA克隆过程包括五大步骤：①目的DNA的分离获取（分）；②载体的选择与准备（选）；③目的DNA与载体的连接（连）；④重组DNA转入受体细胞（转）；⑤重组体的筛选及鉴定(筛）。图12-1以质粒为载体的DNA克隆过程三、基因工程的应用（一）植物基因工程（二）动物基因工程（三）医药基因工程生物化学第十二章基因工程与常用的分子生物学技术目录第一节基因工程第二节常用的分子生物学技术学习目标1．掌握基因工程的概念。2．熟悉基因工程的基本原理和临床应用；核酸杂交、印迹和PCR技术的原理和临床应用。3．了解基因诊断、基因治疗等新医疗方法；基因测序和基因芯片技术。第二节常用的分子生物学技术一、核酸分子杂交和印迹技术核酸分子杂交是指利用DNA复性原理，把不同来源的DNA单链或DNA与RNA混合，如单链分子间有碱基配对关系，则可特异性地结合形成杂化双链的特性。由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的灵敏性，它已成为分子生物学中最常用的基本技术，结合印迹技术和探针技术，可广泛应用于基因克隆的筛选，酶切图谱的制作，基因序列的定量和定性分析及基因突变的检测等。（一）探针技术探针（probe)探针是指用放射性核素、生物素或荧光物质等可检测标志物标记的已知DNA或RNA片段。它具有特定的序列，能够与待测的核酸片段依据碱基互补原理结合，因此可以用于检测核酸样品中存在的特定核酸分子。核酸探针根据其来源和性质可分为cDNA探针、基因组探针、寡核苷酸探针、RNA探针等。利用核酸分子杂交的原理，用特异的基因探针去识别目的基因中特异碱基序列，并与目的基因结合，产生杂交信号，从而进行目的基因检测的技术称为探针技术。（二）印迹技术印迹（blotting)将各种生物大分子从凝胶转移到一种固定基质上的过程，类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因此这一技术被称为“blotting”，译为印迹技术。DNA印迹技术由Southern于1975年创建，称为Southern印迹技术RNA印迹技术正好与DNA相对应，故被称为Northern印迹杂交与此原理相似的蛋白质印迹技术则被称为Westernblotting图12-6DNA、RNA和蛋白质印迹技术示意图二、PCR技术PCRPCR即聚合酶链式反应，是一种利用DNA变性和复性原理在体外进行特定DNA片段高效扩增的化学反应，可以在几个小时内特异性地将极微量的目的基因DNA片段成百万倍地扩增放大。该技术于1985年由K.Mullis发明，具有高敏感、高特异、高产率、可重复、快速简便等优点，给分子生物学研究领域带来了实验方法和科学技术上的一场巨大革命，极大地推动了分子生物学以及生物技术产业的发展，成为分子生物学与医学的支撑技术。Mullis也因此于1993年荣获诺贝尔化学奖。（一）PCR技术的工作原理（二）几种常用的PCR衍生技术逆转录PCR（RT-PCR）RT-PCR是一种将RNA逆转录合成cDNA与PCR技术结合起来、分析基因表达的一种快速灵敏的方法，其原理是以RNA为模板在逆转录酶作用下合成互补DNA（complementaryDNA，cDNA），再以cDNA为模板PCR扩增两段引物之间的目的基因。主要用于对基因表达信息进行检测或定量分析，还可用于鉴定已转录序列是否发生突变及呈现多态性，克隆mRNA的5'和3末端序列，从非常少量的mRNA样品构建大容量的cDNA文库。（二）几种常用的PCR衍生技术原位PCR（insituPCR）原位PCR就是将PCR技术的高效扩增与原位杂交的细胞定位结合起来，将PCR反应体系渗透到目标组织和细胞中，直接在细胞的靶DNA所在的位置上进行基因扩增，从而在组织细胞原位检测单拷贝或低拷贝的特定的DNA或RNA序列。原位PCR不但可以特异性检测靶DNA，而且还可以进行靶序列的细胞定位或组织定位，更有利于探讨靶DNA与细胞之间的关系。该技术自1992年由Nuovo等建立以来，得到迅速发展，目前已被成功地用于肿瘤发生学、胚胎学鉴定和定位许多低丰度靶基因，以及病毒、细菌、寄生虫等的检测。（二）几种常用的PCR衍生技术实时定量PCR常规PCR是在反应终点检测产物含量，经过多次循环扩增后的产物堆积将影响对原有模板含量差异的准确判断。实时定量PCR就是引入荧光标记分子，通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测，计算PCR产物量，消除了产物堆积对定量分析的干扰，从而实现对起始模板的准确定量分析，故也被称为实时荧光定量PCR或荧光定量PCR。定量PCR技术实现了mRNA、miRNA及其他非编码的