组织保护剂对病毒核酸与豚鼠皮肤组织样本RNA的保存效果探究

艹艹艹艹艹艹艹艹艹艹艹艹艹艹艹艹艹艹艹艹艹艹艹艹艹艹生物技术进展生物技术进展2024年第14卷第1期60~65CurrentBiotechnologyISSN2095‑2341SpecialForumonDevelopmentand艹艹艹艹艹艹艹艹艹艹艹艹艹艹艹艹艹艹艹艹艹艹艹艹艹组织保护剂对病毒核酸与豚鼠皮肤组织样本RNA的保存效果探究李华1，徐兰举1，黄学亮2，王亚如3，刁立琴3*，于月欣1*1.河北纳科生物科技有限公司，石家庄050035；2.河北以岭医院，石家庄050090；3.河北省药品医疗器械检验研究院，石家庄050227摘要：病毒核酸和生物组织样本RNA容易受到外部环境的影响，极易发生降解，造成实验结果产生严重偏差。以病毒核酸与豚鼠皮肤组织样本RNA为研究对象，探究组织保护剂保存它们在不同温度放置不同时间后，对病毒载量以及豚鼠皮肤组织样本中RNA的保护效果。结果发现，在4℃保存30d，25℃保存7d或37℃保存24h后，与初始病毒核酸量相比储存组相比较，组织保护剂组与市售RNAlater组均可以保持豚鼠皮肤组织中样本RNA的提取量和纯度，差异无统计学意义（P>0.05）。结果表明，组织保护剂定时间，不影响病毒核酸的病毒载量以及豚鼠皮肤组织样本RNA的提取量和纯度，使样本保存更简便高效。GuineaPigSkinTissueSamplesLIHua1，XULanju1，HUANGXueliang2，WANGYaru3，DIAOLiqin3*，YUYuexin1*基金项目：河北省引进国外智力项目。联系方式：李华E-mail163.com*通信作者：刁立琴E-mail:768624340@；于月欣E-mail:359274691@李华，等：组织保护剂对病毒核酸与豚鼠皮肤组织样本RNA的保存效果探究61在分子生物学实验与检测过程中，生物样本的保存对于检测结果的真实性和可重复性至关重要。储存后的生物材料应在分析前具有最小的变化，以便为研究人员提供高质量的样品，从而得出可靠以及可重复的实验或检测结果［1］。冷冻组织是目前现代生物学检测中最常用的生物样本，样本的冷冻储存和运输过程中通常会选择液氮作为储存剂［2］。液氮的低温特性是样本保存的理想条件，但其可能会导致接触者的活组织产生快速冻结现象。快速冻结现象被称为“低温烧伤”，会造成参与样品存储和检测的实验人员严重冻伤［3］。除液氮外，干冰也是进行生物样品低温运输的常用方式。但干冰同样存在易冻伤的危险，且其易升华，放置在普通密闭容器内有爆炸的危险。当大量使用干冰时，要保持环境的通风，防止大量气体挥发造成人员窒息。液氮和干冰的危险性质以及高昂的运输成本极大地限制了其常规使用［4］。此外，冷冻样品往往会导致生物样本细胞内外的冷冻损伤和渗透应激［5］。因此，探究易于实施、成本低廉且更安全的样品储存运输方式对生物样品的结果检测至关重要。很多临床手术样本很难及时冻存到液氮或者干冰，甚至-80℃冰箱中，因此RNA样本的采集、运输、保存及使用困难。RNAlater是由Ambion公司研发的组织保护剂产品。RNA保护剂的问世解决了临床组织样品中RNA极易降解的难题。本文研发了一种新配方的组织保护剂，探究了其对病毒核酸载量的保护效果，比较了其与市售RNAlater产品以及常规储存方式对豚鼠皮肤组织样本RNA提取量和纯度的影响，旨在为实验生物样品RNA的保存与运输提供一种安全简便的选择。1材料与方法购自青岛康大爱博生物科技有限公司。许可证号：1.2主要试剂与仪器组织保护剂属于本公司自研产品，其组成成分如下：在去离子水中，充分溶解40%硫酸铵、5%氯化钠、1mg·L-1RNase抑制剂混合液、0.1%DEPC水。待所有试剂充分溶解后，使用有机酸（HCl与H2SO4等量混合调节溶液pH至赛默飞公司，91226297）、RNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司，DP419）、DEPC水（北京索莱red（美国USEVERBRIGHTINC公司，IS0429）、琼loadingbuffer（上海碧云天生物技术有限公司，D0071）、50×TAE缓冲溶液（北京索莱宝科技有限实验涉及仪器：NanoDrop×2000c分光光度计仪器开发有限公司）、琼脂糖电泳仪（美国Bio-rad1.3.1核酸病毒的病毒载量检测本研究收集了20例新型冠状病毒感染患者的核酸病毒，将其放入组织保护剂中。核酸病毒管在4℃、室温（25℃)和37℃放置不同时间后，送河北以岭医院检验科PCR实验室检测。与初始核酸病毒载量相比较，核酸病毒放置不同时间后病毒载量的改变情况。本研究共设置以下分组：4℃条件下，24h组。1.3.2皮肤组织样本RNA提取量、纯度和降解情况检测本研究取豚鼠皮肤组织样本，放入液氮组、市售RNAlater液组和组织保护剂组中。3个实验组的组织样本在4℃放置30d、25℃放或37℃放置24h后，称量20mg豚鼠皮肤组织样本，检测不同保存方式在保存相同时间后组织样本RNA的降解情况。使用组织研磨器在液氮中研磨组织块，然后按照RNA提取试剂盒的步骤提取组织细胞RNA。提取RNA后，进行RNA提取62生物技术进展CurrentBiotechnology62量和纯度的检测。本研究进一步利用1.2%琼脂糖凝胶电泳进行RNA降解情况的检测，各组取2.5μLRNA与泳，观察RNA条带的情况。1.3.3统计方法本研究中所有实验数据均使用SPSS20.0进行统计分析，使用均数±标准差表示。t检验进行组间数据的统计学分析，P<0.05认为差异具有统计学意义。2结果与分析2.1核酸病毒载量的检测合适的样本保存液能够保证病毒的检出率，避免发生漏检［6］。在4℃条件下，20份新型冠状组病毒核酸的提取，通过实时荧光PCR检测病毒载量的变化，结果如表1所示，20份病毒样本的循Ct值均在初始Ct值附近波动，各处理Ct值之间无统计学差异（P>0.05证实本组织保护剂在4℃条件下可以保存病毒30d，对病毒核酸具有较好的保护效果。下，组织保护剂可以保存病毒7d。的变化情况。与0h组相比较，各实验组的Ct值的条件下，组织保护剂对病毒载量的保存效果可以长达24h。表14℃放置不同时间后病毒核酸载量的比较组别21d30dt P 表225℃放置不同时间后病毒核酸载量的比较组别t P 表337℃放置不同时间对病毒核酸载量的比较组别24ht P 2.2皮肤组织样本的RNA检测RNA很容易被RNA酶降解，因此需要一种高效、无害的方法来优化RNA的保存和提取［7］。RNA的浓度和纯度是进行RNA样本质量评价李华，等：组织保护剂对病毒核酸与豚鼠皮肤组织样本RNA的保存效果探究63的主要标准和进行后续研究的必要前提［8］。本研究取豚鼠的皮肤组织，放入液氮、市售RNAlater和组织保护剂中，市售RNAlater和组织保护剂组在4℃放置30d后，取20mg组织提取RNA，比较各组组织RNA的提取量和纯度。如图1A所示，组织保护剂保存样本的RNA提取量与液氮保存或市售RNAlater保存无统计学差异RNA条带均存在28S和18S条带，且28S条带组所提RNA的完整性好（图1B）。本研究检测了各组样本RNA在A260/A280吸光度值、A260/A230吸光度值的改变。液氮组A260/A280吸光度均值为1.91、A260/A230吸光度均值为2.07；市售RNAlater组的A260/A280吸光度均值为1.93、A260/A230吸光度均值为2.06；组织保护剂组的A260/A280吸光度均值为1.96、A260/A230吸光度均值为2.07。如图1C~D所示，各实验组RNA的A260/A280吸光度值与A260/A230吸光度值之间无显著差异A：各组提取的RNA提取总量；B：各组提取总RNA的琼脂糖凝胶图谱，M—DNAmaker；C~D：各组提取的RNA纯度图14℃放置30d后不同处理对RNA保护的验证结果图2为豚鼠皮肤组织样本在25℃放置7d的结果。组织保护剂保存样本的RNA提取量、A260/A280吸光度值和A260/A230吸光度值与液氮保存组或A：各组提取的RNA提取总量；B：各组提取总RNA的琼脂糖凝胶图谱，M—DNAmaker；C~D：各组提取的RNA纯度图225℃放置7d后不同处理对RNA保护的验证结果本研究取豚鼠的皮肤组织在各实验组中37℃放置24h后，取20mg组织进行组织中RNA的提取。如图3所示，与液氮保存组或市售RNAlater组相比较，组织保护剂保存样本的RNA在提结果表明，本公司自研生产的组织保护剂与进口市售RNAlater具有相近的RNA保护效果，可以作为其替代品应用。64生物技术进展CurrentBiotechnology64A：各组提取的RNA提取总量；B：各组提取总RNA的琼脂糖凝胶图谱，M—DNAmaker；C~D：各组提取的RNA纯度图337℃放置24h后不同处理对RNA保护的验证结果3讨论随着我国生命科学领域的迅速发展，更多研究者开始注重生物资源的利用。此时，生物样本的质量对生物科学领域的研究愈发重要［9］。在医学研究中，生物样本是联系分子信息与疾病发现的桥梁［10］。无论是用于研究还是治疗，细胞和组织低温保存的整个过程都充满了风险［11］。生物样本的保存环境和运输条件会严重影响样本质量，对检测结果至关重要［12］。在心脏移植手术中，心脏保存液是一个非常重要的因素，其保存效果直接影响着移植心脏的功能状态、患者的临床预后及远期生活质量［13］。本研究将核酸病毒样本以及豚鼠皮肤的组织样本保存在自研的组织保护剂中，结果证实组织保护剂对病毒载量以及皮肤组织样本RNA具有很好的保护效果，能够满足安全高效运输样本的要求。病毒样本的保存和运输条件对其检测结果的准确性至关重要［14］。本研究探究了组织保护剂对核酸病毒的保存效果，结果证实核酸病毒在4℃条件下放置24h，Ct值均在初始Ct值附近波动，证实组织保护剂对病毒载量具有很好的保护效果，有助于检测的高效性和准确性。随着分子生物技术在生物学、医学等方面的广泛应用，从生物实验材料成功提取总RNA是保证后续实验正常进行的必要前提［15］。豚鼠皮肤组织样本RNA的以及37℃放置24h后，组织保护剂保存样本RNA的提取量、RNA条带完整性、纯度与液氮保存组及市售RNAlater保存组均无统计学差异。上述结果表明，组织保护剂与市售RNAlater均具有对RNA质量和纯度的保护效果。上述结果表明河北纳科生物科技有限公司生产的组织保护剂对核酸病毒载量以及豚鼠皮肤组织中的RNA具有良好的保护效果。在不需液氮的情况下，组织保护剂对豚鼠皮肤组织的RNA具有良好的保护效果，这将降低实验的研发成本并保护研发人员的安全。此外，本公司组织保护剂配方中95%原料来自国产原料，极大降低了实验成本。综上所述，本公司成功开发生产的组织保护剂，能够代替传统的冷冻保存组织样本，安全有效降低实验样本的储存成本。［1］IMRALIA,HUGHESCS,COETZEEAS,etal..Validationof［3］MEHTAR,BARANOVAA,BIRERDINCA.Do-It-Yourself［6］王丰,叶俊炜,於林芬.病毒保存液相关性能研究[J].中国消李华，等：组织保护剂对病毒核酸与豚鼠皮肤组织样本RNA的保存效果探究65WANGF,YEJW,YULF.Studyontheperformanceofvirus［7］DANIELSENPL,KOUDAHLV,CHRISTENSENB,etal..［8］杨秀荣,王庆容,刘惠茹.保存温度对黄颡鱼肝组织总RNAYANGXR,WANGQR,LIUHR.Effectofstoragetempera‑［10］赵佐舜,刘宝林.低温保存技术在生物样本库中的应用[J].165-174.［12］赵同香,蒋向明,王海英,等.探讨药物临床试验生物样本流通环节常见问题及风险前置化管理措施[J].中国食品药ZHAOTX,JIANGXM,WANGHY,etal..Discussionof［13］李勇男.不同心脏保存液对供体心脏保护效果评价与供体心脏中冷诱导RNA结合蛋白作用机制的研究[D].兰州:兰州大学,2019.［14］史春丽