4.3.3 液相色谱分析法

4.3.3液相色谱分析法采用液相色谱仪（法）(LiquidChromatography,LC)的一类食品分析技术。

色谱分离技术框图

4.3.3.1高效液相色谱分析采用高效液相色谱仪（法）(HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC)的一种食品分析技术。WATERS-600HPLCWATERS-e2695HPLCAgilent1100HPLC高效液相色谱分离模式水溶剂

高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代末，70年代初发展起来的一种新型分离分析技术，随着不断改进与发展，目前已成为应用极为广泛的化学分离分析的重要手段。它是在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论，在技术上采用了高压泵、高效键合固定相和高灵敏度检测器，因而具备速度快、效率高、操作自动化的特点。为了更好地了解高效液相色谱法优越性，现从两方面进行比较：

高效液相色谱法与经典液相色谱法比较高效液相色谱法比起经典液相色谱法的最大优点在于高速、高效、高灵敏度、高自动化。高速是指在分析速度上比经典液相色谱法快数百倍。由于经典色谱是重力加料，流出速度慢；而高效液相色谱配备了高压输液设备，流速最高可达10mL/min。分离苯的羟基化合物，7个组分只需1min就完成。对氨基酸分离，用经典色谱法，柱长约170cm，柱径0.9cm，流动相速度为30cm3·h-1，需用20h才能分离出20种氨基酸；而用高效液相色谱法，只需1h之内即可完成。如用25cm×4.6mm的Lichrosorb－ODS(5

m)的柱，采用梯度洗脱，可在不到0.5h内分离出尿中104个组分。流动相驱动力来源不同气相色谱法流动相的驱动力来源于高压钢瓶，高效液相色谱法流动相的驱动力来源于高压泵。分离过程不同气相色谱法的分离是根据混合组分在固定液中分配系数的不同，即分离效果主要取决于固定相对样品中各组分的选择性。惰性气体流动相（N2，H2，He2）其作用主要是运载样品各组分进入并通过色谱柱，然后进入检测器。通常它对组分分离影响很小。气相色谱主要是通过更换固定相、改变柱温来改善分离效果。与气相色谱法不同，高效液相色谱法流动相对样品中的组分具有一定的溶解能力，除运载样品中各组分通过色谱柱进入检测器外，还参与色谱分离过程；在液相色谱中除通过改变固定相来改善分离效果外，通常用改变流动相来改善分离。因为流动相组成可以灵活多变，使用不同比例的流动相可得到完全不同的分离。高效液相色谱法与气相色谱法比较柱箱温度范围不同

气相色谱一般都在较高温度（＞150℃）下进行，液相色谱的柱温受流动相沸点的限制，通常在室温或高于室温（

70℃）的条件下测定，分离后还能保持待测物质分子原有的结构和性质不被破坏。利用制备液相色谱仪，收集分离各组分的馏分、蒸馏后可以获得克级被分离物质或其代谢物纯品。色谱柱长不同液体的粘度比气体的粘度通常大2～3个数量级，所以液相色谱的柱长通常不超过25cm，而气相色谱可采用长柱，填充柱长度为0.5～3m，石英毛细管柱长可达30~60m。速率理论方程参数项不同液体是不可压缩，而气体可压缩，气相色谱中与载气体积有关的参数都必须进行校正，才能用液相色谱法中。如范第姆特VanDeemter方程H=A+B/u+Cu,分子扩散项B/u则可忽略不计，简化为理论塔板高H=A+Cu。洗脱模式不同被测物质在液体中的扩散系数比在气体中小4～5个数量级，所以在高效液相色谱中，必须特别注意柱外效应对分离的不良影响，即温度对分离的影响。温度低一些能提高分离度，但需要更多一些分析时间；温度高些能降低分离度，但加快了分析速度，因此在实际分析过程中要综合考虑以上两个因素。液固色谱和液液色谱中，温度恒定是极为重要的，因为温度的改变，会产生不均匀吸附和不均匀分配，因此液相色谱法不采用程序升温洗脱模式而采用梯度洗脱模式。进样量不同痕量分析时液相色谱法通常进样几十微升，最多100

L。气相色谱法除顶空分析外，液体样品填充柱通常进样几微升，FPD最多10

L；毛细管柱进样量1~2

L。分析对象范围有所不同

气相色谱法分析对象只限于分析气体和沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数的20％。对于占有机物总数近80％的那些高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质，目前主要采用高效液相色谱法进行分离和分析。采用直接的分析方法，如不对分析对象进行衍生处理，气相色谱法只适合分析分子量小于600，热稳定性好，极性小的化合物。高效液相色谱法已经适合分析除气体样品以外的几乎所有的化合物。

总之，高效液相色谱法是吸取了气相色谱与经典液相色谱优点，并用现代化手段加以改进，因此得到迅猛的发展。目前高效液相色谱法已被广泛应用于食品分析，例如蛋白质、肽、核酸、氨基酸、多糖类、脂肪酸类、维生素类、有机酸类、食品添加剂类等物质的分离和分析，还有农药、兽药残留分析。高效液相色谱法的分析成本较高（流动相、色谱柱等），分析时间周期较长，普及率最高的紫外检测器需要待测物分子结构中具有生色团，这些是它的主要不足。HPLC分离的机理固定相(StationaryPhase)流动相(MobilePhase)进样(Injection)洗脱(Elution)相互作用(Interaction)反相和正相分配色谱法的区别反相正相固定相极性极性小或中等具体：C18等极性大或中等具体：氨基等流动相极性极性大或中等具体：水、甲醇等极性小或中等具体：己烷等样品洗脱次序极性强先出来非极性先出来增加流动相极性的效果增加洗脱时间降低洗脱时间高效液相色谱仪高效液相色谱仪流程1-贮液器2–搅拌、超声脱气器3–梯度洗脱装置4–高压输液泵5–流动相流量显示6–柱前压力表7–输液泵泵头8–过滤器9–阻尼器10–六通进样阀11–色谱柱12–检测器13–记录仪(或数据处理装置)14–回收废液罐高效液相色谱仪流程示意图高效液相色谱仪一般可分为5大系统：高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统、计算机控制及数据处理系统。此外还配有辅助装置：如梯度洗脱，也叫梯度淋洗，自动进样及数据处理等。其工作过程如下：首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱，然后从检测器的出口流出。当注入欲分离的样品时，流经进样器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流动相阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输液系统。它是高效液相色谱仪最重要的部件，一般由储液罐、高压输液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成，其中高压输液泵是核心部件。对于一个好的高压输液泵应符合密封性好，输出流量恒定，压力平稳，可调范围宽，便于迅速更换溶剂及耐腐蚀等要求。常用的输液泵分为恒流泵和恒压泵两种。恒流泵特点是在一定操作条件下，输出流量保持恒定而与色谱柱引起阻力变化无关；恒压泵是指能保持输出压力恒定，但其流量则随色谱系统阻力而变化，故保留时间的重现性差，它们各有优缺点。目前恒流泵正逐渐取代恒压泵。恒流泵又称机械泵，它又分机械注射泵和机械往复泵两种，应用最多的是机械往复泵。☆高压输液系统：高效液相色谱高压输液系统老式高效液相色谱仪采用新款高效液相色谱仪采用贮液器耐腐蚀，玻璃、聚醚醚酮（PEEK）材料。0.5~2L，入罐前过滤。滤膜流动相：流动相是影响分离的一个重要调节因素。一种理想的液相色谱流动相溶剂应具有低粘度，检测器兼容性好，样品容易回收和低毒等特性。正相高效液相色谱法流动相常以己烷做基础溶剂。当洗脱极性较强的组分时，通常用二氯甲烷、四氢呋喃来调节极性。反相高效液相色谱法采用的流动相多为甲醇、乙腈配合水。一般情况下甲醇–水体系能够满足多数样品的分离要求。流动相选择注意事项：纯度：采用“HPLC”级溶剂避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂对试样有适宜的溶解度溶剂粘度要小与检测器相匹配2星期1天1星期1小时新鲜配制5101520250t/min保存于聚乙烯瓶中的超纯水测试条件水样:40mltraceenrichment@2.0ml/min色谱柱:C18

反相柱(Waters)梯度:线性100%水－100%乙腈波长:254nm1天1星期新鲜配制5101520250t/min保存于棕色玻璃瓶中的超纯水测试条件水样:40mltraceenrichment@2.0ml/min色谱柱:C18

反相柱(Waters)梯度:线性100%水－100%乙腈波长:254nm水水是反相高效液相色谱法最重要的溶剂，它也是最难纯化和保持其特性的流动相之一。水的纯度至关重要，特别是在痕量分析，检测器处于高灵敏度状态时。长时间使用纯度满足不了要求的水，有时会出鬼峰。水的纯化可以采用蒸馏、离子交换等方法。水中有机物可以用高锰酸钾或通过一根C18柱去除。水中容易滋生微生物，一定要用新鲜的，最好每天换水，更换时间最长也不要超过7d。电蒸馏水或去离子水必须至少在全玻璃系统下重蒸馏一次才能上机使用。可以采用下列程序检验水的纯度：首先泵100mL水通过C18柱，然后跑一个线性梯度洗脱，流速1mL/min，10min流动相甲醇从0升到100%，保持15min，通过一个在线紫外检测器测定。如果在0.08AUFS档位基线漂移小于10%，几乎不出峰，即使出峰其峰高也小于满刻度值3~5%。18.2MΩ。在使用电化学或其他高灵敏度检测器时，二次蒸馏设备需要采用全石英玻璃系统。水GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法（ISO3696：1987，MOD）

一级水：可用于HPLC。二级水石英设备蒸馏后过滤（0.22

m

）制得；二级水：可用于AAS。多次蒸馏或离子交换法制得；三级水：可用于化学容量分析；冲洗玻璃器皿。蒸馏或离子交换法制得。电热法制备三级水纯玻璃装置蒸馏制备二级水超纯水制备技术（联合使用）

1反渗透（RO膜），蠕动泵加压，离子被截留；

2电去离子（EDI），电场吸引离子去除；

3过离子交换树脂柱，电荷吸引去除。超纯水制备仪纯水制备仪乙腈这是反相高效液相色谱常用的溶剂，实验室常用的只能满足紫外检测器的需要。这样的试剂很难符合荧光和电化学检测器的要求。甲醇反相高效液相色谱常用的溶剂之一，其杂质主要是水。市面上能够买到紫外光谱纯的商品，但它的主要问题也是有些特性满足不了荧光和电化学检测分析。氯代烃类溶剂在正相高效液相色谱中常用的二氯甲烷等氯代烃类溶剂中，添加稳定剂甲醇或乙醇。乙醇能够提高流动相的极性，缩短正相高效液相色谱分析中各组分的保留时间。各批次之间浓度的变化也许会影响重复性。国内市场上可能不容易买到不含稳定剂的氯代烃类溶剂，但是可以用氧化铝柱吸附的办法或者用水萃取脱掉。不含稳定剂的氯代烃类溶剂可以缓慢的分解，特别是与其他溶剂共存时。分解的盐酸会腐蚀不锈钢部件，损害色谱柱。以戊烯为稳定剂的氯代烃类溶剂可避免上述产生的问题。乙腈或甲醇，%9075502510水，%1025507590乙腈水混后温度（℃）7.87.29.412.614.4甲醇水混后温度（℃）19.422.424.221.617.8室温（℃）15.4改性剂、离子对试剂、离子对探针试剂的概念改性剂----加入流动相中能改变分离性能的少量试剂或溶剂。如乙酸、磷酸和磷酸二氢钾等。离子对试剂----加入流动相中能与待测离子生成离子对化合物的反离子试剂。如脂肪胺等。离子对探针----加入流动相中能与待测离子生成具有紫外吸收性能的离子对化合物的反离子试剂。如苯胍、二苯胍等。本实验室的发现。表5-10常用流动相改性剂的性质化合物熔点/℃沸点/℃pKapH值缓冲范围挥发性通常使用浓度三氟乙酸-15.472.40.30有0.02-0.1%甲酸100.73.75有0.1-1.0%乙酸116.04.75有0.1-1.0%碳酸6.37有氨水-33.49.25有甲胺-6.310.66有乙胺16.610.81有三乙胺89.311.019.7~11.7有0.1-1.0%甲酸铵116分解3.0~5.0有1~10mmol/L乙酸铵112分解3.8~5.8有1~10mmol/L碳酸氢铵106（升华）10.3（HCO32-）；9.2（NH4+）8.2~11.3有磷酸盐1※2.151.15~3.15无紫外透光性好磷酸盐2※※7.26.20~8.20无常用流动相改性剂的性质测定阴离子测定阳离子疏水性脂肪胺系列：羧酸系列：

增加乙胺五氟丙酸丙胺七氟丁酸丁胺九氟戊酸戊胺十五氟辛酸己胺十三氟庚酸季胺系列：磺酸系列：

增加四甲基氢氧化铵丁烷磺酸四乙基氢氧化铵戊烷磺酸四丙基氢氧化铵己烷磺酸四丁基氢氧化铵庚烷磺酸常用的离子对试剂离子对探针试剂二苯胍的化学结构式离子对试剂正丁胺的化学结构式采用生色团离子对试剂（离子对探针）通常称为间接光度色谱法；对于不具有紫外吸收的离子，实现了采用普及率高的紫外检测器测定；离子对探针筛选难度大，方法优化工作量大。目前理想通用的离子对探针试剂有二苯胍、苯胍。反相色谱溶剂强度图四氢呋喃

水乙腈

水甲醇

水洗脱能力增强流动相前处理：过滤：0.45

m或更小孔径滤膜

目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液。脱气：目的：除去流动相中溶解或因混合（甲醇和水）而产生的气泡方法：◎超声波振荡+抽真空：5min+5min

◎吹氦气法（鼓泡法）：氦气在流动相中的溶解度比空气低，可以将溶解的气体驱逐出去。脱气效果好，但成本高。在0.5MPa的压力下，先以100ml/min，鼓泡15min，然后以20ml/min保持着。◎

在线脱气器:膜过滤器。溶解在流动相中的气体可以从膜中被真空脱出，而液体不会从膜中出来。脱气效果最好。气泡对测定的影响：

●柱流量不准

●检测器基线波动

●氧会使荧光猝灭脱气注意点：

●每天脱气(无在线脱气器时）

●混合溶剂脱气时间不能过长1–高压输液泵2–贮液器3–膜过滤器4–塑料膜管线（体积12mL，气体可渗透出来）5–传感器6–控制电路7–电磁阀8–真空泵9–脱气后流动相至过滤器10–脱气单元

高效液相色谱仪在线脱气结构示意图高压输液泵要求：◎泵体耐化学腐蚀。使用优质耐酸不锈钢（Cr18Ni2Mo2）◎能在高压下连续工作。40~50MPa。◎输出流量范围宽。◎输出流量稳定，重复性高。WATERS600高压输液系统WATERSe2695高压输液系统H-Class超高压输液系统主动阀MPa(兆帕)(N/m2)PSI(磅/英寸2)(b/in2)标准大气压（atm）毫米汞柱(托Torr)(0℃,mmHg)巴(bar)公斤力/厘米2(kgf/cm2)1145.0389.8697500.621010.197常用压力单位换算表控制方式：

恒流控制:恒流泵有注射型泵和往复泵，后者广泛采用。优点：组分保留时间重现性好。

缺点：压力有脉动；柱塞直接与流动相接触；长期运载，单向阀易堵塞。

恒压控制：恒压泵。恒流泵泵封外径1cm单向阀结构球座吸液冲程排液冲程出口单向阀进口单向阀泵头抛光面宝石球流动相单向阀原理柱塞杆泵封或称密封垫单向阀单向阀柱塞指示杆梯度洗脱装置所谓的梯度洗脱，就是将两种或两种以上的不同极性的溶剂进行混合，作为流动相使用。在进样过程中，连续不断地按预先拟定的程序改变流动相的比例（极性）。由于流动相极性发生变化，使得选择性得以改善，从而提高了分离能力，缩短了分离时间。常用的梯度洗脱有低压洗脱、高压洗脱。高压梯度装置是用高压泵分别将两种或三种不同极性的溶剂输入混合器，充分混合后进入色谱柱。多元低压梯度洗脱只需要一个高压泵，而多元高压梯度洗脱就需要多个高压泵。典型的高压梯度洗脱程序低压梯度和高压梯度洗脱装置示意图低压梯度洗脱高压梯度洗脱主流技术☆☆进样系统：

高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约5～30cm），所以柱外展宽（又称柱外效应）较突出。柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽，主要包括进样系统、连接管道及检测器中存在死体积。柱外展宽可分柱前和柱后展宽。进样系统是引起柱前展宽的主要因素，因此高效液相色谱法中对进样技术要求较严。

WATERS600手动进样器进样器自动进样器手动进样器定量管（10

L，20

L，50

L，100

L）原理：（六通阀）注入方式：

1）全量注入

2）部分注入（定量重现性差）

装填状态进样状态手动进样器的原理图装填状态进样状态Rheodyne（罗丹尼）7125i

六通进样阀罗丹尼阀自动进样系统H-Class自动进样系统e2695自动进样系统☆☆☆分离系统：色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属。玻璃管耐压有限，故金属管用得较多。一般色谱柱长5～30cm，内径为4～5mm，凝胶色谱柱内径3～12mm，制备柱内径较大，可达25mm以上。一般在分离前备有一个前置柱，前置柱内填充物和分离柱完全一样，这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相饱和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相，保证分离性能不受影响。柱子装填得好坏对柱效影响很大。对于细粒度的填料（＜20μm）一般采用匀浆填充法装柱，先将填料调成匀浆，然后在高压泵作用下，快速将其压入装有洗脱液的色谱柱内，经冲洗后，即可备用。柱箱分析结果重现性好提高柱效降低柱压保证检测稳定性

柱温控制的优点：WATERS600柱箱WATERSe2695柱箱H-ClassUPLC-柱箱色谱柱化学键合固定相硅烷化键合（Si-O-Si-R型）,适用于反相色谱柱酯化键合（Si-O-R型），适用于正相色谱柱硅胶结构示意图硅胶甲基杂化颗粒示意图（一代）亚乙基桥杂化（BEH）颗粒示意图（二代）在硅胶聚合物中嵌入亚乙基桥键液相色谱填料颗粒度变化的趋势可换芯式保护柱保护柱柱芯柱套各种高效液相色谱柱高效液相色谱柱包装盒1–柱管2–压帽3,6–卡套4–筛板5–接口7–螺丝8–输液管柱结构示意图管路内径对色谱峰拓展的影响切割PEEK管线的工具一些商品牌号的液相色谱柱

类型填料规格（柱长/内径，mm）反相柱HypersilODS-2(C18),5

m250×4.6HypersilC18–BDS,3

m150×4.6InertsilCN-3,5

m250×4.6KromasilC18,5

m250×4.6BetasilC18,5

m150×4.6XTerraMSC18,2.5

m150×3.0Shim–packVP-ODS,5

m150×4.6ZorbaxExtendC18,5

m150×4.6SunFireC18,5

m250×4.6SymmetryShieldRP8,5

m150×3.9XTerraRP18,5

m150×3.9AtlantisT3,5

m250×4.6XBridgeBEHC8,3.5

m250×4.6XSelect

CSHC18,3.5

m100×3.0XSelectHSSFluoro-PhenylXP,2.5µm75×4.6类型填料规格（内径/柱长，mm）正相柱HypersilCN(CPS-1),5

m4.6×250HypersilNH2(APS-1),5

m4.6×250ZorbaxNH2,5

m4.6×250ZorbaxRx-SIL,5

m4.6×250SpherisorbAmino(NH2),3

m4.6×100SpherisorbCyano(CN),5µm4.0×250µBondapakAmino(NH2),10µm3.9×300AtlantisSilicaHILIC,5µm3×100Nova-PakSilica,4µm3.9×150XBridgeBEHHILIC,3.5µm4.6×100各种固定相键合示意图C18柱填料C18柱填料C18柱填料C8柱填料各种固定相键合示意图苯基柱填料氰基柱填料氨基柱填料ODS柱与C18柱的区别一般认为C18是连接了十八烷基碳链的反相固定相的总称。除了硅胶基质外，还可以包括其他基质的填料，比如高聚物小球为基质，氧化铝为基质，氧化锆为基质等键合C18链形成的反相固定相。而ODS是以硅胶为基质键合的C18填料。由于大部分的C18柱是硅胶基质，因此，在很多场合内二者混为一谈。RP柱，BDS柱，MS柱

RP柱：内嵌了酰胺极性基团的在100％的水相条件下对极性化合物有极高保留的C18柱。适用于分离超高极性化合物。在100％水做流动相时可保持稳定。BDS柱：BaseDeactivedSilica，碱钝化硅胶柱。特别适合于强极性含氮的碱性化合物分离。MS柱：超低流失，适用于液质分析用。XP柱，CHS柱，HSS柱，HILIC柱

XP柱：通常是指粒径为2.5

m一类色谱柱，可兼容于HPLC和UPLC系统的操作。

CHS柱：是指表面带正电荷的杂化颗粒技术制造的色谱柱。据资料介绍，只使用0.1%甲酸水溶液，不用离子对试剂就可以进行离子对色谱分析。

HSS柱：是指高强度，耐高压的一类硅胶柱。HILIC柱：亲水作用色谱柱。是一种采用极性固定相、以高浓度极性有机溶剂和低浓度水溶液为流动相的色谱分离模式，能提高质谱检测的灵敏度。水是强洗脱剂，加大乙腈比例可使极性组分保留值加大，适于分析极性化合物或极性代谢物。1）柱压低于15MPa2）柱温在40℃左右，最高使用温度为50℃3）缓冲液pH使用范围为2～7色谱柱使用注意事项：*硅胶在pH为3～4时稳定性最好*碱浓度越低，流动相含水量越低，硅胶越稳定。4）冲洗与保存柱床损坏、部分阻塞及处理☆☆☆☆检测系统：

在液相色谱中，有两种基本类型的检测器。一类是溶质性检测器，它仅对被分离组分的物理或化学特性有响应，属于这类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器等。另一类是总体检测器，它对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应，属于这类检测器的有示差折光，电导检测器等。检测器的种类

◎紫外检测器（包括二极管阵列检测器）◎荧光检测器◎示差折光率检测器◎电导检测器◎蒸发光散射检测器规

格UVFLDEChELSD类型专用专用通用通用梯度洗脱能能不能能线性范围104105105106最小检出量(g)10-1110-1410-810-9对流速敏感性无无有无对温度敏感性低低2%，℃低信号单位吸光度，A荧光度电导率

s/cm光散射液相色谱检测器性能一览表

△紫外可见光检测器

（Ultraviolet-visibleDetector，UV）原理：基于被分析组分对特定波长紫外光的选择性吸收定量基础：比耳定律，A＝KCL优点：1）对温度和流速不敏感

2）可用于梯度洗脱光源：氘灯与钨灯组合缺点：仅适用于测定有紫外吸收的物质WATERS2998紫外检测器紫外检测器的溶剂影响不同种类溶剂有其截止波长溶剂的质量好坏对其截止波长有影响为何溶剂质量不好?含紫外吸收的杂质溶解在其中的氧气缓冲液溶质的紫外吸收注意定期清洗亦称PDA(Photo-DiodeArray),21世纪标准紫外检测器（实质是色谱与光谱的联用，有一定的定性价值）253nm0.435色谱定性依据：保留时间常规紫外检测器

峰纯度二极管阵列检测器二极管阵列检测器(diode-arraydetector,DAD)1）采集三维谱图2）峰纯度检验3）光谱库检索4）可以发现单波长检测时未测到的峰二极管阵列检测器的优点：光电二极管阵列检测器示意图灵敏度及分辨率的同时提高分辨率：1.2nm噪音：±1.510-5AU氙灯氘灯转动谱图牵引点莠去津三维谱图食品添加剂除草剂莠去津二维色谱图及紫外吸收光谱图A/AU

△△示差折光检测器(differential

refractometerditector，DRD)原理：连续测定流通池中溶液折射率来测定试样各组分浓度。优点：通用型检测器缺点：1）对温度变化敏感

2）不能进行梯度洗脱蔗糖CAS57-50-1示差折光检测示意图工作原理许多化合物有光致发光现象，荧光属于其中的一种。化合物受到入射光的照射后，吸收辐射能，发出比吸收波长长的特征辐射，当入射光停止照射时，特征辐射也很快消失，这种辐射光线就是荧光（＜10-8s）。荧光产生的实质是原子中电子由最低振动能级下降到基态中的某些不同能级的能量释放。被化合物吸收的光称为激发光，产生的荧光称为发射光。荧光的波长总要比分子吸收的紫外光波长长，这种光一般是可见光。对于稀溶液，荧光强度与荧光物质溶液浓度、摩尔吸光系数、吸收池厚度、入射光强度、荧光量子效率及荧光收集效率等成正相关，在相对条件下，物质的荧光强度与该物质溶液浓度成正比，这是荧光检测器的定量依据。△△△荧光检测器(fluorescencedetector，FLD)结构一台荧光检测器包括以下基本部件：激发光源；选择激发波长用的单色器；流通池；选择发射波长用的单色器及用于检测发光强度的光电检测器。由氙灯光源发出的光，经激发光单色器后，得到所需要的激发光波长。激发光通过样品流通池，一部分光线被荧光物质吸收。荧光物质激发后，向四面八方发射荧光。为消除入射光与散射光的影响，一般要取与激发光成直角的方向测量荧光。近年来，还出现一种激光诱导荧光检测器，其主要区别是光源采用了激光器。荧光检测器示意图黄曲毒素B1CAS1162-65-8荧光检测器示意图代谢产生氙灯或激光工作原理电化学检测器是根据电化学原理和物质的电化学性质进行检测的。在液相色谱中对那些没有紫外吸收或不能发出荧光但具有电活性的化合物，可采用电化学检测法。电化学检测器在痕量分析上主要有安培检测器和电导检测器。前者是以测量电解电流的大小为基础，后者则以测量液体的电阻变化为根据。△△△△电化学检测器(EChD)安培检测器(amperometricdetector，AMD)电化学检测器中应用最广泛的一种检测器。它要求在电解池中发生电解反应，即在外加电压的作用下，利用待测物质在电极表面上发生氧化还原反应引起电流的变化而进行测定的一种方法。它的工作电极是安培检测器的心脏，通常用玻璃碳材料制成，参比电极一般为Ag/AgCl电极，辅助电极为不锈钢或金、白金材料。三电极安培检测器示意图电导检测器

(conductivedetector，CD)

CD与安培检测器不同，电导检测池内没有电化学反应发生，样品的浓度是通过测量溶液中离子的电导变化获得的。电导检测器主要是用于离子分析。该检测器在实际使用中对水、淋洗液有较严格的要求，离子分析时一般整个流路系统都用PEEK材料，避免不锈钢材料对淋洗液产生影响或淋洗液对不锈钢材料的腐蚀。电导池在使用前后发现有污染时，可用1:1硝酸溶液处理数分钟，以消除污染。在分析过程中，要注意温度对电导率的影响，一般每升高1℃，电导率会增加(2~2.5)%。电导检测器原理示意图△△△△△蒸发光散射检测器evaporative

light-scatterdetector，ELSD1985年世界上第一台蒸发光散射检测器问世，它标志着高效液相色谱仪通用型质量检测器的诞生。工作原理当一束光线通过一间充满烟雾的房间就会发生光散射现象。在一定的角度测得的光散射强度与烟雾粒子大小和数量成正比，这就是ELSD定量分析的原理。原理上讲它可以检测挥发性低于流动相的所有化合物。经色谱柱分离的组分随流动相进入雾化器中，利用高速气流喷成一薄雾，雾化为微小液滴的流动相进入加热的蒸发器(漂移管)蒸发，不挥发的目标化合物微粒化后进入光路发生光散射，散射光被光电倍增管捕获检测。

ELSD检测器结构示意图雾化部分蒸发部分检测部分☆☆☆☆☆

计算机控制及数据处理系统高效液相色谱数据处理单元：岛津CLASSWATERSEmpowerPro中文版色谱工作站液相色谱分析条件的选择高效液相色谱法操作条件的选择应遵循色谱理论，主要包括两个方面的问题，即色谱柱效率和溶剂效率。柱效率是指溶质通过色谱柱之后峰的宽度增加了多少，它与溶质在两相中的扩散及传质情况有关，这就是所谓的色谱动力学过程；溶剂效率是与两个物质和固定相、流动相的分子间作用力不同有关，这就是所谓的热力学过程。要提高柱效率，就得改善色谱柱性能和操作条件；要提高溶剂效率，就得提高固定相的选择性。乙腈甲醇四氢呋喃（稳定剂2,6-二叔丁基对甲酚出峰）水（黏度大，样品易水解）二甲基甲酰胺（碱性较强）样品溶剂的选择溶解度稳定性黑色-C18

柱

红色-CN基柱色谱柱的选择青岛某企业送检样，样品名称：间二苯酚。麦芽糖般柔软，不溶于水、甲醇、乙腈。CAS108-46-3结构式：用途：防腐剂。医药、染料合成中间体。HPLC-DADC18，250mm×3.9mm，5

m甲醇:水=60:400.8mL/minGC-FIDAC-10，60m×0.25mm×1

m流动相种类的选择甲醇∶水=80∶20乙腈∶水=80∶20乙腈∶水=65∶35CAS21282-97-3流动相比例的选择（水的比例太大）HPLC-DADC18柱面积归一：98.15%HPLC-DADCN柱面积归一：93.45%HPLC-DADCN面积归一：79.20%提取波长：217nmHPLC-DADCN面积归一：93.45%提取波长：200nm固定液碳链长短对分离的影响采用反相键合相C1、C8、C18对以下6种化合物进行分离。可以看出，随着碳链增加，保留时间明显增加，分离度明显提高。(色谱条件：IBM柱200×4.5mm；流动相：

Ψ（CH3OH∶H2O）=50∶50；流速：1.0mL/min；检测波长：254nm。)1-尿嘧啶2-苯酚3-乙酰苯4-硝基苯5-苯甲酸甲酯6-甲苯反相液相色谱固定液碳链长度对分离的影响对异构体的分离氯氰菊酯有8种同分异构体，如果采用一根柱子无法将其全部异构体分开。若再与一根手性柱串联使用，就可以分开全部异构体，见图4.2.29。(色谱条件：左图Chirex3019(Phenomenex)柱，250×4.0mm；右图Chirex3019柱+Chirex3020(Phenomenex)柱；流动相：Ψ（己烷∶二氯甲烷∶乙醇）=500∶10∶0.05，流速：1.0mL/min；检测波长：230nm。)氯氰菊酯8种同分异构体的分离1-对氨基苯磺酸

2-磺胺甲基嘧啶

3-磺胺异恶唑

4-磺胺嘧啶pH值对反相色谱法分离的影响4种磺胺药物在pH1.25~10范围内的分离。在pH1.25~3.0时磺胺异恶唑不稳定，没有流出。pH5.0~7.0流出就发生了。pH9.0有很好的分离，pH10.0分离很差。(色谱条件：ODS柱150×4.6mm，5

m；流动相：Ψ（20mMKH2PO4∶CH3CN）=95∶5，流速：1.0mL/min；检测波长：270nm。)pH值对分离的影响流速变化对保留时间的影响上图：0.4ml/min中图：

0.8ml/min下图：

1.2ml/min流动相比例变化对保留时间的影响填料细度对分析时间的影响在相同的流速下，不同的柱长，填料粒径减小，保留时间缩短。压力随粒径变细显著地增高。(色谱条件：C18填料，色谱柱a，300×4.6mm×10m,640psi；色谱柱b，150×4.6mm×5m,1770psi；色谱柱c，75×4.6mm×3m,2540psi；流动相：Ψ（CH3OH∶H2O）=60∶40，

流速：1.0mL/min)1-苯酚2-乙酰苯3-硝基苯4-苯甲酸甲酯5-苯甲醚6-苯7-甲苯

色谱柱填料细度对分离时间的影响高效液相色谱仪工作环境的要求

HPLC的日常操作条件：温度：10～30℃；相对湿度<80％；最好是恒温、恒湿，远离高电磁干扰、高振动设备，有良好的通风设施。4.3.3.2超高效液相色谱法基于小颗粒技术（1.7

m）超高分离度超高灵敏度超高速MS理想的接口方法转换简单采用超高效液相色谱仪（法）（UltraPerformance

LiquidChromatography，UPLC）的一种食品分析技术。Waters公司于2004年3月正式推出商品化仪器ACQUITYUPLC。UPLC（续）超高压（＞15000psi,约103MPa）系统。

HPLC压力﹤30MPa仪器系统体积小要求高速检测器进样浓度不宜太高，样品最好要超高速离心目前造价昂贵eCore分析柱保护柱HPLC与UPLC对同一样品产生不同分离效果的比较UPLCHPLCt/min压力：5.4MPa压力：33MPa4.3.3.3离

子

色

谱

分析采用离子交换色谱仪（法）(IonChromatography,IC)的一种食品分析技术。

属于液相色谱分析，是利用色谱技术测定离子型物质的方法。离子色谱是阴离子和短碳链有机酸分析的首选方法，已成为常规的分析化学手段之一。离子色谱基本不用有机溶剂。只使用低浓度盐或酸的水溶液，相对安全、环保。离子色谱法基本原理及概述

离子型物质:在水溶液中电离，具有

+或–电荷的元素或基团。阴离子：Ｃｌ－，ＮＯ2－，ＳＯ４２－，ＣｒＯ４２－阳离子：Ｎａ＋，ＮＨ４＋，Ｃａ２＋，Ｆｅ３＋

1975由H.

Small等人（Dowchemical)

发表第一篇IC论文提出用于测定氯离子和硫酸根的方法。HamishSmall发明了离子色谱抑制器2003年，HamishSmall与牟世芬研究员离子色谱的特点

操作相对简单容易，样品分析重现性好经过稀释、过滤后可以测定多种样品

多价态可氧化元素（NO2-&NO3-,SO32-&SO42-etc.）,

不同价态离子（Fe3+&Fe2+,

Cr3+&Cr6+

etc.）

可单独测定某种离子，也可同时测定多种离子防止色谱柱和抑制器被污染离子色谱仪的类型抑制型（有第二支柱）非抑制型（淋洗液浓度低，柱短，可测定硅酸盐、碳酸根等）无需更换系统，阴阳离子交错或同时分析离子色谱仪的基本流程图淋洗液

泵色谱柱检测器泵液分离检测

记录与数据处理F-NO3-SO42-Cl-NO2-Br-HPO42-六通阀抑制器（第二柱）检测池进样保护柱定量管六通阀进样器自身再生式抑制器分析柱保护柱电导检测器电动六通阀马达液相色谱分离的类型离子排斥：离解常数和疏水性离子对(RP)：对离子对试剂的亲和力

离子对化合物的疏水性离子抑制

：在特定pH下的疏水性反相液相：疏水性离子交换：

离子价态和离子半径

ＳＯ３－ＳＯ３－ＳＯ３－ＳＯ３－Ｎ＋Ｒ３Ｎ＋Ｒ３Ｎ＋Ｒ３Ｎ＋Ｒ３Ｎ＋Ｒ３Ｎ＋Ｒ３Ｎ＋Ｒ３Ｎ＋Ｒ３Ｎ＋Ｒ３Ｎ＋Ｒ３Ｎ＋Ｒ３Ｎ＋Ｒ３阴离子交换树脂(乳胶型）５μm＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋

ＣＯＯ－ＣＯＯ－ＣＯＯ－ＣＯＯ－ＣＯＯ－ＣＯＯ－ＣＯＯ－ＣＯＯ－ＣＯＯ－ＨＰＯ３－ＨＰＯ３－ＨＰＯ３－ＨＰＯ３－ＨＰＯ３－ＨＰＯ３－ＨＰＯ３－阳离子交换树脂(接枝型)检测方式电导

检测具有电导性化合物的通用型检测器离子色谱最常用的检测器电化学(安培法)

在特定的条件下可对某些化合物直接进行氧化还原反应紫外－可见光度法紫外直接吸收或可见光光度法测定选择性强

可进行柱后衍生抑制器安装在电导池之前

提高待测离子的电导率，改善信噪比：

提高灵敏度Na+,

Cl-

H+,

Cl-

降低背景电导(淋洗液):

减少噪音Na+,

HCO3-

H2CO3Na+,

OH-

H2O抑制器的作用废液BackGround：Na2CO3/NaHCO3

(700μS)NaF,NaCl,NaNO3Na2HPO4,Na2SO4～～RetentiontimeConductivityNaFNaClNaNO3Na2HPO4Na2SO4BackGround：Na2CO3/NaHCO3

(700μS)～～RetentiontimeConductivityHFHClHNO3H3PO4H2SO4RetentiontimeBackGround：H2CO3(15μS)ConductivityCSRS阳离子抑制器ASRS阴离子抑制器Y+Na+

抑制器的工作原理(阴离子)X-:

样品中的阴离子Y+:

样品中的阳离子H2OH2OOH-Na+Y+H2ONa+Y+

X-

Na+CO32-(样品,淋洗液)H+H++CO32-H++X-

至检测器H2CO3H+X-H+

+O2H2OH2

+OH-H2ONa+OH-,H2H2O,O2废液废液电极（－）电极（＋）纯水或来自检测器的流体

H+H+H+H+阳离子交换膜阳离子交换膜H2OH2OH+

+O2H2OH2

+OH-H2O废液/气体废液H2OSO42-Y+

X-H+MSA-(样品e,淋洗液）OH-OH-MSA-SO42-X-OH-MSA-SO42-X-H+MSA-,O2H2O,H2H++OH-Y++OH-

H+

抑制器的工作原理(阳离子)

至检测器H2OY+OH-X-:

样品中的阴离子Y+:

样品中的阳离子电极（＋）电极（－）阴离子交换膜阴离子交换膜纯水或来自检测器的液体

铂网电极—电解水产生氢离子和氢氧根离子国内暂时还无法生产网离子交换膜许多国家、国际组织将离子色谱法作为标准方法中国：GB饮用天然矿泉水水检测方法；美国：USEPA（USEnv.ProtectAgency）；

ASTM（AmericaSocietyforTestingandMaterials）；

ISO

（InternationalOrganizationforStandardization）。

应用领域电力冷却水

/HPW

锅炉蒸汽中的杂质食品

/饮料

酒/饮料/糖果

饮料中有机酸造纸./纸浆

纸浆液・处理水

纸和液体中的离子农业肥料

/土壤/植物

/等

土壤中离子医学血液

/尿

尿中草酸化妆品化妆品

/清洁剂/洗发液

化妆品液体中的阴离子制药化学

/液体

化学品中的重金属领域环境./污染

雨水/河水/大气/污水

雨水中离子城市用水自来水

/水源

自来水中消毒副产物样品应用化学品设备提取物

/聚合物

环氧类粘合剂中的阴离子电子/半导体

高纯水・晶片冲洗水

高纯水中的离子型杂质金属/钢材

表面处理液・镀槽・冷却水

电镀槽中的抗坏血酸

离子色谱法的应用分离阴离子Column：IonPac

AG12A/AS12A

Eluent

：

2.7mMNa2CO3

0.3mMNaHCO3

Flowrate：1.2mL/minDetection：Conductivity(ASRSRecyclemode)

0246810121416Retentiontime(min)08mSF-NO3-SO42-Cl-NO2-Br-H2PO4-水的系统峰☆分离无机盐（离子）Column:IonPacCS12A,

CG12AEluent:20mM

MethanesulfonicacidFlowrate:1.0mL/minDetection:Conductivity

（CSRSRecycle

mode)分离阳离子02468101214Retentiontime(min)01234Na+NH4+K+Mg2+Ca2+µS水的系统峰☆离子色谱分析时产生的系统峰（亦称负峰、倒峰）

抑制型离子色谱