基因工程制药

基因工程制药

GeneticengineeringPharmaceutical生技1班10号陈晓萌主要内容基因工程制药概述。（了解）基因工程药物的生产过程。（了解）目的基因的获得。（掌握）（一）概述基因工程制药的诞生？为什么会出现基因工程制药？基因工程药物类别？基因工程制药的概念？基因工程制药的发展方向？基因工程的诞生世界上第一个重组DNA实验1972年斯坦福大学化学家P.Berg借助内切酶和连接酶将猴病毒SV40的DNA和大肠杆菌λ噬菌体的DNA在试管中连接在了一起,第一次成功地实现了DNA的体外重组。美国斯坦福大学生物化学系:PaulBerg教授(1980年诺贝尔化学奖获得者)第一个基因工程药物--人胰岛素世界第一个基因工程药物的诞生:美国Lilly公司的重组胰岛素投放市场——1982出现原因P14化学合成药物不能直达病灶,有时不可彻底治愈内源性生理活性物质作为药物材料来源困难造价高可能会产生排斥反应提取过程中难免有病毒感染……基因工程药物的主要类别P141.激素:胰岛素，生长激素2.免疫性蛋白:单克隆抗体，疫苗3.细胞因子:干扰素，白细胞介素4.酶类:尿激酶，超氧化歧化酶基因工程制药基因工程技术:将所要重组对象的目的基因插入载体，拼接，转入新的宿主细胞，构建成工程菌，实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术。（解释，粉笔）基因工程制药的发展方向开发针对神经系统、肿瘤、心血管系统、艾滋病及免疫缺陷等重大疾病的多肽、蛋白质和核酸等新生物技术产品。此方面开发重点将主要是干扰素、生长激素与T-PA（组织型纤溶酶原激活剂）等。选择一批市场前景好的生物技术产品及疫苗、诊断用单克隆抗体进行开发（如乙肝基因疫苗与单克隆抗体诊断试剂）主要内容基因工程制药概述。（了解）基因工程药物的生产过程。（了解）目的基因的获得。（掌握）（二）基因工程药物生产的过程获得目的基因组建重组质粒构建工程菌（或细胞）除菌过滤产物分离纯化培养工程菌半成品检定成品检定包装基因工程药物生产的上游和下游上游:主要指目的基因分离、工程菌（或细胞）构建，最主要的就是目的基因的表达。下游:主要指从工程菌（或细胞）的大规模培养一直到产品的分离纯化、质量控制等。主要内容基因工程制药概述。（了解）基因工程药物的生产过程。（了解）目的基因的获得。（掌握）（三）目的基因的获得一.碱基序列未知反转录法反转录--PCR反应法二.已知碱基序列化学合成法三.筛选基因的新方法构建cDNA文库编码序列富集法旧基因的改造等1.反转录人工合成互补DNA提取RNA纯化mRNAcDNA第一链的合成cDNA第二链的合成合成一条cDNA双链后:cDNA的克隆选择载体与载体连接成重组体将重组体导入宿主细胞进行表达，筛选鉴定。反转录人工合成互补DNA方法的优势——获取的DNA片段往往是具有特定功能的目的基因2.反转录--PCR法mRNA经反转录合成cDNA第一条链后,直接在特异引物协助下,用PCR法进行大量扩增,从而特异合成目的基因,然后再用于重组,克隆。PCR的原理及步骤

聚合酶链式反应（PCR）PCR技术就是在体外中通过酶促反应有选择地大量扩增（包括分离）一段目的基因的技术。加入4种物质:（1）作为模板的DNA序列；

（2）与被分离的目的基因两条链各自5’端序列相互补的DNA引物（20个左右碱基的短DNA单链）；

（3）TaqDNA聚合酶；

（4）dNTP（dATP,dTTP,dGTP和dCTP）。

聚合酶链式反应（PCR）变性、退火、延伸三步曲变性:双链DNA解链成为单链DNA退火:部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合延伸:以目的基因为模板，合成互补的新DNA链

聚合酶链式反应（PCR）每一轮聚合酶链式反应可使目的基因片段增加一倍30轮循环可获得——

230（1.07×109)个基因片段2.化学合成法（1）目前常用的方法磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、固相合成法自动化合成法、①

保护dNTP的5’端P或3’端-OH③

用酸或碱的脱保护

原理磷酸二酯法②

带保护的单核苷酸连接保证合成反应的定向进行。带5’保护的单核苷酸与带3’保护的另一个单核苷酸以磷酸二酯键连接起来。

合成过程下一个5’端保护的单核苷酸又可以同3’端保护的二核苷酸聚合（2）人工合成法限制性不能合成太长的基因≤60bp只能合成小分子肽。遗传密码的简并性,以aa推测核苷酸顺序时,不一定与天然基因一致,易发生突变。费用高。3.基因文库的构建将总DNA包含的基因组各片段分别克隆在质粒或噬菌体载体上,便构成了该生物的基因文库。细胞内总DNA的提取分离与基因文库的构建细胞内总DNA的提取分离程序（分子实验）构建基因文库获取目的基因存在的问题—

费时费事 内含子序列总结纯化mRNA根据mRNA的特点来纯化:3‘末端含polyA结构亲和层析法:利用此特点，在RNA流经寡聚（dt）纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异的结合在柱上，再逐渐降低盐浓度洗脱时，mRNA被洗脱下来，从而得到较纯的mRNA第二链的合成（1）除去mRNA-cDNA杂交