生物制药工艺学第二节蛋白多肽药物2007

多肽蛋白类药物多肽类药物分类：多肽激素垂体多肽激素促皮质素（ACTH）、促黑激素（MSH）、脂肪水解激素（LPH）催产素（OT），加压素（AVP）等下丘脑激素促甲状腺激素释放激素（TRH）、生长素抑制激素（GRIF）、促性腺激素释放激素（LHRH）甲状腺激素甲状旁腺激素（PTH）、降钙素（CT）胰岛激素胰高血糖素胰解痉多肽胃肠道激素胃泌素、胆囊收缩素－促胰酶素（CCK-PZ）、肠泌素、肠血管活性肽（VIP）、抑胃素（GIP）、缓激肽、P物质胸腺激素胸腺素、胸腺肽、胸腺血清因子多肽类细胞生长调节因子表皮生长因子（EGF），转移因子（TF），心钠素（ANP）等。含有多肽成分的其它生化药物骨宁、眼生素、血活素、氨肽素、妇血宁、脑氨肽、蜂毒、蛇毒、胚胎素、助应素、神经营养素、胎盘提取物、花粉提取物、脾水解物、肝水解物、心脏激素等。多肽类药物分类：蛋白质激素

垂体蛋白质激素生长素（GH），催乳激素（PRL），促甲状腺素（TSH），促黄体生成激素（LH），促卵泡激素（FSH）。

促性腺激素人绒毛膜促性腺激素（HCG），绝经尿促性腺激素（HMG），血清性促性腺激素（SGH）。

胰岛素及

其他蛋白质激素胰岛素，胰抗脂肝素，松弛素，尿抑胃素。血浆蛋白质白蛋白，纤维蛋白溶酶原，血浆纤维结合蛋白（FN）,免疫丙种球蛋白，抗淋巴细胞免疫球蛋白，Veil’s病免疫球蛋白，抗－D免疫球蛋白，抗－HBs免疫球蛋白，抗血友病球蛋白，纤维蛋白原，抗凝血酶Ⅲ，凝血因子Ⅷ，凝血因子Ⅸ。蛋白质类药物分类蛋白质类细胞生长调节因子干扰素α、β、γ（IFN）,白细胞介素1～7（IL），神经生长因子（NGF），肝细胞生长因子（HGF），血小板衍生的生长因子（PDGF），肿瘤坏死因子(TNF)，集落刺激因子(CSF)，组织纤溶酶原激活因子(tPA)，促红细胞生成素(EPO)，骨发生蛋白（BMP）。粘蛋白胃膜素、硫酸糖肽、内在因子等。胶原蛋白明胶、阿胶等碱性蛋白质硫酸鱼精蛋白蛋白酶抑制剂胰蛋白酶抑制剂凝集素PHA、ConA蛋白质类药物分类多肽化学合成概述合成原理：是一个重复添加AA的过程，一般自C端向N端合成。合成方法：（1）液相合成（2）固相合成（1963年R.B.Merrifield

创立，并因此获1984年获诺贝尔化学奖）1953年Du.Vigneaud等合成催产素（oxytocin,OXT，9AA单链肽）1963年合成促肾上腺皮质激素（ACTH，39AA单链肽）1965年中国科学家合成了胰岛素（Insulin，51AA双链肽）多肽合成的主要步骤

氨基的保护和羧基的活化羧基的保护和氨基的活化接肽和去保护基氨基保护基

苄氧羰基——强酸脱除叔丁氧羰基（BOC）——三氟乙酸（TFA）脱除

9-芴甲氧羰基（Fmoc）——碱脱除

多肽的固相合成(Fmoc保护法)

（1978年改进的方法，避免了强酸处理）原料选择上清破碎提取沉淀

变性复性蛋白质纯化蛋白质药物－SeparationandPurification纯度活性鉴定合格不合格精品

发酵

生物组织

Protein--Separation原则：富含所需蛋白质多肽成分的，易于获得、易于提取、无害（原核、真核发酵；生物组织）注意事项：种属、发育生长阶段、原料的环境、解剖部位、生物状态溶解性稳定性合适的溶剂原料选择提取Protein--Purification纯化

根据目的蛋白与杂质之间的差异进行纯化。1.根据蛋白质的pI的不同进行纯化，其方法有：1）pI沉淀法

2）pI沉淀法与盐析法相结合3）等电聚焦法

2.蛋白质分子形状和大小的不同进行纯化，其方法有

1）凝胶过滤

2）超滤法

3）离心法

4）透析法3.蛋白质的溶解度不同进行纯化，其方法有：

a)盐溶与盐析法

b）结晶法

c）有机溶剂沉淀法4.蛋白质电离性质不同进行分离：离子交换法5.蛋白质功能专一性不同进行纯化：亲和层析法、假亲和层析法6.蛋白质在溶剂系统中分配不同进行纯化：萃取法7.蛋白质的选择性吸附的性质进行纯化：吸附法8.蛋白质的其他特殊性质进行纯化分离纯化方法的选择1.分离纯化的早期使用方法的选择特点：提取液中的物质十分复杂，目的蛋白浓度较稀。方法选择原则：低分辨能力到高分辨能力，而且负荷量较大为合适。2.各种分离纯化方法的使用程序原则：相同性质的纯化方法一般不重复使用。纯化方法顺序先后的安排上要考虑到有利于减少工序，提高效率。3.分离纯化后期的保护性措施4．对每一步骤方法的优势进行综合评价每一个分离纯化步骤方法的好坏，除了从分辨本领和重现性二方面考虑外，还注意方法本身的回收率的高低。纯化方法选择指南猪胰岛素牛胰岛素赖脯人胰岛素（礼来公司、速效Ins）

门冬胰岛素（诺和诺德公司、速效Ins）

甘精胰岛素

(安万特公司、长效Ins)人胰岛素（Insulin）B30A8;A10;B30

B28;B29B28A21;B31;B323DStructureofInsulin胰岛素二聚体（dimer）胰岛素六聚体（hexamer

）目前临床使用的胰岛素来源动物胰脏来源----经动物胰脏提取或适当提纯的猪、牛胰岛素

半合成胰岛素----以猪胰岛素为原料，酶修饰后得到人胰岛素重组DNA技术生产胰岛素----重组DNA技术生产人胰岛素、速效胰岛素、长效胰岛素1921年----从动物胰腺中提取出胰岛素，开创了人类胰岛素治疗的历史。

1926年----重结晶胰岛素

1930s----传统中、长效动物胰岛素

1970s----单峰胰岛素和单组分胰岛素

70年代末----半合成胰岛素

1982年----采用基因重组技术生产的人胰岛素正式上市。90年代至今----重组人胰岛素类似物成功研发上市，包括超短效和长效人胰岛素类似物。动物来源的胰岛素（28种）药品名称生产企业药品名称生产企业ILETINILILLYNPHPURIFIEDPORKISOPHANEINSULINNOVONORDISKINCILETINIILILLYPROTAMINEZINC&ILETINI(BEEF-PORK)LILLYINSULINNOVONORDISKINCPROTAMINEZINCANDILETINIILILLYINSULININSULATARDNPHNORDISKNOVONORDISKINCPROTAMINEZINCANDILETINII(PORK)LILLYINSULINNORDISKMIXTARD(PORK)NOVONORDISKINCPROTAMINEZINCINSULINBRISTOLMYERSSQUIBBLENTARDNOVONORDISKINCREGULARILETINIILILLYLENTENOVONORDISKINCREGULARILETINII(PORK)LILLYLENTEILETINIILILLYREGULARPURIFIEDPORKINSULINNOVONORDISKINCLENTEILETINII(PORK)LILLYREGULARINSULINNOVONORDISKINCLENTEINSULINNOVONORDISKINCSEMILENTENOVONORDISKINCNPHILETINI(BEEF-PORK)LILLYSEMILENTEINSULINNOVONORDISKINCNPHILETINIILILLYULTRALENTENOVONORDISKINCNPHILETINII(PORK)LILLYULTRALENTEINSULINNOVONORDISKINCNPHINSULINNOVONORDISKINCVELOSULINNOVONORDISKINC半合成来源的胰岛素（5种）药品名称生产企业INSULATARDNPHHUMANNOVONORDISKINCMIXTARDHUMAN70/30BAYERPHARMSNOVOLIN70/30NOVONORDISKINCNOVOLINLNOVONORDISKINCNOVOLINNNOVONORDISKINC基因重组来源的胰岛素（27种）药品名称生产企业药品名称生产企业APIDRASANOFIAVENTISUSLANTUSSANOFIAVENTISUSEXUBERAPFIZERLEVEMIRNovoNordisk

HUMALOGLILLYMIXTARDHUMAN70/30BAYERPHARMSHUMALOGMIX50/50LILLYNOVOLIN70/30NovoNordiskHUMALOGMIX75/25LILLYNOVOLINLNOVONORDISKINCHUMALOGPENLILLYNOVOLINNNOVONORDISKINCHUMULIN50/50LILLYNOVOLINRNOVONORDISKINCHUMULIN70/30LILLYNOVOLINR（Purified）NOVONORDISKINCHUMULIN70/30PENLILLYNOVOLOGNOVONORDISKINCHUMULINBRLILLYNOVOLOGMIX70/30NOVONORDISKINCHUMULINLLILLYVELOSULINBRNOVONORDISKINCHUMULINNLILLYVELOSULINBRHUMANNOVONORDISKINCHUMULINRLILLYHUMULINULILLYHUMULINRPENLILLY通化东宝

1998年12月研制出中国第一支基因重组胰岛素“甘舒霖”

甘舒霖®

R--常规重组人胰岛素注射液甘舒霖®

N--低精蛋白重组人胰岛素注射液甘舒霖®30R--30/70混合重组人胰岛素注射液（

30%常规重组人胰岛素和70%低精蛋白重组人胰岛素）深圳科兴苏泌啉--常规重组人胰岛素注射液苏泌啉恩--低精蛋白重组人胰岛素注射液

徐州万邦

万邦林--常规重组人胰岛素注射液

万苏林—猪胰岛素制剂胰岛素国内主要生产厂家其他（持有药品注册证）---南京新天生物化学制药有限公司、华西医科大学制药厂、上海第一生化

制药厂、武汉生化制药厂等临床用胰岛素分类普通胰岛素：从动物胰脏中提取人胰岛素传统中长效胰岛素

长效人胰岛素类似物速效人胰岛素类似物非注射胰岛素

传统中长效胰岛素制剂

低精蛋白锌胰岛素：胰岛素、鱼精蛋白和锌的结晶。

例：礼来公司，

Humulin

N(rDNA、大肠杆菌)

诺和诺德，

NovolinN(rDNA、酿酒酵母)

胰岛素锌混悬液：精蛋白锌胰岛素与常规胰岛素的混悬液

例：礼来公司，Humulin30/70(30%常规胰岛素，70%精蛋白锌胰岛素)

Humulin50/50

诺和诺德，

Novolin30/70

Novolin50/50缺陷：作用时间少于24小时作用峰值明显，夜间低血糖危险性高吸收不稳定结霜现象，由于温度过冷或过热导致胰岛素再玻璃瓶壁沉淀，丧失活性速效胰岛素特点：起效快，皮下注射后15分钟起效。达峰快，注射后15分钟起效，30～60分钟达到药效高峰。药效维持时间短，大约在3小时左右（2～4小时）。药代动力学特点与进餐后人体内源性胰岛素分泌十分相似，能够很好地控制当餐后血糖而且不容易发生低血糖。起效时间达峰时间峰持续时间作用消除时间常规皮下Ins:30-90min1.5-2.5h2-4h6-8h生理Ins：0-20min30-45min2-3h3-4h

B26-30对于胰岛素结合于胰岛素受体的功能无关，但是对胰岛素形成二聚体有关的结构特点。因此对此区段进行修饰将产生一些自聚合能力下降但是与胰岛素受体结合能力不变的新型速效胰岛素类似物。研制机理已上市药物：

Lispro

、

Aspart、Apidra

Lispro

（赖脯胰岛素，Humalog®）是第一个用于临床的速效胰岛素类似物,由美国礼来公司研制生产，将人胰岛素的B28与B29位的氨基酸对换。。

Aspart（门冬胰岛素，Novolog®）由丹麦诺和诺德公司研制生产，结构与人胰岛素的区别在于用天冬氨酸取代了B链28位上的脯氨酸。APIDRA（赖谷胰岛素，Apidra®）安万特公司研制，以赖氨酸和谷氨酸分别取代了人胰岛素B3位的天冬氨酸和B29位的赖氨酸。长效胰岛素-人胰岛素类似物1.

甘精胰岛素（glargine）：商品名Lantus®------甘氨酸替代胰岛素A链21位门冬氨酸、并在B链末端增加两个精氨酸。

●使胰岛素结合更多带正电的氨基酸残基，改变等电点，使等电点由5.4上升至中性。这样，胰岛素类似物在酸性条件下可溶，在生理的近中性条件下结晶。2.InsulinDetemir：商品名Levemir®

------胰岛素B链29位赖氨酸侧链通过酰基化连接一个N-16-烷基酸的14碳游离脂肪酸●该游离脂肪酸能与白蛋白结合，延缓与胰岛素受