专题18 生物技术与工程综合 -5年（2020-2024）高考1年模拟生物真题分类汇编（解析版）

2020-2024年五年高考真题分类汇编PAGEPAGE1专题18生物技术与工程综合考向五年考情考情分析生物技术与工程综合2024年6月浙江卷第23题2024年1月浙江卷第22题2023年6月浙江卷第23题2023年1月浙江卷第24题2022年6月浙江卷第29题2022年1月浙江卷第29题2021年6月浙江卷第29题2021年1月浙江卷第29题2020年7月浙江卷第29题2020年1月浙江卷第29题选择性必修3模块的综合考查，以发酵工程、细胞工程的真实情景为引入，结合多个工程的知识进行解答，其中基因工程基本上年年考查，这一模块考查学生基础知识掌握程度、知识综合应用能力、分析和获取信息的能力。1、（2024年6月浙江卷）植物体在干旱、虫害或微生物侵害等胁迫过程中会产生防御物质，这类物质属于次生代谢产物。次生代谢产物在植物抗虫、抗病等方面发挥作用，也是药物、香料和色素等的重要来源。次生代谢产物X的研发流程如下：筛选高产细胞→细胞生长和产物X合成关系的确定→发酵生产X回答下列问题：（1）获得高产细胞时，以X含量高的植物品种的器官和组织作为_____，经脱分化形成愈伤组织，然后通过液体振荡和用一定孔径的筛网进行_____获得分散的单细胞。（2）对分离获得的单细胞进行_____培养，并通过添加_____或营养缺陷培养方法获取细胞周期同步、遗传和代谢稳定、来源单一的细胞群。为进一步提高目标细胞的X含量，将微生物菌体或其产物作为诱导子加入到培养基中，该过程模拟了_____的胁迫。（3）在大规模培养高产细胞前，需了解植物细胞生长和产物合成的关系。培养细胞生产次生代谢产物的模型分为3种，如图所示。若X只在细胞生长停止后才能合成，则X的合成符合图_____（填“甲”“乙”“丙”），根据该图所示的关系，从培养阶段及其目标角度，提出获得大量X的方法。_____（4）多种次生代谢产物在根部合成与积累，如人参、三叶青等药用植物，可通过_____培养替代细胞悬浮培养生产次生代谢产物。随着基因组测序和功能基因组学的发展，在全面了解生物体合成某次生代谢产物的_____和_____的基础上，可利用合成生物学的方法改造酵母菌等微生物，利用_____工程生产植物的次生代谢产物。【答案】（1）①.外植体②.过滤（2）①.扩大②.过量的胸苷③.微生物侵害（3）①.丙②.将细胞培养至稳定期（即停止生长时期）一定时间后，通过分离提纯获得大量X（4）①.根的水培养②.相关基因组成③.基因表达过程④.基因工程和发酵【解析】〖祥解〗1、植物组织培养就是在无菌和人工控制的条件下，将离体的植物器官、组织、细胞，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其产生愈伤组织、丛芽，最终形成完整的植株。2、植物组织培养的条件：①细胞离体和适宜的外界条件（如适宜温度、适时的光照、pH和无菌环境等）；②一定的营养（无机、有机成分）和植物激素（生长素和细胞分裂素）。【小问1详析】植物体的器官和组织、细胞都可以作为外植体，经脱分化形成愈伤组织，将愈伤组织进行振荡培养，使其分散成小的细胞团或单细胞，然后用适当孔径的不锈钢筛网过滤，除去大的细胞团和残渣，离心除去小的残渣，得到单细胞悬浮液。【小问2详析】分离获得的单细胞进行扩大培养，并通过添加过量胸苷，（向细胞培养液中加入过量胸苷（TdR），处于S期的细胞立刻被抑制，洗去TdR后可恢复正常分裂，而处于其它时期的细胞不受过量TdR影响）或营养缺陷培养方法获取细胞周期同步、遗传和代谢稳定、来源单一的细胞群。将微生物菌体或其产物作为诱导子加入到培养基中，模拟了微生物侵害的迫害条件。【小问3详析】由题可知X只在细胞生长停止后才能合成，所以丙图符合。所以要获得大量X的方法，是将细胞培养知稳定期（即停止生长时期）一定时间后，通过分离提纯获得大量X。【小问4详析】由题知，多种次生代谢产物在根部合成与积累，所以要对根进行培养，为了方便进行次生代谢物的收集，可以对根进行水培。要大量获得次生代谢物可以通过基因工程，将相关基因转入酵母菌体内，然后通过发酵工程获得，基因工程的前提是要了解生物体合成某次生代谢产物的相关基因组成和基因表达过程。2、（2024年1月浙江卷）锌转运蛋白在某种植物根部细胞特异性表达并定位于细胞质膜，具有吸收和转运环境中Zn2+的功能。为研究该植物2种锌转运蛋白M和N与吸收Zn2+相关的生物学功能，在克隆M、N基因基础上，转化锌吸收缺陷型酵母，并进行细胞学鉴定。回答下列问题：（1）锌转运蛋白基因M、N克隆。以该植物______为材料提取并纯化mRNA，反转录合成cDNA。根据序列信息设计引物进行PCR扩增，PCR每个循环第一步是进行热变性处理，该处理的效果类似于生物体内______的作用效果。PCR产物琼脂糖凝胶电泳时，DNA分子因为含______而带负电荷，凝胶点样孔端应靠近电泳槽负极接口；当2个PCR产物分子量接近时，若延长电泳时间，凝胶中这2个条带之间的距离会______。回收DNA片段，连接至克隆载体，转化大肠杆菌，测序验证。（2）重组表达载体构建。分别将含M、N基因的重组质粒和酵母表达载体同时进行双酶切处理，然后利用______连接，将得到的重组表达载体转化大肠杆菌。用PCR快速验证重组转化是否成功。此反应可以用大肠杆菌悬液当模板的原因是______。（3）酵母菌转化。取冻存的锌吸收缺陷型酵母菌株，直接在固体培养基进行______培养，活化后接种至液体培养基，采用______以扩大菌体数量，用重组表达载体转化酵母菌。检测M、N基因在受体细胞中的表达水平，无显著差异。（4）转基因酵母功能鉴定。分别将转化了M、N基因的酵母菌株于液体培养基中培养至OD600为0.6。将菌液用______法逐级稀释至OD600为0.06、0.006和0.0006，然后各取10μL菌液用涂布器均匀涂布在固体培养基上，培养2天，菌落生长如图。该实验中阴性对照为______。由实验结果可初步推测：转运蛋白M和N中，转运Zn2+能力更强的是______，依据是______。注：OD600为波长600nm下的吸光值，该值越大，菌液浓度越高；空载体为未插入M或N基因的表达载体。【答案】（1）①.根②.解旋酶③.磷酸基团④.变长（2）①.DNA连接酶②.热变性使大肠杆菌内的DNA外溢（3）①.划线分离②.振荡培养（4）①.梯度稀释②.锌吸收缺陷型酵母+空载体③.N④.转入N基因的这组酵母菌数量数量多【解析】〖祥解〗由图中光谱吸收值可知，锌吸收缺陷型酵母+N基因表达载体组吸收值与野生型酵母+空载体组相近，转入N基因的这组酵母菌数量数量多，说明N转运Zn2+能力更强。【小问1详析】由题意可知，锌转运蛋白在某种植物根部细胞特异性表达并定位于细胞质膜，所以以该植物的根为材料提取并纯化mRNA，反转录合成cDNA。热变性处理的目的是使DNA解螺旋，相当于生物体内解旋酶的效果。DNA分子因为含有磷酸基团而带负电荷，所以其点样孔端应靠近电泳槽负极接口。随着时间的推移，不同分子量的DNA分子速度不同，时间越长，距离差越大。【小问2详析】内切酶处理后的质粒和目的基因，用DNA连接酶进行连接。由于RCR过程中热变性使大肠杆菌内的DNA外溢，所以可用大肠杆菌悬液当模板，利用PCR快速验证重组转化是否成功。【小问3详析】冻存酵母菌可直接在固体培养基上涂布或平板划线接种后进行培养，进行活化，然后转至液体培养基增殖，培养过程中进行震荡，有利于增加培养液的溶氧量和使酵母菌和培养液充分接触，从而快速增殖。【小问4详析】由题意可知，菌液稀释后OD600为0.06、0.006和0.0006，说明其进行10指数的梯度稀释。由图可知，锌吸收缺陷型酵母+空载体组不会吸收锌，为阴性对照。由图中光谱吸收值可知，转入N基因的这组酵母菌数量数量多，说明N转运Zn2+能力更强。3、（2023年6月浙江卷）赖氨酸是人体不能合成的必需氨基酸，而人类主要食物中的赖氨酸含量很低，利用生物技术可提高食物中赖氨酸含量。回答下列问题：（1）植物细胞合成的赖氨酸达到一定浓度时，能抑制合成过程中两种关键酶的活性，导致赖氨酸含量维持在一定浓度水平，这种调节方式属于______。根据这种调节方式，在培养基中添加______，用于筛选经人工诱变的植物悬浮细胞，可得到抗赖氨酸类似物的细胞突变体，通过培养获得再生植株。（2）随着转基因技术与动物细胞工程结合和发展，2011年我国首次利用转基因和体细胞核移植技术成功培育了高产赖氨酸转基因克隆奶牛。其基本流程为：①构建乳腺专一表达载体。随着测序技术的发展，为获取富含赖氨酸的酪蛋白基因（目的基因），可通过检索______获取其编码序列，用化学合成法制备得到。再将获得的目的基因与含有乳腺特异性启动子的相应载体连接，构建出乳腺专一表达载体。②表达载体转入牛胚胎成纤维细胞（BEF）。将表达载体包裹到磷脂等构成的脂质体内，与BEF膜发生______，表达载体最终进入细胞核，发生转化。③核移植。将转基因的BEF作为核供体细胞，从牛卵巢获取卵母细胞，经体外培养及去核后作为______。将两种细胞进行电融合，电融合的作用除了促进细胞融合，同时起到了______重组细胞发育的作用。④重组细胞的体外培养及胚胎移植。重组细胞体外培养至______，植入代孕母牛子宫角，直至小牛出生。⑤检测。DNA水平检测：利用PCR技术，以非转基因牛耳组织细胞作为阴性对照，以______为阳性对照，检测到转基因牛耳组织细胞中存在目的基因。RNA水平检测：从非转基因牛乳汁中的脱落细胞、转基因牛乳汁中的脱落细胞和转基因牛耳组织细胞，提取总RNA，对总RNA进行______处理，以去除DNA污染，再经逆转录形成cDNA，并以此为______，利用特定引物扩增目的基因片段。结果显示目的基因在转基因牛乳汁中的脱落细胞内表达，而不在牛耳组织细胞内表达，原因是什么？______。【答案】（1）①.负反馈调节②.过量赖氨酸类似物（2）①.基因数据库②.融合③.核受体细胞④.激活⑤.早期囊胚⑥.转基因BEF

⑦.DNA酶

⑧.PCR的模板⑨.构建的表达载体只含有乳腺特异性启动子，只能在乳腺细胞中启动转录，而在牛耳细胞中不能表达。【解析】〖祥解〗负反馈调节是指在一个系统中，系统工作的效果，反过来又作为信息调节该系统的工作，并且使系统工作的效果减弱或受到限制，有助于系统保持稳定。基因工程技术的基本步骤：(1)目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；(2)基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；(3)将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样.将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；(4)目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因-DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA-分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质抗原抗体杂交技术.个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。【小问1详析】负反馈调节是指在一个系统中，系统工作效果，反过来又作为信息调节该系统的工作，并且使系统工作的效果减弱或受到限制，有助于系统保持稳定。植物细胞合成的赖氨酸达到一定浓度时，能抑制合成过程中两种关键酶的活性，导致赖氨酸含量维持在一定浓度水平，这种调节方式属于负反馈调节。如果想得到抗赖氨酸类似物的细胞突变体可在培养基中添加过量赖氨酸类似物。【小问2详析】①从基因数据库获取获取目的基因编码序列，用化学合成法制备可得到目的基因。②表达载体包裹到磷脂等构成的脂质体内，根据细胞膜成分，其与BEF膜发生融合。③去核的卵母细胞作为受体细胞，其处于减数第二次分裂中期，因为卵母细胞中含有促使细胞核表达全能性的物质和营养条件。电融合的作用除了促进细胞融合，同时起到了激活重组细胞发育的作用。④胚胎发育到适宜阶段可取出向受体移植。牛、羊一般要培养到桑椹胚或囊胚阶段；植入代孕母牛子宫角，直至小牛出生。⑤阳性对照：按照当前实验方案一定能得到正面预期结果的对照实验。阳性对照是已知的对测量结果有影响的因素，目的是确定实验程序无误。阴性对照和阳性对照相反，按照当前的实验方案一定不能得到正面预期结果的对照实验。排除未知变量对实验产生的不利影响。本实验以非转基因牛耳组织细胞作为阴性对照，为了检测到转基因牛耳组织细胞中存在目的基因。应该以含有目的基因的牛耳组织细胞为阳性对照。为了除去DNA污染，可以使用DNA酶使其水解。经逆转录形成cDNA，并以此为PCR的模板进行扩增。目的基因在转基因牛乳汁中的脱落细胞内表达，而不在牛耳组织细胞内表达，原因是构建的表达载体只含有乳腺特异性启动子，只能在乳腺细胞中启动转录，而在牛耳细胞中不能表达。4、（2023年1月浙江卷）甲植物细胞核基因具有耐盐碱效应，乙植物细胞质基因具有高产效应。某研究小组用甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交相关研究，基本过程包括获取原生质体、诱导原生质体融合、筛选融合细胞、杂种植株再生和鉴定，最终获得高产耐盐碱再生植株。回答下列问题：（1）根据研究目标，在甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交前，应检验两种植物的原生质体是否具备__________的能力。为了便于观察细胞融合的状况，通常用不同颜色的原生质体进行融合，若甲植物原生质体采用幼苗的根为外植体，则乙植物可用幼苗的__________为外植体。（2）植物细胞壁的主要成分为__________和果胶，在获取原生质体时，常采用相应的酶进行去壁处理。在原生质体融合前，需对原生质体进行处理，分别使甲原生质体和乙原生质体的__________失活。对处理后的原生质体在显微镜下用__________计数，确定原生质体密度。两种原生质体1∶1混合后，通过添加适宜浓度的PEG进行融合；一定时间后，加入过量的培养基进行稀释，稀释的目的是__________。（3）将融合原生质体悬浮液和液态的琼脂糖混合，在凝固前倒入培养皿，融合原生质体分散固定在平板中，并独立生长、分裂形成愈伤组织。同一块愈伤组织所有细胞源于__________。下列各项中能说明这些愈伤组织只能来自于杂种细胞的理由是哪几项？__________A．甲、乙原生质体经处理后失活，无法正常生长、分裂B．同种融合的原生质体因甲或乙原生质体失活而不能生长、分裂C．培养基含有抑制物质，只有杂种细胞才能正常生长、分裂D．杂种细胞由于结构和功能完整可以生长、分裂（4）愈伤组织经__________可形成胚状体或芽。胚状体能长出__________，直接发育形成再生植株。（5）用PCR技术鉴定再生植株。已知甲植物细胞核具有特异性DNA序列a，乙植物细胞质具有特异性DNA序列b；M1、M2为序列a的特异性引物，N1、N2为序列b的特异性引物。完善实验思路：Ⅰ．提取纯化再生植株的总DNA，作为PCR扩增的__________。Ⅱ．将DNA提取物加入PCR反应体系，__________为特异性引物，扩增序列a；用同样的方法扩增序列b。Ⅲ．得到的2个PCR扩增产物经__________后，若每个PCR扩增产物在凝胶中均出现了预期的__________个条带，则可初步确定再生植株来自于杂种细胞。【答案】（1）①.再生②.叶（2）①.纤维素②.细胞质和细胞核③.血细胞计数板④.降低PEG浓度，使其失去融合作用（3）①.同一个杂种融合原生质体②.ABD（4）①.再分化②.根和芽（5）①.模板②.M1、M2③.凝胶电泳④.1【解析】〖祥解〗1、植物组织培养过程：离体的植物组织经过脱分化形成愈伤组织，经过再分化愈伤组织又能重新分化为有结构的组织和器官，最终形成完整的植株。2、植物体细胞杂交可以克服植物有性杂交不亲和性、打破物种之间的生殖隔离，操作过程包括:原生质体制备、原生质体融合、杂种细胞筛选、杂种细胞培养、杂种植株再生以及杂种植株鉴定等步骤。【小问1详析】在甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交前，应检验两种植物的原生质体是否具备再生的能力。为了便于观察细胞融合的状况，通常用不同颜色的原生质体进行融合，若甲植物原生质体采用幼苗的根为外植体，则乙植物可用幼苗的叶为外植体。【小问2详析】植物细胞壁的主要成分为纤维素和果胶，在获取原生质体时，常采用相应的酶进行去壁处理。甲植物细胞核基因具有耐盐碱效应，乙植物细胞质基因具有高产效应，在原生质体融合前，需对原生质体进行处理，分别使甲原生质体和乙原生质体的细胞质和细胞核失活，融合后具有甲植物的细胞核基因和乙植物的细胞质基因。对处理后的原生质体在显微镜下用血细胞计数板计数，确定原生质体密度。两种原生质体1∶1混合后，通过添加适宜浓度的PEG进行融合；一定时间后，加入过量的培养基进行稀释，稀释的目的是降低PEG浓度,使其失去融合作用。【小问3详析】将融合原生质体悬浮液和液态的琼脂糖混合，在凝固前倒入培养皿，融合原生质体分散固定在平板中，并独立生长、分裂形成愈伤组织。同一块愈伤组织所有细胞源于同一个杂种融合的原生质体。未融合的原生质体因为细胞质或细胞核的失活，无法正常生长、分裂；同种融合的原生质体也因为甲原生质体细胞质或乙原生质体细胞核失活而不能生长、分裂；只有杂种细胞才具备有活性的细胞质和细胞核，可以生长、分裂，因此这些愈伤组织只能来自于杂种细胞。故选ABD。【小问4详析】愈伤组织经再分化可形成胚状体或芽。胚状体能长出根和芽，直接发育形成再生植株。【小问5详析】Ⅰ．提取纯化再生植株的总DNA，作为PCR扩增的模板。Ⅱ．将DNA提取物加入PCR反应体系，M1、M2为特异性引物，扩增序列a；用同样的方法扩增序列b。Ⅲ．得到的2个PCR扩增产物经凝胶电泳后，若每个PCR扩增产物在凝胶中均出现了预期的1个条带，则可初步确定再生植株来自于杂种细胞。5、（2022年6月浙江卷）回答下列（一）、（二）小题：（一）回答与产淀粉酶的枯草杆菌育种有关的问题：（1）为快速分离产淀粉酶的枯草杆菌，可将土样用___________制成悬液，再将含有悬液的三角瓶置于80℃的___________中保温一段时间，其目的是___________。（2）为提高筛选效率，可将菌种的___________过程与菌种的产酶性能测定一起进行：将上述悬液稀释后涂布于淀粉为唯一碳源的固体培养基上培养，采用___________显色方法，根据透明圈与菌落直径比值的大小，可粗略估计出菌株是否产酶及产酶性能。（3）为了获得高产淀粉酶的枯草杆菌，可利用现有菌种，通过___________后再筛选获得，或利用转基因、___________等技术获得。（二）回答与植物转基因和植物克隆有关的问题：（4）在用农杆菌侵染的方法进行植物转基因过程中，通常要使用抗生素，其目的一是抑制___________生长，二是筛选转化细胞。当选择培养基中抗生素浓度___________时，通常会出现较多假阳性植株，因此在转基因前需要对受体进行抗生素的___________检测。（5）为提高培育转基因植株的成功率，植物转基因受体需具有较强的___________能力和遗传稳定性。对培养的受体细胞遗传稳定性的早期检测，可通过观察细胞内___________形态是否改变进行判断，也可通过观察分裂期染色体的___________，分析染色体组型是否改变进行判断。（6）植物转基因受体全能性表达程度的高低主要与受体的基因型、培养环境、继代次数和___________长短等有关。同时也与受体的取材有关，其中受体为___________时全能性表达能力最高。【答案】（1）①.无菌水②.水浴③.杀死不耐热微生物（2）①.分离②.KI-I2（3）①.人工诱变②.原生质体融合（4）①.农杆菌②.过低③.敏感性（5）①.再生②.细胞核③.形态特征和数量（6）①.培养时间②.受精卵【解析】〖祥解〗（一）选择培养基是根据某种微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性而设计的培养基使混合菌样中的劣势菌变成优势菌，从而提高该菌的筛选率。（二）农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。根据农杆菌的这一特点，如果将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以把目的基因整合到植物细胞中染色体的DNA上。转化过程：目的基因插入Ti质粒的T-DNA上农杆菌→导入植物细胞→目的基因整合到植物细胞染色体上→目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。【小问1详析】产生淀粉酶的枯草杆菌的最适温度为50-75℃，要快速分离枯草杆菌，先将土样加入无菌水制成枯草杆菌悬液，再将含有悬液的三角瓶置于80℃的水浴中保温一段时间，杀死不耐热的微生物。【小问2详析】将菌种的分离过程与菌种的产酶性能测定同时进行可以提高筛选效率。用稀释涂布平板法可以分离枯草杆菌，在培养基中添加淀粉作为唯一碳源，并且在培养基中添加KI-I2，能合成淀粉酶的枯草杆菌因为能利用淀粉而存活，同时淀粉由于被分解在菌落周围会出现透明圈，比较透明圈与菌落直径比值的大小，比值大的说明该菌株产酶性能较高。【小问3详析】要获得高产淀粉酶的枯草杆菌，可利用诱变育种，由于变异的不定向性，人工诱变后还需要再筛选才能获得高产淀粉酶的枯草杆菌。也可以利用转基因、原生质体融合等技术，从其他生物那里获得与高产淀粉酶有关的基因，进而获得相应的高产性状。【小问4详析】野生的农杆菌没有抗性基因，用于转化植物细胞的农杆菌一般在其T—DNA中插入一种抗生素抗性基因。抗生素的作用是抑制细菌生长，农杆菌属于细菌，在其侵染植物过程中，可以用另一种抗生素抑制农杆菌的生长，从而达到在后续实验中消除转化植物细胞中农杆菌的作用。具有T-DNA中抗性基因的细胞能在含有相应抗生素的培养基上存活。当培养基中抗生素浓度过低时，很多没有抗性的细胞也存活下来，因此出现假阳性，故在转基因前要对受体进行抗生素的敏感性检测。【小问5详析】转基因植株要经过植物组织培育，要提高培育转基因植株的成功率，应该选再生能力和遗传稳定性较强的受体，这种受体全能性较高，能保持生物的性状。对培养的受体细胞遗传稳定性的早期检测，可通过观察细胞核形态是否改变进行判断，也可以直接在光学显微镜下观察分裂期染色体的形态特征和数量，分析染色体组型是否改变。【小问6详析】植物转基因受体全能性表达程度高低除了与受体基因型、培养环境、继代次数有关外，还与培养时间长短和受体的取材有关，受精卵是没分化的细胞，分裂和分化能力都很强，故受体为受精卵时全能性表达能力最高。6、（2022年1月浙江卷)回答下列（一）、（二）小题：（一）红曲霉合成的红曲色素是可食用的天然色素，具有防腐、降脂等功能。研究者进行了红曲色素的提取及红色素的含量测定实验，流程如下：（1）取红曲霉菌种斜面，加适量____________洗下菌苔，制成菌悬液并培养，解除休眠获得____________菌种。经液体发酵，收集红曲霉菌丝体，红曲霉菌丝体与70%乙醇溶液混合，经浸提、____________，获得的上清液即为红曲色素提取液。为进一步提高红曲色素得率，可将红曲霉细胞进行____________处理。（2）红曲色素包括红色素、黄色素和橙黄色素等，红色素在390nm、420nm和505nm波长处均有较大吸收峰。用光电比色法测定红曲色素提取液甲的红色素含量时，通常选用505nm波长测定的原因是____________。测定时需用____________作空白对照。（3）生产上提取红曲色素后的残渣，经__________处理后作为饲料添加剂或有机肥，这属于废弃物的无害化和__________处理。（二）我国在新冠疫情方面取得了显著的成效，但全球疫情形势仍然非常严峻、尤其是病毒出现了新变异株——德尔塔、奥密克戎，更是威胁着全人类的生命健康。（4）新冠病毒核酸定性检测原理是：以新冠病毒的单链RNA为模板，利用__________酶合成DNA，经PCR扩增，然后在扩增产物中加入特异的__________，如果检测到特异的杂交分子则核酸检测为阳性。（5）接种疫苗是遏制新冠疫情蔓延的重要手段。腺病毒疫苗的制备技术要点是：将腺病毒的复制基因敲除；以新冠病毒的__________基因为模板合成的DNA插入腺病毒基因组，构建重组腺病毒。重组腺病毒在人体细胞内表达产生新冠病毒抗原，从而引发特异性免疫反应。在此过程中，腺病毒的作用是作为基因工程中目的基因的____________。将腺病毒复制基因敲除的目的是____________。（6）单克隆抗体有望用于治疗新冠肺炎。单克隆抗体的制备原理是：取免疫阳性小鼠的____________细胞与骨髓瘤细胞混合培养，使其融合，最后筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。与植物组织培养相比，杂交瘤细胞扩大培养需要特殊的成分，如胰岛素和____________。【答案】（1）①.无菌水②.活化③.离心④.破碎（2）①.其它色素对该波长光的吸收相对较少，干扰相对较小②.70%乙醇溶液（3）①.灭菌②.资源化（4）①.逆转录②.核酸探针（5）①.抗原②.载体③.使腺病毒失去复制能力（6）①.脾②.动物血清【解析】〖祥解〗1、无菌操作包括灭菌和消毒两种方式。消毒的方法有巴氏消毒法、酒精消毒、煮沸消毒法；灭菌的方法有干热灭菌、灼烧灭菌和高压蒸汽灭菌。2、微生物接种：微生物接种的方法很多，最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法，常用来统计样品活菌数目的方法是稀释涂布平板法。3、平板划线法：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。【小问1详析】防止污染，洗菌苔可加适量的无菌水，制成菌悬液并培养，解除休眠获得活化菌种。红曲霉菌丝体与70%乙醇溶液混合，经浸提、离心，获得的上清液即为红曲色素提取液。为进一步提高红曲色素得率，可将红曲霉细胞进行破碎处理，使细胞内的红曲色素释放出来。【小问2详析】用光电比色法测定红曲色素提取液甲的红色素含量时，通常选用505nm波长测定的原因是其它色素对该波长光的吸收相对较少，干扰相对较小。由于提取红曲色素是用的70%乙醇溶液，故测定时需用70%乙醇溶液作空白对照。7、(2021年6月浙江卷)回答下列（一）、（二）小题：（一）回答与甘蔗醋制作有关的问题：（1）为了获得酿造甘蔗醋的高产菌株，以自然发酵的甘蔗渣为材料进行筛选。首先配制醋酸菌选择培养基：将适量的葡萄糖、KH2PO4、MgSO4溶解并定容，调节pH，再高压蒸汽灭菌，经__________后加入3%体积的无水乙醇。然后将10g自然发酵的甘蔗渣加入选择培养基，振荡培养24h。用__________将少量上述培养液涂布到含CaCO3的分离培养基上，在30℃培养48h。再挑取分离培养基上具有__________的单菌落若干，分别接种到与分离培养基成分相同的__________培养基上培养24h后，置于4℃冰箱中保存。（2）优良产酸菌种筛选。将冰箱保存的菌种分别接入选择培养基，培养一段时间后，取合适接种量的菌液在30℃、150r/min条件下振荡培养。持续培养至培养液中醋酸浓度不再上升，或者培养液中______含量达到最低时，发酵结束。筛选得到的优良菌种除了产酸量高外，还应有____________________（答出2点即可）等特点。（3）制醋过程中，可将甘蔗渣制作成固定化介质，经_________后用于发酵。其固定化方法为_________。（二）斑马鱼是一种模式动物，体外受精发育，胚胎透明、便于观察，可用于水质监测，基因功能分析以及药物毒性与安全性评价等。（1）由于人类活动产生的生活污水日益增多，大量未经处理的污水直接排入河流、湖泊会引起水体__________，导致藻类大量繁殖形成水华。取水样喂养斑马鱼，可用斑马鱼每周的体重和死亡率等指标监测水体污染程度。（2）为了研究某基因在斑马鱼血管发育过程中的分子调控机制，用DNA连接酶将该基因连接到质粒载体形成_______，导入到大肠杆菌菌株DH5α中。为了能够连接上该目的基因、并有利于获得含该目的基因的DH5α阳性细胞克隆，质粒载体应含有__________（答出2点即可）。提取质粒后，采用____法，将该基因导入到斑马鱼受精卵细胞中，培养并观察转基因斑马鱼胚胎血管的发育情况。（3）为了获取大量斑马鱼胚胎细胞用于药物筛选，可用__________分散斑马鱼囊胚的内细胞团，取分散细胞作为初始材料进行__________培养。培养瓶中添加成纤维细胞作为__________，以提高斑马鱼胚胎细胞克隆的形成率。【答案】①.冷却②.玻璃刮刀③.较大透明圈④.斜面⑤.乙醇⑥.耐酒精度高、耐酸高⑦.灭菌⑧.吸附法⑨.富营养化⑩.重组DNA分子⑪.限制性核酸内切酶的识别序列、抗生素抗性基因⑫.显微注射⑬.胰蛋白酶⑭.原代⑮.饲养层细胞【解析】〖祥解〗1、涂布法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在固体培养皿表面，经培养后可形成单个菌落，是筛选高表达量菌株的常用方法；2、基因工程的基本操作步骤为：获取目的基因、形成重组DNA分子、将重组DNA分子导入受体细胞、筛选含有目的基因的受体细胞和目的基因的表达。【详析】（一）（1）高压蒸汽灭菌刚结束时，培养基温度较高，要等培养基冷却后再加入3%体积的无水乙醇。涂布分离法可用于单菌落分离，使用玻璃刮刀将待分离的菌液涂布到分离培养基的整个平面上。醋酸菌发酵产生的醋酸会使培养基中的CaCO3分解，形成透明圈。菌落小，透明圈大，代表着高产醋酸菌。菌种的贮存方法：在无菌操作下将单菌落用接种环取出，再用划线法接种在斜面培养基上，培养24h后，置于4℃冰箱中保存。（2）醋酸发酵结束的标志性：产物不再增加（醋酸浓度不再上升）或原料消耗到最低值（乙醇含量达到最低）。优质菌种不光要产酸高，还要耐高酸，同时还要耐酒精（原料）等特点。（3）我们在利用微生物时，常常要求所利用的微生物不被其他微生物污染。因此，在培养微生物时必须进行无菌操作，所以作为固定化介质的甘蔗渣需要经过灭菌处理。甘蔗渣类似果醋发酵装置中的锯末，可使醋杆菌吸附在甘蔗渣上进行发酵。（二）（1）生活污水富含N、P，未经处理就大量排放，会导致水体富营养化，导致藻类大量繁殖形成水华或赤潮。（2）具有相同黏性末端的目的基因和载体DNA（如质粒），经DNA连接酶处理后，会形成重组DNA分子。与目的基因相同的限制性核酸内切酶识别序列，可以确保限制性内切酶处理后与目的基因形成相同的黏性末端，以便于和目的基因的连接。标记基因（抗生素抗性基因）的存在，便于筛选含有目的基因的受体细胞。动物基因工程，通常采用显微注射法将重组DNA分子导入动物受精卵中。（3）使用胰蛋白酶处理囊胚的内细胞团，借助酶的专一性，可分解细胞间质的蛋白质，让细胞分散，便于培养。将分散的细胞初次在卡氏瓶中培养，称之为原代培养。提高细胞克隆形成率的措施有：选择适宜的培养基、添加血清（胎牛血清最好）、饲养层细胞（滋养细胞如经射线照射本身失去增殖力的小鼠成纤维细胞）支持生长、激素（胰岛素等）刺激、使用CO2培养箱、调节pH等。8、(2021年1月浙江卷)回答下列（一）、（二）小题：（一）某环保公司从淤泥中分离到一种高效降解富营养化污水污染物的细菌菌株，制备了固定化菌株。（1）从淤泥中分离细菌时常用划线分离法或________法，两种方法均能在固体培养基上形成________。对分离的菌株进行诱变、________和鉴定，从而获得能高效降解富营养化污水污染物的菌株。该菌株只能在添加了特定成分X的培养基上繁殖。（2）固定化菌株的制备流程如下；①将菌株与该公司研制的特定介质结合；②用蒸馏水去除________；③检验固定化菌株的________。菌株与特定介质的结合不宜直接采用交联法和共价偶联法，可以采用的2种方法是________。（3）对外，只提供固定化菌株有利于保护该公司的知识产权，推测其原因是________。（二）三叶青为蔓生的藤本植物，以根入药。由于野生三叶青对生长环境要求非常苛刻，以及生态环境的破坏和过度的采挖，目前我国野生三叶青已十分珍稀。（1）为保护三叶青的________多样性和保证药材的品质，科技工作者依据生态工程原理，利用________技术，实现了三叶青的林下种植。（2）依据基因工程原理，利用发根农杆菌侵染三叶青带伤口的叶片，叶片产生酚类化合物，诱导发根农杆菌质粒上vir系列基因表达形成________和限制性核酸内切酶等，进而从质粒上复制并切割出一段可转移的DNA片段（T-DNA）。T-DNA进入叶片细胞并整合到染色体上，T-DNA上rol系列基因表达，产生相应的植物激素，促使叶片细胞持续不断地分裂形成________，再分化形成毛状根。（3）剪取毛状根，转入含头孢类抗生素的固体培养基上进行多次________培养，培养基中添加抗生素的主要目的是________。最后取毛状根转入液体培养基、置于摇床上进行悬浮培养，通过控制摇床的________和温度，调节培养基成分中的________，获得大量毛状根，用于提取药用成分。【答案】①.涂布分离②.单菌落③.筛选④.未固定的细菌⑤.降解富营养化污水污染物的能力⑥.包埋法和吸附法⑦.特定介质能为菌株繁殖提供X⑧.遗传⑨.间种⑩.DNA聚合酶⑪.愈伤组织⑫.继代⑬.杀灭发根农杆菌⑭.转速⑮.营养元素以及生长调节剂的种类和浓度【解析】〖祥解〗1、分离纯化细菌最常用的方法是划线分离法（平板划线法）和涂布分离法（稀释涂布平板法）。接种的目的是使聚集在一起的微生物分散成单个细胞，并在培养基表面形成单个细菌繁殖而成的子细胞群体--菌落。划线分离法，方法简单；涂布分离法，单菌落更易分开，但操作复杂些。2、固定化酶(insolubleenzyme)就是将水溶性的酶用物理或化学的方法固定在某种介质上，使之成为不溶于水而又有酶活性的制剂。固定化的方法有吸附法、共价偶联法、交联法和包埋法等。3、植物组织培养的原理是植物细胞具有全能性，其具体过程：外植体→愈伤组织→胚状体→新植体，其中脱分化过程要避光，而再分化过程需光。4、在植物组织培养时，通过调节生长素和细胞分裂素的比值能影响愈伤组织分化出根或芽。【详析】（一）分析题意可知，本实验目的是从淤泥中分离到一种高效降解富营养化污水污染物的细菌菌株，制备固定化菌株。（1）分离纯化细菌最常用的方法是划线分离法或涂布分离法，两种方法均能在固体培养基上形成单菌落。为了获得能高效降解富营养化污水污染物的菌株，还需对分离的菌株进行诱变处理，再经筛选和鉴定。（2）固定化的方法有吸附法、共价偶联法、交联法和包埋法等。由于菌株与特定介质的结合不宜直接采用交联法和共价偶联法，故可以采用的2种方法是包埋法和吸附法。（3）由于该菌株只能在添加了特定成分X的培养基上繁殖，可推测特定介质能为菌株繁殖提供X，故该公司对外只提供固定化菌株，有利于保护该公司的知识产权。（二）（1）生物多样性包括遗传多样性、物种多样性和生态系统多样性，为保护三叶青的遗传多样性和保证药材的品质；三叶青的林下种植，是利用间种技术。（2）分析题意可知，从质粒上复制并切割出一段可转移的DNA片段（T-DNA），DNA复制需要DNA聚合酶，故可知，酚类化合物诱导发根农杆菌质粒上vir系列基因表达，形成DNA聚合酶和限制性核酸内切酶等。根据植物组织培养技术过程可知，相应植物激素可以促使叶片细胞脱分化形成愈伤组织，再分化形成毛状根。（3）剪取毛状根，转入含头孢类抗生素的固体培养基上进行多次继代培养，培养基中添加抗生素的主要目的是杀灭发根农杆菌。最后取毛状根转入液体培养基、置于摇床上进行悬浮培养，通过控制摇床的转速和温度，调节培养基成分中的营养元素以及生长调节剂的种类和浓度，获得大量毛状根，用于提取药用成分。9、(2020年7月浙江卷)回答下列（一）、（二）小题：（一）回答与柑橘加工与再利用有关的问题：（1）柑橘果实经挤压获得果汁后，需用果胶酶处理，主要目的是提高果汁的__________。为确定果胶酶的处理效果，对分别加入不同浓度果胶酶的果汁样品，可采用3种方法进行实验：①取各处理样品，添加相同体积的__________，沉淀生成量较少的处理效果好。②对不同处理进行离心，用比色计对上清液进行测定，OD值__________的处理效果好。③对不同处理进行__________，记录相同体积果汁通过的时间，时间较短的处理效果好。（2）加工后的柑橘残渣含有抑菌作用的香精油及较多的果胶等。为筛选生长不被香精油抑制且能高效利用果胶的细菌，从腐烂残渣中分离得到若干菌株，分别用无菌水配制成__________，再均匀涂布在LB固体培养基上。配制适宜浓度的香精油，浸润大小适宜并已__________的圆形滤纸片若干，再贴在上述培养基上。培养一段时间后，测量滤纸片周围抑制菌体生长形成的透明圈的直径大小。从直径__________的菌株中取菌接种到含有适量果胶的液体培养基试管中培养，若有果胶酶产生，摇晃试管并观察，与接种前相比，液体培养基的__________下降。（二）回答与基因工程和植物克隆有关的问题：（1）天然农杆菌的Ti质粒上存在着一段DNA片段（T-DNA），该片段可转移并整合到植物细胞染色体上。为便于转基因植物在组织培养阶段的筛选，设计重组Ti质粒时，应考虑T-DNA中要有可表达的目的基因，还需要有可表达的__________。（2）结合植物克隆技术进行转基因实验，为获得转基因植株，农杆菌侵染的宿主一般要选用具有优良性状、较高的遗传稳定性、__________及易被农杆菌侵染等特点的植物材料。若植物材料对农杆菌不敏感，则可用__________的转基因方法。（3）利用带侧芽的茎段获得丛状苗的过程与利用茎段诱导产生愈伤组织再获得丛状苗的过程相比，前者总培养时间__________，且不经历__________过程，因而其遗传性状稳定，是大多数植物快速繁殖的常用方法。（4）与发芽培养基相比，配制转基因丛状苗生根培养基时，可根据实际情况适当添加__________，促进丛状苗基部细胞分裂形成愈伤组织并进一步分化形成__________，最终形成根。还可通过改变MS培养基促进生根，如_____（A．提高蔗糖浓度B．降低培养基浓度C．提高大量元素浓度D．不添加琼脂）。【答案】①.澄清度②.95%乙醇③.较小④.抽滤⑤.细菌悬液⑥.灭菌⑦.较小⑧.粘性⑨.抗性基因⑩.全能性表达充分⑪.显微注射⑫.短⑬.脱分化⑭.生长素⑮.根的分生组织⑯.B【解析】〖祥解〗发芽培养基：3000mLMS培养基+含1.5mgBA的溶液+含0.02mgNAA的溶液+30g蔗糖+40g琼脂，再加蒸馏水至4000mL，混合均匀加热至琼脂融化后，通过三角漏斗分装至100mL，三角瓶中每瓶40mL，共100瓶三角瓶，加上封口膜后1kg压力下在灭菌锅内灭菌20分钟。生根培养基：1000mLMS培养基+含0.38mgNAA的溶液+30g蔗糖+20g琼脂，再加蒸馏水至2000mL，混合均匀加热至琼脂融化后，通过三角漏斗分装至100mL，三角瓶中每瓶40mL，共50瓶三角瓶，加上封口膜后1kg压力下在灭菌锅内灭菌20分钟。【详析】（一）（1）由于植物细胞壁和植物细胞间果胶的存在时，果汁的澄清度受到一定的影响，因此可以加入果胶酶使果胶降解为可溶性的半乳糖醛酸，提高果汁的澄清度。判断果胶酶的处理效果，可采用三种方法，①看果胶的剩余量，果胶不溶于乙醇，加入95%的乙醇，沉淀量少的即果胶的剩余量少，处理效果好，②进行离心处理，取上清液测OD值，OD值越小，说明降解越充分，果胶酶的处理效果越好，③对不同处理进行抽滤，记录相同体积果汁的通过时间，固形物含量越少，时间越短，处理效果越好。（2）为筛选不被香精油抑制且能高效利用果胶的细菌，需从腐烂残渣中分离菌株，用无菌水配制成细菌悬液，再涂布在LB固体培养基上待筛选。由于目标是筛选不被香精油抑制的细菌，因此还需准备香精油，并将其制作成滤纸片贴在培养基上，香精油需灭菌处理。观察滤纸片周围的抑菌圈，直径越小说明该菌株越不易被香精油抑制，因而成为初步待选的菌株。再进一步接种到含果胶的液体培养基中培养，果胶使植物细胞粘连，若果胶被降解，则液体培养基的粘性下降。（二）（1）设计重组质粒时，除了要含有可表达的目的基因，还需要有可表达的抗性基因（如抗生素抗性基因），在添加抗生素的培养基上，含重组质粒的宿主细胞能够生长，因而被筛选出来。（2）转基因实验要求宿主细胞性状优良、遗传稳定性较高、全能性（细胞发育成个体的潜能）较高及易被农杆菌侵染等特点。若植物材料对农杆菌不敏感，可采用显微注射的方法。（3）利用带侧芽的茎段获得丛状苗的过程，比利用茎段诱导产生愈伤组织获得丛状苗的过程时间更短，因为不需要经历脱分化的过程，而且遗传性状稳定。植物器官的分化需要一定的营养物质及适宜的激素配比，配制丛状苗生根培养基需根据实际情况添加生长素，促进基部细胞形成愈伤组织，并进一步分化形成根的分生组织，最终形成根。比较发芽培养基和生根培养基可知MS培养基的浓度下降，因此可降低培养基的浓度促进生根。故选B。10、(2020年1月浙江卷)回答下列（一）、（二）小题：（一）回答与泡菜制作有关的问题：（1）用萝卜等根菜类蔬菜制作泡菜，用热水短时处理，可抑制某些微生物产生_____，从而使成品泡菜口感较脆。同时，该处理也会使泡菜发酵时间缩短，其原因是_______。（2）泡菜发酵初期，由于泡菜罐加盖并水封，会使______菌被逐渐抑制。发酵中期，乳酸菌大量繁殖，会使______菌受到抑制。发酵后期，乳酸生产过多，会使乳酸菌受到抑制。（3）从泡菜汁中可分离制作酸奶的乳酸菌，首先对经多次发酵的泡菜汁进行过滤，然后取滤液进行______，再用______的方法在某种含牛乳的专用的培养基中进行初步筛选。该培养基必须含有______，以便于观察是否产酸。（4）自然界中醋杆菌常与乳酸菌共同生长。若要筛选出醋杆菌，则其专用的培养基中应添加______。（二）回答与基因工程和植物克隆有关的问题：（1）为了获取某植物叶片无菌的原生质体，先将叶片经表面消毒并去除下表皮，再将其置于经______处理的较高渗透压的混合酶液中。酶解后，经多次离心获得原生质体。然后测定该原生质体的活性，可采用的方法有______（答出2点即可）。（2）若要获得已知序列的抗病基因，可采用______或PCR的方法。为了提高目的基因和质粒重组的成功率，选择使用______，对含目的基因的DNA片段进行处理，使其两端形成不同的黏性末端，对质粒也进行相同的处理，然后用DNA连接酶连接形成重组质粒。通过在大肠杆菌中______，以获得大量的重组质粒，最终将其导入原生质体中。（3）原生质体在培养过程中，只有重新形成______后，才可进行有丝分裂。多次分裂形成的小细胞团可通过______或器官发生的途径再生植株。【答案】①.果胶酶②.细胞破裂，细胞内营养物质外流使乳酸菌快速地获得营养物质③.喜好氧的④.不耐酸的⑤.稀释⑥.涂布分离⑦.酸碱指示剂⑧.乙醇⑨.过滤灭菌⑩.染色法，渗透吸水或失水⑪.化学合成⑫.两种限制性核酸内切酶⑬.扩增⑭.细胞壁⑮.胚胎发生【解析】〖祥解〗泡菜制作：①菌种：假丝酵母和乳酸菌；②发酵原理：在无氧条件下，微生物利用菜中的糖和其他营养物质进行发酵，发酵产物有有机酸和醇类物质等，还有亚硝酸。③亚硝酸盐的测定：亚硝酸盐可与对氨基苯磺酸发生重氮化反应，这一产物再与N-1-萘基乙二胺偶联，形成紫红色产物，可用光电比色法定量。【详析】（一）（1）用萝卜等根菜类蔬菜制作泡菜时，为抑制某些微生物产生果胶酶，从而使成品泡菜口感较脆，可用热水短时处理。同时，该处理也会使细胞破裂，细胞内营养物质外流使乳酸菌快速地获得营养物质，从而使泡菜发酵时间缩短。（2）泡菜发酵初期，由于泡菜罐加盖并水封，形成无氧环境，会使喜好氧的菌被逐渐抑制。发酵中期，乳酸菌大量繁殖，产生乳酸，会使不耐酸的菌受到抑制。发酵后期，乳酸生产过多，又会抑制乳酸菌。（3）从泡菜汁中可分离制作酸奶的乳酸菌，首先对经多次发酵的泡菜汁进行过滤，然后取滤液进行稀释，再用涂布分离的方法在某种含牛乳的专用的培养基中进行初步筛选。为了便于观察是否产酸，该培养基必须含有酸碱指示剂。（4）自然界中醋杆菌常与乳酸菌共同生长。由于醋酸杆菌可以利用乙醇产生醋酸，若要筛选出醋杆菌，则其专用的培养基中应添加乙醇。（二）（1）为了获取某植物叶片无菌的原生质体，先将叶片经表面消毒并去除下表皮，再将其置于经过滤灭菌处理的较高渗透压的混合酶液中。酶解后，经多次离心获得原生质体。可采用染色法、渗透吸水或失水的方法测定该原生质体的活性。（2）可采用人工合成或PCR的方法获得已知序列的抗病基因。对含目的基因的DNA片段进行处理，为使其两端形成不同的黏性末端，需要选择使用两种限制性核酸内切酶，对质粒也进行相同的处理，为了提高目的基因和质粒重组的成功率，然后用DNA连接酶连接形成重组质粒。通过在大肠杆菌中扩增，以获得大量的重组质粒，最终将其导入原生质体中。（3）原生质体在培养过程中，只有重新形成细胞壁后，才可进行有丝分裂。多次分裂形成的小细胞团可通过胚胎发生或器官发生的途径再生植株。非选择题1．（2024·浙江温州·三模）普通小麦是两性植株，体细胞中染色体成对存在。条锈病由条锈菌引起，严重危害小麦生产，Yr5和Yr15基因都是有效的显性抗条锈病基因。回答下列问题：(1)Yr5基因和Yr15基因分别在斯卑尔脱小麦和野生二粒小麦中被发现，两种基因的根本区别是不同。将Yr5基因或Yr15基因导入普通小麦中，实现了物种间的(填变异类型)，提高了小麦的抗逆性。(2)研究者将Yr15基因整合到普通小麦1B染色体的短臂上(如图甲)，获得抗条锈病小麦品系F。提取抗条锈病小麦的作为PCR的模板扩增Yr15基因，用凝胶电泳技术分离、鉴定扩增产物。利用上述方法不能区分纯合和杂合的抗条锈病小麦，因为，两者电泳后DNA条带的数量和位置相同。(3)研究者培育了不抗条锈病小麦品系T，其1B染色体的短臂(1BS)被黑麦1R染色体的短臂(1RS)取代，形成了B．R染色体(如图乙)，B．R染色体形成的原因是发生了染色体结构变异中的。品系T的其他染色体形态、功能与正常小麦相同。为检测小麦细胞中的B．R染色体，研究者根据该染色体中DNA片段的特殊核苷酸序列，设计了荧光标记的探针1RNOR，将该探针导入小麦的体细胞，根据观察到荧光点的数目可判断细胞中B．R染色体数目。注：B．R染色体可与IB染色体联会并正常分离，但IRS与IBS不能发生重组。(4)以纯合的不抗条锈病小麦品系T、条锈菌、探针1RNOR及抗条锈病小麦品系F(含杂合子和纯合子)为材料，可快速获得大量纯合的抗条锈病小麦，方法如下：让纯合小麦品系T与小麦品系F杂交得到F₁代，。(5)研究者将Yr5基因导入小麦品系T中，得到图丙所示植株，将该植株与杂合的小麦品系F杂交，让所有F₁植株进行自交，用探针1RNOR对F₂植株进行检测，若各种基因型的植株结籽率相同，F₂植株中抗条锈病且含荧光点的植株占。【答案】(1)碱基排列顺序基因重组(2)DNA两者都含Yr15基因，PCR扩增产物类型相同(3)易位黑麦1R染色体短臂(4)用条锈菌淘汰F1中不抗（条锈）病植株，让F1自交得F2，用探针1RNOR检测F2植株，细胞中没有荧光点的F2植株即为纯合抗条锈病小麦(5)7/16〖祥解〗不同基因的根本区别在于二者的碱基排列顺序不同。由图乙可知，B.R染色体形成的原因是两条非同源染色体之间发生了易位导致的。抗条锈病且含荧光点的植株即含有Yr5或Yr15基因，又含有B.R染色体。【详析】（1）不同基因的根本区别在于二者的碱基排列顺序不同。将Yr5基因或Yr15基因导入普通小麦中，属于基因重组。（2）利用PCR扩增Yr15基因时，可提取抗条锈病小麦的DNA作为PCR的模板。无论纯合还是杂合，两者都含Yr15基因，PCR扩增产物类型相同，所以利用上述方法不能区分纯合和杂合的抗条锈病小麦。（3）由题意及图可知，B.R染色体形成的原因是两条非同源染色体之间发生了易位导致的。不抗条锈病小麦品系T，其1B染色体的短臂(1BS)被黑麦1R染色体的短臂(1RS)取代，形成了B.R染色体，欲检测小麦细胞中的B.R染色体，设计探针时应根据染色体黑麦1R染色体短臂中DNA片段的特殊核苷酸序列。（4）让纯合小麦品系T与小麦品系F杂交得到F1代，由于F中含有纯合子和杂合子，所以需用条锈菌淘汰F1中不抗（条锈）病植株，让F1自交得F2，用探针1RNOR检测F2植株，细胞中没有荧光点的F2植株即为纯合抗条锈病小麦。（5）抗条锈病且含荧光点的植株即含有Yr5或Yr15基因，又含有B.R染色体，丙植株与杂合的小麦品系F杂交，所得F1有B.R1B2B2B，B.R1B2B2BYr15，B.R1BYr52B2B，B.R1BYr52B2BYr15,上述四种基因型各占1/4，各自自交后，即含有Yr5基因，又含有B.R染色体1/4×3/4×3/4+1/4×1/2+1/4×（1/4×1/2+1/4×1/4+1/4×1）=7/16。2．（2024·浙江金华·模拟预测）纤维素酶能将纤维素降解为单糖或寡糖，且转化过程绿色、低碳，被认为是纤维素资源化利用的可持续方法。在牛、羊等反刍动物的瘤胃中有能分解纤维素的微生物。某科研团队按照下图所示的流程分离瘤胃中的纤维素分解菌，实验中需要甲、乙两种培养基，并在平板上筛选到有透明降解圈的菌落。(1)过程①中甲培养基中除水、无机盐、氮源还应有成分，培养基表面加入一层无菌的石蜡主要目的是。(2)过程②中用适宜浓度NaCl溶液而不用无菌水进行梯度稀释的目的是。(3)科学家发现分离到的微生物产纤维素酶能力弱，进一步研究发现其体内的M基因抑制了其体内纤维素酶基因表达。某科研团队基于CRISPR/Cas9系统拟对某细菌内的M基因进行敲除，以探究该基因对其体内纤维素酶基因表达的调控效果。CRISPR/Cas9系统是其中一种能敲除特定基因的系统，该系统主要包含Cas9蛋白和由tracrRNA和crRNA形成的sgRNA两部分组成，sgRNA能特异性识别并结合特定的DNA序列，从而引导Cas9蛋白到相应位置剪切DNA。①在设计sgRNA序列时，必须事先测定M基因的，从而设计一段能得到sgRNA的DNA．在sgRNA与目的基因特定碱基序列部分结合，结合区最多含有种核苷酸，若要将M基因从目标DNA上剪切下来，需要设计种sgRNA。②将sgRNA基因和Cas9蛋白基因导入目标细菌，科研人员为提高转化效率，常常用处理目标细菌一旦细胞中同时含有sgRNA和Cas9，Cas9就会与sgRNA结合在一起并在sgRNA的带领下，来到能够与sgRNA的目的基因处，特异性地切割M基因。③将CRISPR/Cas9系统基因重组载体成功转染至目标细菌后，与对照组相比，实验组纤维素酶的表达量如图所示，由此得出的实验结论是，判断依据是。【答案】(1)纤维素创设无氧环境，有利于厌氧微生物生长(2)扩大培养(3)两端特定的碱基序列转录82感受态CaCl2碱基互补配对M基因对其体内纤维素酶基因起抑制表达作用敲除细胞株中纤维素酶表达量明显比对照组高〖祥解〗培养基的成分有碳源、氮源、水和无机盐，如果是固体培养基还需要添加琼脂作为凝固剂。【详析】（1）过程①中甲培养基是液体培养基，除水、无机盐、氮源还应有碳源，而本实验是分离能分解纤维素的微生物，所以添加的碳源为纤维素，培养基表面加入一层无菌的石蜡主要目的是创设无氧环境，有利于厌氧微生物生长。（2）过程②中用适宜浓度NaCl溶液而不用无菌水进行梯度稀释的目的是扩大培养。（3）①M基因抑制了其体内纤维素酶基因表达，基于CRISPR/Cas9系统拟对某细菌内的M基因进行敲除，sgRNA能特异性识别并结合特定的DNA序列，从而引导Cas9蛋白到相应位置剪切DNA，在设计sgRNA序列时，必须事先测定M基因的两端特定的碱基序列，从而设计一段能转录得到sgRNA的DNA。在sgRNA与目的基因特定碱基序列部分结合，结合区既有DNA，也有RNA，故最多含有8种核苷酸，若要将M基因从目标DNA上剪切下来，需要有两个切口，而sgRNA的识别具有特异性，故需要2种sgRNA。②将基因导入微生物细胞，常使用CaCl2处理，使其成为感受态，所以将sgRNA基因和Cas9蛋白基因导入感受态目标细菌，一旦细胞中同时含有sgRNA和Cas9，Cas9就会与sgRNA结合在一起并在sgRNA的带领下，来到能够与sgRNA碱基互补配对的目的基因处，特异性地切割M基因。③将CRISPR/Cas9系统基因重组载体成功转染至目标细菌后，与对照组相比，实验组纤维素酶的表达量如图所示，由此得出的实验结论是M基因对其体内纤维素酶基因起抑制表达作用，判断依据是敲除细胞株中纤维素酶表达量明显比对照组高。3．（2024·浙江绍兴·模拟预测）A型塞内卡病毒(SVA)会导致猪患水疱传染病，症状与猪口蹄疫等传染病非常相似，增加了临床鉴别诊断的难度。VP1蛋白是SVA核衣壳的主要成分，可作为SVA诊断的靶蛋白。研究人员尝试制备抗VP1蛋白单克隆抗体，以便快速、准确检测SVA病毒。回答下列问题：(一)基因工程抗原的制备(1)提取病毒RNA，经形成cDNA，根据GenBank上发表的VP1蛋白基因序列，设计一对特异性引物，在引物的(5’或3’)端引入限制酶BamHⅠ和XhoI的识别序列，并进行PCR扩增。考虑一个模板DNA分子的扩增，PCR第四次循环时，需要消耗对引物。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，分析正确后，通常还需进行序列测定，原因是。(2)将回收后的VP1基因片段及pET-28a载体经酶切和连接后转化大肠杆菌DH5a菌株，接种至LB固体培养基。37℃恒温箱培养，挑取至LB液体培养基，置于37℃摇床震荡培养12h，提取重组质粒，经鉴定正确后，转化至大肠杆菌BL21菌株。扩增成功转化的菌株，最后经后收集菌体沉淀，并细菌，纯化得到VP1蛋白。(二)抗VP1蛋白单克隆抗体的制备(3)用纯化的VPl蛋白多次免疫小鼠，然后诱导小鼠的脾细胞和SP2/0细胞融合，推测SP2/0细胞的生长特点是。常用方法有PEG融合法、电融合法和。通过选择培养的方法筛选出杂交瘤细胞，再经过96孔板培养和抗体检测筛选出能够产生特异性抗体的杂交瘤细胞。将筛选到的2个杂交瘤细胞株分别注射到小鼠腹腔中，从腹水中成功提取得到了2种鼠源单克隆抗体—2E10和3E4。(4)为进一步确定2E10和3E4在VP1蛋白上的结合位点，将VP1蛋白截为4段(VP1-1~VP1-4)，电泳后分别用2E10和3E4为探针进行杂交，结果如图所示。根据实验结果，可判断2E10和3E4与VP1的结合位点是(填“相同”或“不同”)的，依据是。【答案】(1)逆转录5’8琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列(2)单菌落离心破碎(3)体外无限增殖灭活病毒诱导法克隆(4)不同2E10仅与VP1-1结合，而3E4仅与VP1-3结合〖祥解〗1、基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。2、动物细胞工程常用的技术有动物细胞培养、动物细胞融合和动物细胞核移植等。动物细胞培养是动物细胞工程的基础；动物细胞融合技术是单克隆抗体制备的重要技术【详析】（1）以RNA为模板合成DNA的过程叫逆转录，产物为DNA。因此，提取病毒RNA，经逆转录形成cDNA。PCR过程中，子链的延伸方向是5’端向3’端，因此，限制酶BamHⅠ和XhoI的识别序列应设计在5’端。PCR第四次循环时以第三次循环的产物为模板，第三次循环结束后得到个DNA分子，每个模板DNA消耗一对引物。因此，PCR第四次循环时，需要消耗8对引物。经扩增得到的DNA分子经电泳后，可以区分不同产物的大小但无法经电泳结果知道碱基序列。因此，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，分析正确后，通常还需进行序列测定。（2）将单个微生物分散在固体培养基上，之后经培养得到的子细胞群体称为单菌落。要分离获得含基因表达载体的菌株，要在固体培养基上挑取单菌落进行培养。VP1基因在大肠杆菌中表达出VP1蛋白，要提取VP1蛋白，先要经离心获得菌体，菌体再经破碎处理后纯化得到VP1蛋白。（3）脾细胞和SP2/0细胞融合后要用于制备单克隆抗体，融合细胞要即能产生抗体，又能在体外无限增殖。脾细胞可以产生抗体，由此推测SP2/0细胞的生长特点是能在体外无限增殖。诱导动物细胞融合的常用方法有PEG融合法、电融合法和灭活病毒诱导法等。经选择培养的杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选，就可获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞，克隆化培养过程通常用96孔板。（4）抗原与抗体发生特异性结合，结合电泳结果图，2E10仅与VP1-1结合，而3E4仅与VP1-3结合，可判断2E10和3E4与VP1的结合位点是不同的。4．（2024·浙江绍兴·模拟预测）绍兴腐乳，又叫“霉豆腐”，具有酒醉醇香、细腻松酥、入口即化等特点，是浙江地区的传统名菜。其制作的流程是：让豆腐表面长出毛霉→加盐腌制→加卤汤装瓶→密封腌制。腐乳味道鲜美的主要原因是微生物产生的蛋白酶和脂肪酶等将豆腐中的蛋白质和脂肪等分解成小分子的肽、氨基酸、脂肪酸等，其中的氨基酸与钠盐作用形成氨基酸钠（其中的谷氨酸钠是味精的主要成分）。研究人员欲从自然发酵的传统“霉豆腐”中筛选出新的毛霉菌株以进一步改良风味。(1)腐乳发酵过程中所用的毛霉菌株是一种菌。腌制完成后需要加卤汤装瓶，卤汤中酒精的含量一般控制在12%左右，从发酵角度分析主要原因是酒精含量过高，导致；过低，导致杂菌生长，引起变质。(2)酪素培养基的原理是在培养基中添加酪素，如果菌株能产生蛋白酶并分泌到胞外，则能将酪素降解形成透明圈，从培养基的用途上分，该培养基属于（填“选择”或“鉴别”）培养基。Hc值是透明圈直径与菌落直径的比值，据Hc值初步筛选出三种具有高蛋白酶活力的菌株编号为M2、M3、M4，原人工接种发酵工艺所用的毛霉菌株编号为M1。将各组毛霉孢子以1：1的比例两两混合，接种于豆腐小块表面，分别以接种为对照，培养后测定各组蛋白酶活力和脂肪酶活力如图1所示（柱状图上的误差线“I”代表数据的波动范围）。根据下图1数据，最优的毛霉菌株组合是。(3)根据以上研究，研究者想通过以下细胞工程的方案获得M2M3杂种菌株，以期获得优质毛霉菌株。处理③过程可选择、离心等物理方法，也可选择合适的化学方法；在此处理前需要先对原生质体2和3进行。在获得杂种毛霉后，往往还需要经过和鉴定。结果发现，利用细胞工程得到的杂种毛霉并没有达到预期的效果，其原因可能之一是。(4)另一研究小组想通过改造M4菌株形成新的单菌株毛霉发酵工艺，图3为M4菌株改造的基本思路。图3的流程是利用工程对毛霉进行改造，A是指活力更高的（蛋白质）。若图4为目的基因的部分序列：现需要在目的基因上游添加EcoRⅠ识别序列（5'-G↓AATTC-3'），下游添加BamHⅠ识别序列（5’-G↓GATCC-3'）以便与载体正确链接，利用PCR扩增目的基因应选择的一对引物是。上游引物下游引物A5'-…GAATTCATGACAGTTAGT…-3'5'-…GGATCCTCACCGGCAGTA…-3'B5'-…GGATCCATGACAGTTAGT…-3'5'-…GAATTCTCACCGGCAGTA…-3'C5'-…GAATTCTACTGTCAATCA…-3'5'-…GGATCCAGTGGCCGTCAT…-3'D5'-…GAATTCAGTGGCCGTCAT…-3'5'-…GGATCCTACTGTCAATCA…-3'【答案】(1)真毛霉菌死亡，腐乳发酵时间延长或失败(2)鉴别单一毛霉孢子/单独接种M1、M2、M3和M4毛霉孢子的豆腐M2M3(3)电融合活力鉴定分离纯化染色体丢失或基因选择性表达(4)蛋白质/第二代基因蛋白酶或脂肪酶A〖祥解〗1、制作腐乳的主要微生物是毛霉，毛霉是异养需氧型真菌，孢子生殖。毛霉能产生脂肪酶和蛋白酶，脂肪在脂肪酶的作用下被分解生成脂肪酸和甘油，蛋白质在蛋白酶的作用下分解生成小分子肽和氨基酸。2、蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。它是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程，是涉及多学科的综合科技工程。【详析】（1）毛霉是异养需氧型真菌。酒精对细胞生长有抑制作用，所以卤汤中的酒精含量不能过高，否则会到导致毛霉菌死亡，腐乳发酵时间延长或导致腐乳制作失败。（2）微生物产生蛋白酶并分泌到胞外后，能将酪素培养基中的酪素降解后形成透明圈，所以在酪素培养基上生长，且菌落周围有透明圈的微生物，就是能产生蛋白酶并分泌到胞外的微生物，酪素培养基是鉴别培养基。根据图1，接种的菌种有单一毛霉孢子M1、M2、M3、M4，也有各组毛霉孢子以1：1的比例两两混合的菌种，本实验以各组毛霉孢子以1：1的比例两两混合、接种于豆腐小块表面的为实验组，接种单一毛霉孢子M1、M2、M3和M4的豆腐小块为对照组，培养后测定各组蛋白酶活力和脂肪酶活力。根据下图1数据，M2M3组蛋白酶和脂肪酶的活力均较高，是本实验中最优的毛霉菌株组合。（3）处理③过程为诱导原生质体融合，常用的物理方法有：电融合法、离心法；也可选择合适的化学方法如PEG诱导法。在诱导原生质体融合前，需要对原生质体进行活力鉴定。由于原生质体融合是随机的且达不到100%，所以在获得杂种毛霉后