第四章-目的基因的分离

第四章目的基因的分离

教学要求：

掌握常用的目的基因制备方法目的基因的分离基本原理及应用

原核生物基因的组成

真核生物基因的组成

真核生物基因的转录

结构基因

结构基因（Structuralgene）是指一类不仅可转录成信使RNA（mRNA），而且可翻译成多肽链，从而构成各种结构蛋白质（包括催化各种生化反应的酶）的基因。第一节目的基因的制备

直接分离法构建基因组文库分离法构建cDNA基因文库分离法聚合酶链式反应技术扩增目的基因基因的化学合成

什么是基因？基因是指携带有遗传信息的DNA序列，是控制性状的基本遗传单位亦即一段具有功能性的DNA序列。基因通过指导蛋白质的合成来表达自己所携带的遗传信息，从而控制生物个体的性状表现。

目的基因基因工程的主要目的是使优良性状相关的基因聚集在同一生物体中，创造出具有高度应用价值的新物种。为此，必须从现有的生物群体中，根据需要分离出用于克隆的此类基因。通常将那些已被或者准备要被分离、改造、扩增或表达的特定基因或DNA片断，称为目的基因。生物界的长期进化积累了大量对人类有用的基因，这是一个宝贵的资源。2012年1月5日报道，美国诞生了首例转基因猴，它们的基因来自六个不同的胚胎。一、直接分离法限制性核酸内切酶酶切分离法基因分离的物理化学法“鸟枪法”1、限制性核酸内切酶酶切分离法适用于从简单的基因组中分离目的基因（例如质粒或病毒）已定位：根据目的基因两侧的已知的酶切位点，一次就可以获得。已定序：只需要用已知序列的限制性内切酶进行一次或者多次酶切，分离纯化所需的DNA片段，与适当载体连接。未定序或无定位：也只需酶切分析，随后再通过部分酶切，构建一个简单的基因文库，然后钓出目的基因。优点由于带有粘性末端，产物可以直接与载体连接。缺点目的基因易被切碎。2、基因分离的物理化学法

基本原理是DNA分子的两条链存在着G≡C、A﹦T碱基配对，其中GC间存在着3个氢键，AT间存在着2个氢键。如果不同基因的碱基组成差异较大，其理化性质如浮力密度、解链温度等也有明显不同，采用相应的方法即可达到从生物基因组分离目的基因的目的。密度梯度离心法（富含GC的片段浮力密度大，使用精密的密度梯度超速离心技术）单链酶解法（富含GC的片段Tm高）分子杂交法（碱基互补配对）缺点：仅在理论上有重要意义，在实践上很难应用。密度梯度离心法单链酶解法分子杂交法物理化学法富含GC的片段浮力密度大富含GC的片段Tm高碱基互补配对非洲爪蟾5SDNA海胆DNA大肠杆菌乳糖操纵子的β-半乳糖苷酶3、“鸟枪法”（Shotgun）将目的DNA随机地处理成大小不同的片段，再将这些片段的序列连接起来的测序方法。最初主要用于测定微生物基因组序列。后来，“生物鬼才”文特尔（CraigVenter）及其公司美国塞莱拉公司先后利用改进的全基因组“鸟枪法”完成了果蝇和人类基因组的测序工作，证明了它在测定大基因组上的可行性和有效性。使用多种限制性内切酶或超声波等方法将生物细胞染色体DNA切割成基因水平的许多片段将这些片段与适当的载体结合，将重组DNA转入受体菌扩增，获得无性繁殖的基因文库结合筛选的方法从众多的转化子中选出含有某一基因的菌株，从中将重组的DNA分离回收将重叠的序列进行拼接，最终得到DNA序列主要操作步骤：

1999年12月用“逐个克隆法”获得第一条人类染色体—22号染色体完成序列

2000年3月用“全基因组鸟枪法”获得果蝇全基因组序列。中国科学院2004年12月9日在北京宣布，国际鸡基因组计划取得重大成果：利用经济、快速、高效的测序方法――“鸟枪法”，我国科学家不仅和国际同行共同绘制出以红原鸡为对象的鸡基因框架图谱，而且领衔绘制出了乌鸡、肉鸡、蛋鸡等四种不同鸡种之间的遗传差异图谱。优点：

不需要高密度的图谱

速度快、简单、成本低缺点：

拼接组装困难，尤其在重复序列多的区域主要用于重复序列少、相对简单的原核生物基因组中国科学家的水稻基因组计划“提供了一个有关鸟枪测序法速度和效率的极好范例”。二、构建基因组文库分离法1、基因组DNA文库（genomicDNAlibrary）

从生物组织细胞提取出全部DNA，用物理方法或酶法将DNA降解成预期大小的片段，然后将这些片段与适当的载体连接，转入受体细菌或细胞，这样每一个细胞接受了含有一个基因组DNA片段与载体连接的重组DNA分子，而且可以繁殖扩增，许多细胞一起组成一个含有基因组各DNA片段克隆的集合体。2、基本步骤①细胞染色体大分子DNA提取和大片段的制备；②载体DNA的制备；③载体与外源大片段的连接；④体外包装及基因组DNA文库的扩增；⑤重组DNA的筛选和鉴定。

3、基因组DNA文库的特点1975年，Clarke和Carbon提出计算重组子数目的公式：N=ln（1-P）/ln（1-f）式中，N为所需的重组子的数目；f为单个重组体中插入片段平均大小与基因组DNA总量之比；P为选出某一基因的概率（通常期望为99%）。以人

-珠蛋白基因为例，分子量约为1.5Kb。那么如果要构建一个

-珠蛋白基因的基因组文库（筛选到的可能性为99％

），这个基因组文库要多大？为了使基因组文库具有真实代表性，一般构建基因组文库的实际克隆数应比上述计算值大2倍或3倍，甚至更高。对于原核和低等真核细胞，基因结构比较简单，基因组文库可作为直接提供基因工程所需的各种目的基因的重要来源。较高等的真核细胞，尤其是人和哺乳动物细胞，基因结构较为复杂，一个结构基因往往可被数个插入序列所间隔，因此从基因组文库中分离得到的基因片段很难直接用于体外的表达研究。但它们对真核细胞基因结构的分析、基因表达和调控的研究有着重要作用。三、构建cDNA基因文库分离法

1、cDNA

基因文库概念提取组织细胞的全部mRNA，在体外反转录成cDNA，与适当的载体常用噬菌体或质粒载体连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。2、构建步骤

细胞总RNA的制备及mRNA的分离与完整性的确定；cDNA

第一条链与双链cDNA

的合成及克隆；cDNA

与载体的连接、噬菌体颗粒的包装及转染或质粒的转化与鉴定等。组织或细胞mRNAcDNA大小分级可供克隆的

cDNA片段载体（选择一种）连接片段和载体将重组载体导入大肠杆菌（体外包装或转化）滴定并鉴定文库筛选目的克隆扩增文库长期保存3、cDNA

克隆的主要优点特别适用于某些RNA病毒的基因组结构研究筛选比较简单易行

目的基因的选择中出现假阳性的概率比较低可用于在细菌中能进行表达的基因的克隆可用于真核细胞mRNA的结构和功能研究4、cDNA

克隆的主要缺点cDNA

文库所包含的遗传信息要远远少于基因组DNA文库不能直接获得基因的内含子序列和基因编码区外大量的调控序列的结构与功能方面的信息低丰度mRNA的cDNA

克隆所占的比例比较低基因组文库与cDNA文库的特点比较：四、聚合酶链式反应技术扩增目的基因聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）技术简称PCR技术，是一种体外扩增特异DNA片段的技术。PCR这项技术是由凯利·穆利斯(KaryMullis，美国化学家)于1985年发明，1993年获得诺贝尔化学奖（还荣获了日本颁发的45万美元的奖金

）。1985年10月25日申请了PCR的专利，1987年7月28日批准（专利号4,683,202），Mullis是第一发明人。DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。1、PCR的原理2、PCR步骤DNA变性（90℃-96℃）退火（25℃-65℃）延伸（70℃-75℃）

3、典型的PCR反应体系

4、PCR的应用鉴定基因亲子鉴定诊断遗传病克隆基因诱变分析远古DNA鉴定特定表型的突变体基因比较基因表达量PCR的种类反向PCR(InversePCR,IPCR)不对称PCR(asymmetricPCR)多重PCR反转录PCR(reversetranscription,RT-PCR)巢式PCR(NESTPCR)递减PCR(TouchdownPCR)荧光定量PCR（Q-PCR)PCR引物设计原则（PCR的第一步

）五、基因的化学合成

人工合成基因的方法主要有两条途