DB41T 987-2014 脱毒甘薯种薯(苗)病毒检测技术规程

DB41Technicalcriterionforvirusdetectionofvirus-freesweetpotatoseedtuberor2014-12-30发布河南省质量技术监督局发布I 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 25.1硝酸纤维素膜酶联免疫吸附测定（ 2 3 3 3 3 3 3 3 3附录A（规范性附录）硝酸纤维素膜酶联免疫吸附测 4 6 7 91脱毒甘薯种薯（苗）病毒检测技术规程脱毒组培苗virus-freetissueculSPCSV）和甘薯卷叶病毒（Sweet脱毒种薯（苗）virus-freeseedtuberors用原种作种薯，在隔离条件下生产出的符合质量要求2各级甘薯种薯（苗）繁殖田中允许出现病毒病症状植）；）；4.1组培苗抽样4.1.1脱毒组培苗4.1.2扩繁苗4.2.1原原种田抽样的面积取样。每株取上、中、下部叶片1g～5g，-4.2.2原种田和大田用种田抽样定植后30d、收获前两周，在目测的基础上，采用五点取样法。取样方法及样品5.1硝酸纤维素膜酶联免疫吸附测定（N用于检测SPFMV、SPLV、SPVG、SPV2、SPCFV、SPCSV和SPLCV共7种病毒，检5.2指示植物检测法用于辅助检测SPFMV、SPLV、SPVG、SPV2、SPCFV、SPCSV和SPLCV共7种3别利用PCR和RT-PCR检测。允许带毒率为0，先目测调查样品的病毒显症率，然后利用NCM-ELISA或指示植物进行检测，至少其中5%的样品分别利用PCR和RT-PCR检测。SPFMV、SPLV、SPVG、SPV2和SPCFV的允许带毒率≤2.0%，SPCSV和SPLCV的先目测调查样品的病毒显症率，然后利用NCM-ELISA或指示植物进行检测，至少其中1%的样品分别4A.1溶液配制A.1.1Tris-HCl溶液[c(Tris-HCl)=1.0mol/L]：称取60.60300mL无菌蒸馏水中，加入32.5），A.1.2氯化钠溶液[c(NaCl)=5.0mol/L]：称取292.20g氯化钠A.1.3三羟甲基氨基甲烷溶液（TBS分别取1mol/LTris-HCl（A.1.1）2A.1.4洗涤缓冲液（TBST0.5mL吐温-20（Tween-20）溶于1LTA.1.5抽提缓冲液：称取亚硫酸钠（NaA.1.6封闭缓冲液：称取脱脂奶粉0.50g，分别量取曲拉通（Triton）X-10025mL。先将脱脂奶粉溶于少量TBS（A.1.3）中，再用TBS（A.1.3）定容至25mL，加入TritonX-100A.1.7抗体缓冲液：称取脱脂奶粉1.00g，量取TBS（A.1.3）50mL。先将脱脂奶粉溶解于少量TBSA.1.8底物缓冲液：分别称取三羟甲基氨基甲烷6.10g、氯化钠2.90g、氯化镁（MgCl2•6H20.50g，溶于400mL蒸馏水中，用浓盐酸调pH值至9.5，定容A.1.105-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐（BCIP）储A.1.11NBT/BCIP底物溶液：先后取100µLNBT贮备液（A.1.9）和100µLBCIP贮备液（A.1.10加A.2样品制备加入3mL抽提缓冲液充分研磨，6000A.3操作步骤A.3.1点膜取15µL上清液滴在膜上方格的正中，室温干燥15min～30min。同时设阳性、阴性和空白对照。根据5A.3.2封闭将干燥后的膜浸入封闭缓冲液中，室温下摇床振荡1h，转速为50r/A.3.3与一抗反应将膜置于用抗体缓冲液稀释至工作浓度的病A.3.4洗膜用洗涤缓冲液洗膜4次，每次摇床振荡3min，转速A.3.5与二抗反应A.3.6洗膜用滤纸将膜表面的溶液吸干，将膜置于NBT/BCIP底物溶液中，A.3.8终止反应弃去底物溶液并用蒸馏水洗膜3次，每次摇床振荡10min，转速A.3.9结果判断6在防虫条件下盆栽巴西牵牛（Ipomoeasetosa至1～2片真叶时嫁接。削成楔型，插入砧木的切口内，用封口膜扎紧，置25℃~30℃防虫网室内，嫁接15d～30d后观察记），接的巴西牵牛植株均没有表现任何病毒病症状，样品为阴性；只要有1株表现病毒病症状，该样品判断7C.1.1TAE电泳缓冲液：称取三羟基甲基氨基甲烷（Tris）242.0g、冰乙酸57.1mL、Na2E37.2g，用氢氧化钠调pH值至8.5，灭菌C.1.2溴化乙锭（EB）溶液：称取溴化乙锭C.1.31.0%琼脂糖凝胶板：称取1.00g琼脂糖加入100mLTAE电泳缓冲液中，在微波炉中加热至琼脂糖融化，温度降至50℃~60℃时，加溴化乙锭溶液（EB）5µL，摇匀，倒入电泳槽中均匀铺板，凝固C.1.4CTAB缓冲液：称取CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）20.00g、NaCl81.80g、EDTA5Tris12.10g，溶于1L蒸馏水中，用HCl调pH值至8.0，高温灭菌后加入PVP（聚乙烯吡咯烷酮C.1.6加样缓冲液：称取EDTA预热（60℃)CTAB缓冲液(C.1.4)。取0.5g新鲜植物材料，于液氮中研磨成粉，把粉末倒入盛有预热的600µLCTAB缓冲液(C.1.4)的1.5ml的eppendorf管中，再加入20µL巯基乙醇离心10min；将上清液转入另一离心管中，加入2/3体积的异丙醇，小心混匀后-20℃放置30min以上，可见DNA絮状沉淀；10000r/min离心10min，弃去上清液；沉淀加清洗缓冲液（70%乙醇，100mmol/L醋酸铵）漂洗2～3次，10000r/min离心10min，沉淀风干后溶于50µLTE缓冲液(C.1.5)。开展后续PCR反应体系为：灭菌重蒸水36.7µL，dNTPs（2.5mmol/L）4µL，10×ExTaqBuffer8制备1.0%琼脂糖凝胶板（C.1.3）。在电泳槽中加入TAE产物与加样缓冲液混合后，加入凝胶孔进行电泳。恒压（120V～150V）下电泳应用本标准的检测方法对待检样品进行检测，如果在2800bp对应位置出现特异性条带，则判定样9D.1.1DEPC水：取焦碳酸二乙酯（DEPC)50µL加至100mL灭菌蒸溜水中，室温放置D.1.2引物溶液：用DEPC水（D.1.1）D.1.3TAE电泳缓冲液、1.0%琼脂糖凝胶板和溴化乙锭（EB）溶液：TAE电泳溶液和1.0%琼脂糖凝胶板配制方法分别同附录C.1.1、C.1.称取0.1g叶片放于研钵中，加液氮充分研磨成粉，将粉末迅速转入到无RNase的无菌1.5mL离心管倒置于灭菌滤纸上，自然干燥；加入25-200µLDEPC水（D.1.1）溶解沉淀反转录反应体系为：dNTPs（10mmol/L）1µL，MgCl2（25mmol/L）1µL，5×AMV缓冲液2µL， 5µL，上游引物CSV70P1（10µmol/L）和下游引物CSV70P2（10µmol/L）各1µL，制备1.0%