血液学检验技术 课件 4.项目四：细胞化学染色

单元一：造血细胞检验项目四：细胞化学染色任务一细胞化学染色基本理论目录项目四：细胞化学染色任务二常用细胞化学染色检验项目四：细胞化学染色1.掌握：细胞化学染色的基本步骤；过氧化物酶染色、过碘酸-雪夫染色、酯酶染色、酸性磷酸酶染色、中性粒细胞碱性磷酸酶染色、铁染色的检测方法、结果分析和临床意义。2.熟悉：细胞化学染色的概念；各种常用细胞化学染色的原理及注意事项。3.了解：细胞的生理状态、功能和细胞化学染色的影响因素。4.具备细胞化学染色标本采集和处理能力，具有过氧化物酶染色、过碘酸-雪夫染色、酯酶染色、酸性磷酸酶染色、中性粒细胞碱性磷酸酶染色、铁染色的检测能力。5.学会依据细胞学异常和临床要求有选择性进行细胞化学染色，并能根据染色结果辅助分析判断白血病类型。学习目标项目四：细胞化学染色任务一细胞化学染色基本理论细胞化学染色是细胞学和化学相结合而形成的一门科学，是以细胞形态学为基础，结合运用化学反应的原理对血细胞内的各种化学成分(如酶类、酯类、铁、蛋白质、核酸等)作定性、定位、半定量分析的方法。细胞化学染色主要用于：1.辅助判断急性白血病的细胞类型。2.辅助血液系统疾病的诊断和鉴别诊断，如铁染色。3.观察疾病的疗效和预后。4.发病机制的探讨。一、细胞化学染色定义与临床应用任务一细胞化学染色基本理论固定显示复染固定物理法干燥固定火焰固定化学法蒸汽固定液体固定显示联苯胺法偶氮偶联法雪夫反应普鲁士蓝反应金属沉淀法复染目的是使各种细胞能显示出来以便于观察。选择复染液的颜色应与有色沉淀的颜色有明显的对比度，即能使细胞结构显示又能清楚地看出细胞化学染色结果。细胞化学染色步骤：二、细胞化学染色步骤任务一细胞化学染色基本理论粗略估量以染色反应的强弱，受色的深浅，人为地区别为阴性和各种程度的阳性。百分法只能反映细胞阳性率，不能反映受色强弱。积分法是常用的半定量法，将前述的等级估量与百分率相结合（计算方法见碱性磷酸酶染色），它既反映了细胞阳性率的高低，又反映了细胞受色的强弱。流式细胞仪最精确的定量方法，测定单个细胞内的化学成分含量。以细胞受色反应的强弱比色，常用于RNA、DNA定量测定和各阶段幼红细胞胞浆中血红蛋自定位、定量等。三、细胞化学染色定量分析方法任务一细胞化学染色基本理论任务二常用细胞化学染色检验项目四：细胞化学染色原理（二氨基联苯胺法）：

操作：胞质中POX底物H2O2分解释放新生态氧（O）二氨基联苯胺氧化金黄色不溶性沉淀，定位于细胞质内酶所在的活性部位产生固定30秒4℃底物液孵育流水冲洗苏木素或Giemsa液10～15min复染30分钟镜检：观察100个白血病细胞的染色结果，得出阳性率和阳性指数，或报告各种阳性细胞的百分比。新鲜涂片

甲醛-丙酮缓冲液

流水冲洗任务二常用细胞化学染色检验一、过氧化物酶染色（POX或MPO染色）结果判断：细胞质中出现棕黄色颗粒为阳性反应实验结果细胞染色─胞质中无阳性颗粒±胞质中细小阳性颗粒+胞质中阳性颗粒较粗大++阳性颗粒粗大密集，约占胞质1/2～2/3+++阳性颗粒粗大几乎布满胞质++++阳性颗粒呈团块状，充满胞质，可覆盖核上（++）（++）（+）（-）（+++）（+++）（++++）（-）（-）（-）（-）（±）一、过氧化物酶染色（POX或MPO染色）任务二常用细胞化学染色检验正常细胞POX染色反应细胞系统细胞染色反应粒细胞系统分化差的原始粒细胞为阴性，分化好的原始粒细胞至中性成熟粒细胞均呈阳性，且随着细胞的成熟，阳性反应的程度逐渐增强。中性分叶核粒细胞呈强阳性反应，但衰老的粒细胞阳性程度减弱甚至呈阴性；嗜酸性粒细胞阳性最强，嗜碱性粒细胞阴性单核细胞系统原始单核细胞呈阴性，幼稚及成熟单核细胞多呈弱阳性，阳性颗粒少而细小，分布不均。淋巴细胞系统淋巴细胞系统呈阴性反应其他细胞成熟型网状细胞及巨噬细胞可呈不同程度的阳性反应，浆细胞、红细胞、巨核细胞系统等均为阴性反应一、过氧化物酶染色（POX或MPO染色）任务二常用细胞化学染色检验临床意义：主要用于鉴别急性白血病类型1.急性髓细胞白血病多呈阳性反应，以M3和M2型反应最强，M1和M5型反应较弱，故有助于区别M3和M5型。2.急性淋巴细胞白血病呈POX阴性反应，或阳性原始细胞＜3%（可能是残留的原粒或早幼粒细胞），故为急性髓细胞和淋巴细胞白血病鉴别的重要指标。ALL（POX染色）M5（POX染色）M3（POX染色）M2（POX染色）一、过氧化物酶染色（POX或MPO染色）任务二常用细胞化学染色检验原理：苏丹黑是一种脂溶性重氮染料，能溶解于细胞内的含脂结构（如中性脂肪、磷脂、糖脂和类固醇）中，使脂类物质呈棕黑色或深黑色而显示出来。脂类物质在粒细胞中含量丰富，在单核细胞中也有少量。结果判断及正常细胞染色反应：与POX染色基本一致临床意义：与POX染色基本相似注：POX染色特异性高，而SBB染色的敏感性高，因SBB染色较繁琐，临床上POX染色更常用，但POX染色阴性者可加做SBB染色或直接采用细胞免疫分型确认。

二、苏丹黑B染色（SBB染色）任务二常用细胞化学染色检验酯酶是分解各种酯类的水解酶，根据机制的不同，分为非特异性酯酶和特异性酯酶。特异性酯酶易水解具有长链的酯类。非特异性酯酶易水解具有短链的酯类。单核巨噬细胞类为非特异性酯酶，中性粒细胞类则为特异性酯酶。区分单核细胞类或中性粒细胞类的重要方法，特别是二重染色法尤为重要。酯酶特异性酯酶(氯乙酸AS-D萘酚酯酶)非特异性酯酶pH值不同酸性酯酶(酸性α-醋酸萘酚酯酶)碱性酯酶(α-丁酸萘酚酯酶)中性酯酶α-醋酸萘酚酯酶醋酸AS-D萘酚酯酶三、酯酶染色任务二常用细胞化学染色检验（一）特异性酯酶染色—氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色（NAS-DCE）氯乙酸AS-D萘酚酯酶（NAS-DCE）几乎只出现在粒细胞中，特异性高，故称“粒细胞酯酶”、“特异性酯酶”。原理：氯乙酸AS-D萘酚被细胞内特异性酯酶水解，产生AS-D萘酚，再与稳定的重氮盐（坚牢紫酱GBC)偶联，生成不溶性红色沉淀，定位于胞浆中。含萘酚的底物（氯乙酸AS-D萘酚）细胞内相应的酶萘酚AS-D重氮盐（坚牢紫酱GBC）生成不溶性红色沉淀定位于胞质相应位置三、酯酶染色任务二常用细胞化学染色检验（一）特异性酯酶染色—氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色（NAS-DCE）操作：结果判断：胞质内出现红色弥漫性或颗粒状沉淀为阳性固定30-60秒基质液37℃孵育流水冲洗苏木素染液30min复染5min镜检：至少要观察100个白血病细胞的染色结果，计算阳性率和阳性指数新鲜涂片

甲醛-丙酮液

流水冲洗实验结果细胞染色─为胞质中无阳性颗粒±为胞质中细小阳性颗粒+胞质显现均匀浅色阳性反应，占胞质﹤1/4++胞质显现均匀红色阳性反应，占胞质﹤1/2+++胞质充满红色阳性反应++++胞质充满致密红色阳性产物呈团块状三、酯酶染色任务二常用细胞化学染色检验细胞系统细胞染色反应粒细胞系统分化差的原始粒细胞呈阴性，分化好的呈阳性，自早幼粒细胞至成熟中性粒细胞均呈阳性，但酶活性并不随细胞的成熟而增强。嗜酸性粒细胞呈阴性或弱阳性，嗜碱性粒细胞呈阳性单核细胞系统绝大多数为阴性其他细胞淋巴细胞、浆细胞、巨核细胞、有核红细胞、血小板等均呈阴性，但肥大细胞呈阳性。（一）特异性酯酶染色—氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色（NAS-DCE）正常细胞NAS-DCE染色反应：任务二常用细胞化学染色检验三、酯酶染色（一）特异性酯酶染色—氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色（NAS-DCE）临床意义：主要用于鉴别急性白血病类型（1）急性粒细胞白血病时，原粒细胞和幼稚粒细胞均呈一定程度阳性。（2）急性单核细胞白血病、急性淋巴细胞白血病，均呈阴性。（3）急性粒-单核细胞白血病时部分细胞阳性，部分细胞呈阴性。AML--M2a氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色1.原始粒细胞，呈弱阳性；2.幼稚粒细胞，呈强阳性；3.中性杆状核粒细胞，呈强阳性

AML—M1氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色任务二常用细胞化学染色检验三、酯酶染色（二）非特异性酯酶染色—α-醋酸萘酚酯酶染色（α-NAE）α-NAE存在于单核细胞、粒细胞和淋巴细胞中，是一种中性非特异性的酯酶，只有单核系细胞的阳性可被氟化钠抑制，故α-NAE染色+氟化钠抑制试验，对鉴别单核细胞白血病有重要价值。原理：含萘酚的底物（α-醋酸萘酚）重氮盐（坚牢蓝B）作用液+氟化钠单核细胞被抑制其他系不被抑制α-萘酚醋酸细胞内α-NAE生成不溶性棕黑色或灰黑色沉淀定位于胞质相应位置任务二常用细胞化学染色检验三、酯酶染色（二）非特异性酯酶染色—α-醋酸萘酚酯酶染色（α-NAE）操作：固定5分钟1张基质液37℃孵育流水冲洗甲基绿染液1小时复染5-15min镜检：两种方法染色后用油镜计数100或200个被检细胞，分别计算出抑制前和抑制后的阳性率和积分。按下列公式计算出抑制率：凡抑制率＞50％者，提示受氟化钠抑制。新鲜涂片2张

固定液流水冲洗1张基质液+氟化钠任务二常用细胞化学染色检验三、酯酶染色（二）非特异性酯酶染色—α-醋酸萘酚酯酶染色（α-NAE）结果判断：胞质内有灰黑色或棕黑色弥漫状或颗粒状沉淀为阳性实验结果细胞染色0分（─）胞质中无色素沉淀1分（+）胞质呈弥漫浅灰色或含少量阳性反应颗粒2分（++）胞质呈弥漫灰黑着色或含中等量阳性反应颗粒3分（+++）胞质呈弥漫棕黑较深色或含较多阳性反应颗粒或胞质呈弥漫棕黑较深色4分（++++）胞质呈弥漫深黑色或胞质中充满粗大阳性反应颗粒1.原始单核细胞（+）2.幼单核细胞（++）3.单核细胞（+++）4.巨核细胞（++）5.血小板（+++）6.杆状核粒细胞（─）7.分叶核粒细胞（─）8.淋巴细胞（─）任务二常用细胞化学染色检验三、酯酶染色（二）非特异性酯酶染色—α-醋酸萘酚酯酶染色（α-NAE）正常细胞NAS-DCE染色反应：细胞系统细胞染色反应单核细胞系统分化差的原始单核细胞呈阴性，分化好的原始单核细胞呈阳性（常较强），幼稚单核及单核细胞也呈阳性，阳性反应能被氟化钠抑制粒细胞系统各期粒细胞多数呈阴性，少数呈弱阳性，阳性反应不被氟化钠抑制淋巴细胞系统各期淋巴细胞多呈阴性，少数呈弱阳性，阳性反应不被氟化钠抑制其他细胞巨核细胞和血小板呈阳性，少数有核红细胞呈弱阳性，阳性反应不被氟化钠抑制；浆细胞呈阴性任务二常用细胞化学染色检验三、酯酶染色（1）急性单核细胞白血病时，α-NAE染色呈明显阳性反应，且其阳性反应被氟化钠抑制。（2）急性粒-单核细胞白血病时；α-NAE染色呈部分阳性，并被氟化钠抑制。（3）急性粒细胞白血病、急性淋巴细胞白血病时，α-NAE染色呈阴性或（弱）阳性，且其阳性反应不被氟化钠抑制。M5型--α-NAE染色原、幼单核细胞多呈强阳性M5型--α-NAE+氟化钠抑制试验原、幼单核细胞阳性反应被氟化钠抑制M4型--α-NAE染色部分细胞呈强阳性M4型--α-NAE+氟化钠抑制试验部分阳性反应细胞被氟化钠抑制任务二常用细胞化学染色检验三、酯酶染色（二）非特异性酯酶染色—α-醋酸萘酚酯酶染色（α-NAE）临床意义：主要用于辅助鉴别急性白血病细胞的类型（三）非特异性酯酶染色—α-丁酸萘酚酯酶染色（α-NBE）α-NBE在单核-吞噬细胞系统中活性最强，能被氟化钠抑制，而粒系、淋巴系、部分幼红细胞、巨核细胞和血小板等含量很少，被视为单核-吞噬细胞系统所特有的标志酶。原理：含萘酚的底物（α-丁酸萘酚）重氮盐（坚牢紫酱GBC）作用液+氟化钠单核细胞被抑制其他系不被抑制α-萘酚丁酸细胞内α-NBE生成不溶性红色沉淀定位于胞质相应位置任务二常用细胞化学染色检验三、酯酶染色（三）非特异性酯酶染色—α-丁酸萘酚酯酶染色（α-NBE）操作与结果判断：基本同α-NAE一致正常细胞α-NBE染色反应：临床意义：临床应用同α-NAE细胞系统细胞染色反应粒细胞系统各阶段粒细胞均呈阴性单核细胞系统分化差的原始单核细胞呈阴性，分化好的原始单核细胞呈阳性，幼稚单核及单核细胞呈阳性，阳性反应能被氟化钠抑制淋巴细胞系统T淋巴细胞、非T非B淋巴细胞可呈阳性，B淋巴细胞呈阴性其他细胞巨核细胞、有核红细胞、浆细胞呈阴性或弱阳性；组织细胞也可呈阳性，但不被氟化钠抑制注：1.α-NBE敏感性比α-NAE低，但特异性强用于鉴别急非淋的白血病类型

2.将POX染色与α-NBE染色+氟化钠抑制联合使用，对AML-M2、M4、M5分型更有价值任务二常用细胞化学染色检验三、酯酶染色任务二常用细胞化学染色检验三、酯酶染色（四）酯酶双染在同一张涂片上进行两种酯酶染色的方法称为酯酶双染色。正常细胞α-NBE染色反应：酯酶双染色可鉴别粒系细胞和单核系细胞，尤其对于急性粒-单核细胞白血病的诊断具有重要价值。多数采用一种特异性酯酶加一种非特异性酯酶染色，常用的有α-醋酸萘酚酯酶与氯乙酸AS－D萘酚酯酶双染色、α-丁酸萘酚酯酶与氯乙酸AS－D萘酚酯酶双染色等。临床应用：主要用于鉴别急性粒细胞白血病、急性粒-单核细胞白血病、急性单核细胞白血病酸性磷酸酶（ACP）存在于细胞的溶酶体颗粒中，某些细胞中的酸性磷酸酶耐酒石酸，故抗酒石酸酸性磷酸酶染色有助于某些疾病的诊断及鉴别诊断。原理：血细胞内的酸性磷酸酶在酸性（pH5.0）条件下水解基质液中的磷酸萘酚AS-BI，释放出萘酚AS-BI，后者与基质液中的重氮盐偶联形成不溶性的有色沉淀，定位于细胞质内酶所在的部位。pH5.0含萘酚的底物（磷酸萘酚AS-BI）重氮品红萘酚AS-BI细胞内ACP生成不溶性出现鲜红色颗粒沉淀定位于胞质相应位置任务二常用细胞化学染色检验四、酸性磷酸酶染色（ACP）（偶氮偶联法）试剂：操作：1．甲醇-丙酮缓冲液2．基质储备液

：磷酸萘酚AS-BI100mg，N-N二甲基甲酰胺10ml3．0.1mol/L乙酸缓冲液

4．0.05mol/L乙酸-酒石酸缓冲液5．作用液Ⅰ（临用时配制）：0.1mol/L乙酸缓冲液50ml，基质储备液1.0ml，重氮品红25mg。6．作用液Ⅱ（临用时配制）：0.05mol/L乙酸-酒石酸缓冲液50ml，基质储备液1.0ml，重氮品红25mg。固定30秒1张作用液Ⅰ37℃避光浸染蒸馏水洗甲基绿染液30分钟复染3-5min镜检新鲜涂片2张

固定液蒸馏水洗1张作用液Ⅱ稍干燥任务二常用细胞化学染色检验四、酸性磷酸酶染色（ACP）（偶氮偶联法）结果判断：胞质中出现鲜红色颗粒沉淀为阳性正常血细胞的染色反应：粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、巨核细胞、血小板、浆细胞、巨噬细胞均呈阳性反应。实验结果细胞染色─胞质无色+胞质出现淡红色颗粒++胞质布满鲜红色颗粒+++胞质充满深红色颗粒1（+）2（++）3（+++）任务二常用细胞化学染色检验四、酸性磷酸酶染色（ACP）（偶氮偶联法）临床意义：临床ACP染色应用较少，主要用于多毛细胞白血病的诊断及脂质代谢障碍性疾病的鉴别。1.诊断多毛细胞白血病：多毛细胞呈阳性（常呈强阳性），阳性反应不被L-酒石酸抑制。慢性淋巴细胞白血病的淋巴细胞和恶性淋巴瘤细胞ACP染色也可呈阳性，但可被L-酒石酸抑制。2.鉴别戈谢细胞和尼曼-匹克细胞：前者阳性，并具有抗酒石酸功能；后者阴性。多毛细胞白血病ACP染色阳性反应，阳性不被酒石酸抑制ALL-ACP染色阳性反应阳性被酒石酸抑制戈谢细胞（1）-ACP染色阳性反应阳性不被酒石酸抑制任务二常用细胞化学染色检验四、酸性磷酸酶染色（ACP）（偶氮偶联法）原理：过碘酸是氧化剂，能使含有乙二醇基（CHOH-CHOH）的多糖类物质（糖原、粘多糖、粘蛋白、糖蛋白及糖酯等）氧化，形成双醛基（CHO-CHO），醛基与雪夫试剂中的无色品红结合，使无色的品红变成紫红色化合物，定位于含有多糖类的细胞内。试剂：1.固定剂：95%乙醇2.10g/L过碘酸溶液3.雪夫染液4.偏重亚硫酸液(新鲜配制)5.复染液：20g/L甲基绿水溶液氧化结合含乙二醇基的糖类（CHOH-CHOH）无色品红双醛基（CHO-CHO）过碘酸变成紫红色品红定位于胞质中任务二常用细胞化学染色检验五、糖原染色（PAS）（过碘酸-雪夫反应）操作：结果判断：胞质内有红色或紫红色，呈弥散状、颗粒状或块状的物质为阳性固定氧化蒸馏水洗雪夫染液10分钟10分钟镜检：油镜下各类细胞观察100个，按评分标准计算阳性率及积分新鲜涂片95%乙醇流水冲洗10g/L过碘酸10分钟30-60分钟蒸馏水洗偏重亚硫酸溶液洗3次甲基绿复染

各种血细胞PAS染色1.原始粒细胞（-）2.早幼粒细胞（+）3.中性中幼粒细胞（++）4.中性晚幼粒细胞（+++）5.中性杆状核粒细胞（++++）6.中性分叶核粒细胞（++++）7.嗜酸性粒细胞（+++）8.嗜碱性粒细胞（+++）9.单核细胞（±）10.淋巴细胞（-）11.淋巴细胞（+）12.淋巴细胞（++）13.淋巴细胞（+++）任务二常用细胞化学染色检验五、糖原染色（PAS）（过碘酸-雪夫反应）正常细胞PAS染色反应：细胞系统细胞染色反应粒细胞系统分化差的原始粒细胞呈阴性，分化好的原始粒细胞至中性分叶核粒细胞均呈阳性，并随着细胞的成熟逐渐增强；嗜酸性粒细胞中颗粒之间的胞质呈红色；嗜碱性粒细胞中的嗜碱性颗粒呈阳性，而颗粒之间的胞质不着色。红细胞系统有核红细胞及红细胞均呈阴性单核细胞系统分化差的原始单核细胞呈阴性，其他为阳性，绝大多数阳性反应物呈粗颗粒状，有时分布于细胞边缘的阳性反应物颗粒较粗大淋巴细胞系统大多数呈阴性，少数呈阳性（阳性率常＜20%），阳性反应物呈粗颗粒状或块状巨核细胞系统巨核细胞和血小板呈阳性，阳性反应的程度随细胞的发育成熟而增强，成熟巨核细胞多呈强阳性，阳性反应物呈颗粒状或块状其他细胞浆细胞一般呈阴性，少数呈阳性，巨噬细胞可为阳性，两者阳性反应物均呈细颗粒状任务二常用细胞化学染色检验五、糖原染色（PAS）（过碘酸-雪夫反应）临床意义：（1）红系统疾病的鉴别M6、MDS幼红细胞PAS可呈阳性，积分明显增高，巨贫、再障、溶贫时PAS反应为阴性。（2）急性白血病的类型鉴别急淋：PAS呈大块状阳性，也可是阴性；急粒：原始、幼稚细胞常为阴性；急单：原单核细胞及幼单核细胞PAS可呈阳性，积分增高，阳性颗粒小而多，呈弥散分布。AML-M6幼红细胞PAS呈阳性MA幼红细胞PAS呈阴性任务二常用细胞化学染色检验五、糖原染色（PAS）（过碘酸-雪夫反应）ALL-L1ALL-L1（PAS+）AML-M5AML-M（PAS+）AML-M6AML-M6（PAS+）AML-M7AML-M（PAS+）任务二常用细胞化学染色检验五、糖原染色（PAS）（过碘酸-雪夫反应）临床意义：NAP主要存在于中性成熟粒细胞胞质中，故中性成熟粒细胞呈阳性反应，而其他细胞基本呈阴性。原理：（偶氮偶联法）试剂含萘酚的底物（α-磷酸萘酚钠）细胞内NAP重氮盐（坚牢蓝RR）pH9.6磷酸钠α-萘酚生成不溶性黑色沉淀定位于胞质相应位置1．固定剂：10％甲醛甲醇

2．0.2mol/L丙二醇缓冲液贮备3．0.05mol/L丙二醇缓冲液应用液(pH9.75)4．基质孵育液(pH9.5～9.6)：α-磷酸萘酚钠20mg溶于0.05mol/L丙二醇缓冲液20ml，再加坚牢紫

酱GBC盐(或坚牢蓝RR)20mg混合后用滤纸过滤，用前临时配制。任务二常用细胞化学染色检验六、中性粒细胞碱性磷酸酶染色（NAP）操作：结果判断：胞质出现紫黑色或棕红色颗粒为阳性固定室温流水冲洗10-15分钟5-8分钟镜检：油镜下各类细胞观察100个，按评分标准计算阳性率及积分新鲜涂片甲醛甲醇流水冲洗基质孵育液30秒苏木素染液复染

流水冲洗实验结果细胞染色0分（-）胞质中无阳性反应颗粒1分（+）胞质中含少量阳性反应颗粒或胞质呈弥漫浅灰色2分（++）胞质中含中等量阳性反应颗粒或胞质呈弥漫灰黑色3分（+++）胞质中含较多阳性反应颗粒或胞质呈弥漫棕黑色4分（++++）胞质中充满粗大阳性反应颗粒甚至可遮盖细胞核或胞质呈弥漫深黑色（─）（─）（+）（+）（++）（++）（++）（+++）（+++）（++++）（++++）任务二常用细胞化学染色检验六、中性粒细胞碱性磷酸酶染色（NAP）NAP积分计算：计数100个成熟中性粒细胞，按其反应强度分级，各级百分率与其级数乘积的总和参考值：阳性率＜40％；NAP积分值为30～130分正常人血细胞碱性磷酸酶除成熟中性粒细胞（杆状核及分叶核）可见阳性外，其他血细胞均为阴性。积分记录

—0分+1分++2分+++3分++++4分例如：NAP反应结果（%）积分：（0）（1）（2）（3）（4）细胞数：55102060NAP总积分=（0×5）+（1×5）+（2×10）+（3×20）+（4×60）=325任务二常用细胞化学染色检验六、中性粒细胞碱性磷酸酶染色（NAP）临床意义：（1）生理变化：新生儿NAP增高，成人较儿童减低，老人更低；激烈运动增高；月经期经前增高，行经后降低，经后期恢复正常；妊娠期2-3月轻度增高，以后逐渐增高，分娩时达到高峰，产后恢复正常。（2）病理变化增高：严重化脓性感染、类白血病反应、AA、CML加速期、ALL、CLL、恶性淋巴瘤、癌

转移、MM、真红、骨髓纤维化等。减低：PNH、CML、恶性组织细胞病、MDS。（3）疾病鉴别诊断慢粒与类白的鉴别：CML减低，类白增高。急性白血病的鉴别：AML减低，ALL增高。PNH与AA（再障）鉴别：PNH减低，AA增高。病原微生物的鉴别：病毒感染减低，细菌感染增高。任务二常用细胞化学染色检验六、中性粒细胞碱性磷酸酶染色（NAP）临床意义：粒细胞型类白反应NAP染色（++++）CMLNAP染色（-）化脓性感染NAP染色（++++）任务二常用细胞化学染色检验六、中性粒细胞碱性磷酸酶染色（NAP）骨髓中的贮存铁以铁蛋白和含铁血黄素的形式贮存，主要存在于骨髓小粒（细胞外铁）和幼红细胞（细胞内铁）中。原理：正常人骨髓中的贮存铁主要存在于骨髓小粒和幼红细胞中，骨髓中的铁在酸性环境下与亚铁氰化钾作用，形成普鲁士蓝反应，形成蓝色的亚铁氰化铁沉淀，定位于含铁的部位，从而反映骨髓中铁的储存量。4Fe3+＋3K4［Fe（CN）6］Fe4〔Fe（CN）6〕3＋12K+（含铁物质）

（亚铁氰化钾）

（亚铁氰化铁）酸性任务二常用细胞化学染色检验七、铁染色（偶氮偶联法）试剂：操作：1．固定液：95％乙醇2．酸性亚铁氰化钾溶液（临用前配制）：5ml200g/L亚铁氰化钾溶液置于试管中，缓缓滴加1ml浓盐酸，边滴边摇匀，至溶液刚出现均匀白色浑浊，再滴加1滴200g/L亚铁氰化钾，使白色沉淀消失澄清，过滤使用。3．2g/L核固红-硫酸铝溶液骨小粒丰富骨髓片酸性亚铁氰化钾溶液95%乙醇蒸馏水冲洗10分钟染30min37℃核固红液3-5min复染流水冲洗镜检任务二常用细胞化学染色检验七、铁染色（偶氮偶联法）结果判断：细胞外铁呈蓝色的颗粒状、小株状或团块状。以油镜观察定级标准实验结果染色情况-全片无细胞外蓝色颗粒+有少量铁颗粒，或偶见少量铁小珠，珠粒似嗜酸性颗粒大小++有较多的铁颗粒和铁小珠+++有很多的铁颗粒、小珠和少数蓝黑色小块++++有极多的铁颗粒和小珠，并有很多密集成堆的小块细胞外铁（-）细胞外铁（+）细胞外铁（++）细胞外铁（+++）细胞外铁（++++）任务二常用细胞化学染色检验七、铁染色（偶氮偶联法）结果判断：细胞内铁指有核红细胞胞质内出现蓝色颗粒。以油镜观察定级标准实验结果细胞染色I型幼红细胞内含铁颗粒1～2个Ⅱ型幼红细胞内含铁颗粒3～5个Ⅲ型幼红细胞内含铁颗粒6～10个，或1～4个大铁颗粒Ⅳ型幼红细胞内含铁颗粒10个以上，或5个以上大铁颗粒铁染色（细胞内铁）1.正常铁粒幼红细胞（铁颗粒1-5个）2.环形铁粒幼红细胞（铁颗粒10个以上，环细胞核2/3圈以上）铁染色（细胞内铁）1.环形铁粒幼红细胞；2.铁粒幼红细胞任务二常用细胞化学染色检验七、铁染色（偶氮偶联法）环形铁粒幼红细胞：指含铁颗粒>6个，其中2/3以上铁颗粒围绕核周排列成完整环形或不完整环形参考值：细胞外铁：+～++，“+”占2/3，“++”占1/3细胞内铁：30%~90%，平均60%，多见Ⅰ型，少见Ⅱ型，无Ⅲ、Ⅳ型。环形铁粒幼红细胞：正常或非铁粒幼细贫血无环形铁粒幼细胞，铁粒幼红细胞贫血中环形铁粒幼细胞>6%

。环形铁粒幼红细胞任务二常用细胞化学染色检验七、铁染色（偶氮偶联法）临床意义：主要用于缺铁性贫血和环形铁粒幼红细胞增多性贫血的诊断和鉴别诊断。1.缺铁贫：外铁明显下降，甚至消失；内铁下降。经铁剂治疗后，外铁增加。2.AA：内、外铁明显增加3.铁粒幼细胞性贫血：内、外铁增加，且出现环状铁粒幼细胞占幼红细胞的15%以上，有时还可见铁粒RBC。4.MDS：外铁增加，铁粒幼细胞百分比增加，出现环铁粒幼细胞5.非缺铁性贫血：溶血性贫血、巨幼细胞贫血、再生障碍性贫血、多次输血后和白血病等，细胞外铁和内铁正常或增加。6.感染、肝硬化、慢性肾炎、尿毒症、血色病等，细胞外铁明显增加，而铁粒幼红细胞可减少任务二常用细胞化学染色检验七、铁染色（偶氮偶联法）血细胞化学染色在鉴别各类急性白血病中的应用类型POX*（SBB）特异性酯酶NAS-DCE

非特异性酯酶**α-NBENaFPASACPM1+(-)/+++(-)/++-/+-/++±/+M2+/+++/++++++/++M3++++++/+++/+++/+++/++M4+(-)/+++++/++-/+++/+++/++M5-/+-/+++/+++-/+-/+-/++M6±/++±/+-/+-/+±/+++/++M7-±/+++/+++/++±/+++±/+++ALL--/+-/+-/++(-)/++++(-)/+++注：POX-过氧化酶；SBB-苏丹黑；PAS-过碘酸-雪夫反应；ACP-酸性磷酸酶。*POX：ANLL（+）＞3%；ALL（+）＜3%。**非特异性酯酶染色常用底物有α-NAE（α-醋酸萘酚酯酶），α-NBE（α-丁酸萘酚酯酶）任务二常用细胞化学染色检验八、细胞化学染色综合分析POX≥3%AML＜3%ALLM6NSE