粪便标本中肠道致病菌的的分离鉴定

实验十粪便标本中肠道致病菌的的分离鉴定实验目的和要求1、掌握脓汁标本中常见病原菌分离和鉴定方法2、掌握药物敏感试验3、掌握肠道杆菌分离和鉴定的一般步骤4.熟悉肠道杆菌鉴定生化反应和血清学反应实验内容一、脓汁标本中未知病原菌的分离和鉴定二、粪便标本中肠道致病菌的分离和鉴定一、标本中未知病原性球菌

的分离鉴定程序

直接涂片染色镜检:观察细菌形态、排列、染色性观察菌落性状、溶血性、色素血琼脂平板涂片、染色、镜检挑取可疑菌落生化反应测定纯培养致病性测定（甘露醇、凝固酶等）标本血液脑脊液肉汤增菌培养涂片染色镜检二、标本中未知肠道感染细菌

的分离鉴定程序

标本脓血便、肛拭子选择/鉴别培基生化反应血清学鉴定克氏双糖铁培养基,动力-靛基质-尿素半固体琼脂培养基玻片凝集试验SS平板,EMB平板设计性实验临床标本中病原菌的分离与鉴定设计性实验1.脓汁标本：脓拭子培养基：血琼脂平板其他：3%H2O2.（兔血浆）、生理盐水、革兰染液、玻片等2.痰标本：咽拭子培养基：血琼脂平板其他：生理盐水、10%胆盐、革兰染液、玻片等3.尿标本:尿液培养基:伊红美兰琼脂平板、克氏双糖铁斜面培养基、动力-靛基质-尿素半固体琼脂培养基其他:革兰染液、靛基质试剂、玻片等4.粪便标本:肛门拭子培养基:伊红美兰琼脂平板、克氏双糖铁斜面培养基、动力-靛基质-尿素半固体琼脂培养基其他:生理盐水、靛基质试剂、沙门菌多价血清、志贺菌多价血清、玻片等脓拭子

分离培养（血平板）革兰染色革兰染色触酶实验甘露醇实验方法:1、分离培养、观察菌落特征：浓汁标本，用分离划线方法接种血平板，37℃培养18-24h以后观察结果。重点：色素和溶血现象2.革兰染色、观察形态学特征：取可疑菌落少许涂片，革兰染色、镜检。结果观察1、菌落观察2.形态学观察（二）生化反应

触酶试验:

(-)(+)H2o2H2oo2氧化氢酶+菌种:可疑菌落试剂:3%过氧化氢方法:见右图结果:见右图甘露醇实验甘露醇生化反应管药敏实验浓汁标本可疑菌生长现象及生化反应结果观察形态学特征血平板生长现象触酶试验甘露醇试验结论:现象与论点、论据浓汁标本可疑菌药敏实验结果药品名称抑菌圈直径结论:咽拭子革兰染色革兰染色胆汁溶菌试验奥普托辛试验

荚膜染色（石炭酸复红单染）

分离培养（血平板）？粪便标本SS平板克氏双糖铁斜面培养基动力-半固体培养基生化反应管观察结果糖发酵试验玻片凝集试验革兰染色H2S试验尿液离心沉淀1500转,10分钟

分离培养（EMB平板）革兰染色革兰染色克氏双糖铁斜面培养基动力-靛基质-尿素半固体琼脂培养基观察结果观察结果观察结果完成靛基质试验方法:1、分离培养、观察菌落特征：粪便标本，用分离划线方法接种SS平板培养基37℃培养18-24h以后观察结果。重点：菌落颜色2.革兰染色、观察形态学特征：取可疑菌少许涂片，革兰染色、镜检。（一）SS琼脂平板（1）营养物质:牛肉膏、蛋白胨（2）抑制剂:胆盐、枸椽酸盐、煌绿等，抑制非致病菌的生长；但胆盐能同时促进病原菌的生长。（3）鉴别用糖:乳糖（4）指示剂:中性红（5）原理:肠道杆菌均能分解葡萄糖产酸，但大多数非致病菌又能分解乳糖产酸产气，而致病菌不分解乳糖。据此，在培养基中加入乳糖和指示剂，制成鉴别培养基。中性红为指示剂，酸性时呈现红色，碱性时呈淡黄色。

分离培养结果观察1、菌落观察2.形态学观察SS平板生化反应及动力试验

可疑菌落单糖发酵试验（葡萄糖、乳糖生化反应管）可疑菌落H2S试验药敏实验凝集反应为一种血清学反应。颗粒性抗原（完整的病原微生物或红细胞等）与相应抗体结合,在有电介质存在的条件下,经过一定时间,出现肉眼可见的凝集小块。参与凝集反应的抗原称为凝集原,抗体称为凝集素。可分为直接凝集反应和间接凝集反应两类。（一）实验原理1.直接凝集反应（原理）颗粒状抗原（如细菌、红细胞等）与相应抗体直接结合所出现的凝集现象。分为玻片法和试管法。（1）玻片法是一种定性试验方法。可用已知抗体来检测未知抗原。若鉴定新分离的菌种时,可取已知抗体滴加在玻片上,将待检菌液一滴与其混匀。数分种后,如出现肉眼可见的凝集现象,为阳性反应。该法简便快速,除鉴定菌种外,尚可用于菌种分型、测定人类红细胞的ABO血型等。肠道杆菌的血清学试验（玻片凝集试验）材料1.菌种:可疑菌落2.志贺菌标准诊断血清、载玻片、生理盐水方法血清生理盐水（三）方法（细菌菌型测定）1.取一块清洁载玻片，用记号笔划上记号，在一侧滴加标准的诊断血清一滴,另一侧滴加一滴生理盐水。2.用接种环无菌操作取适量的待测细菌,分别与标准诊断血清和生理盐水混均。3.静置室温下数分钟后，在白色背景下肉眼观察，也可显微镜观察。注意事项:（1）生理盐水、诊断血清要适量；（2）待检菌为肠道致病菌，注意无菌操作，玻片用后放入消毒缸内；（3）用接种环取待检菌时，不要挑取琼脂；待检菌与生理盐水、诊断血清