生物学基本技能 课件 Ⅻ 生物人工杂交

生物学基本技能基本技能

Ⅻ生物人工杂交CONTENTS目

录01Part01实验目的03Part03植物人工杂交技术02Part02杂交相关术语04Part04动物人工杂交技术05Part05微生物人工杂交技术06Part06实验操作实训1.了解各种生物人工杂交技术的基本原理和操作流程。2.掌握动物、植物和微生物的人工杂交技术。一、实验目的杂交技术是遗传分析和遗传育种常用的最基本的实验方法，通过杂交可以获得杂种或新的种质资源，继而选择培育出新品种。根据杂种产生的方式，杂交技术可分为自然杂交和人工杂交。自然杂交亦称为“天然杂交”，是遗传基础不同的亲本在自然状态下的交配，产生的杂种具有双亲遗传性或超亲本性状，易于定向培育，是常规育种的重要原始材料。人工杂交是指在人工控制的条件下，按照预定的目标、计划，遵循一定的程序，采用一定的方法，使遗传性不同的亲本进行交配或结合，产生的杂种具有双亲遗传性或超亲本性状。一般情况下，杂交都要经过个体间的接触即交配，这种杂交称为有性杂交；如果没有交配的过程，则称为无性杂交。把体细胞相互融合的过程称为体细胞杂交。杂交可以发生在不同的水平上，有个体水平上的杂交、细胞水平上的杂交和分子水平上的杂交。按生物的种类又可分为植物杂交、动物杂交、微生物杂交、噬菌体杂交等。二、杂交相关术语植物有性杂交是利用遗传性状不同的亲本进行交配，以组合两个或多个亲本的优良性状于杂种体中，并经过基因的分离和重组，产生各种性状的变异类型，从中选出需要的基因型，进而创造出对人类有利的优良品种。（一）水稻杂交技术1）调节开花期。水稻母本和父本花期的调整，可用分期播种的方法，使二者的花期相遇。2）选株。选株主要指选择母本植株。要选择具有本品种典型性状、生长健壮和没有病虫害的植株作母本。3）选穗。用镊子轻轻撬开稻穗中部的小穗，若中部的小穗在当天或次日能够开花，则雌稻穗可以作为母本。当天能够开花的标志是花丝已经伸长，花药即将顶到内稃上端；次日开花的标志是雄蕊的长度已达内稃长度的2/3。可以将小穗对着太阳观看，从外表能隐约看到雄蕊在花里的位置。4）整穗。先用剪刀剪去母本稻穗上部和下部枝梗上的小穗，留下中部枝梗上的20～30个小穗，其他小穗统统剪去。三、植物人工杂交技术（一）水稻杂交技术5）去雄（1）常规去雄法：常规去雄法包括温水杀雄、剪颖去雄、化学杀雄等，水稻育种多采用前两种方法。温水杀雄去雄较彻底，但操作不便、效率低，不能满足高效育种工作的需要。剪颖去雄是水稻育种应用最多的方法，操作简便、实用，但将一朵颖花中的花药完全剪去的同时，很容易伤及雌蕊柱头。一般情况下雌蕊柱头在颖壳中低于雄蕊花药，但很多水稻品种也存在柱头与花药齐平或者微低的情况，常规剪颖去雄难以保证不伤及柱头，容易导致柱头被伤，杂交失败。（2）改良的剪颖去雄法：将水稻颖壳中的雄蕊花药完全剪去改为剪去一半或更少，即要将花药剪破，然后马上向剪雄后的颖壳内浇水，将花药打湿。由于雄蕊被打湿，湿度增加，花丝很快就会伸长，干瘪的花药伸出颖壳，此时用手指轻弹几下，干瘪的花药就会被弹掉，然后套上纸袋，等待授粉。此剪颖法，伤及雌蕊柱头的可能性大大降低，从而大大提高了杂交的成功率。为提高工作效率，可在授粉的前一天下午等花完全开过后剪颖浇水，然后第二天上午开花之前套袋。三、植物人工杂交技术（一）水稻杂交技术6）套袋挂牌。不管是采用哪一种方法去雄，去雄后都要及时在母本的稻穗上套上白色硫酸纸制作的袋子，以防发生自然杂交，并在母本稻穗下方挂上特制的小纸牌，用铅笔在小纸牌上注明母本名称、去雄日期、操作者姓名等内容。7）采粉和授粉。去雄的母本稻穗应在当天或次日进行人工授粉。（1）常规授粉：打开母本稻穗上的袋子，利用盛花期的父本稻穗在剪颖的母穗上抖动，使花粉掉落在母穗花的柱头上，从而达到授粉的目的。通常情况下，此法很实用，但在大风等恶劣天气下，此法效果并不好。因为盛花期的父本穗经大风一吹，所剩的花粉已很少，在人工取穗时碰撞又使花粉散落，花粉所剩无几，杂交成功率大打折扣。（2）新技术授粉：在父本穗盛花期来到之前（少数颖壳开始开花），将父本穗剪下，剪去已开过花的穗子，将剩下的穗用水打湿，然后甩干放入套纸袋的母穗上，将纸袋口封住，等父本穗大量开花时，抖动父本穗，父本穗上的花粉就不会有任何损失。将父本穗事先都剪好放入母穗中，等开花时逐一授粉，大大提高了工作效率和杂交成功率。三、植物人工杂交技术（一）水稻杂交技术8）检查。花粉被授到柱头以后，经过2～3min就可萌发形成花粉管，30min后花粉管进入胚囊，受精过程在开花后1.5～4h内完成。授粉10天以后，摘去杂交穗上的纸袋，如果授粉小花内的子房已经膨大，表示已经受精，说明杂交成功。为了使杂交种子正常进行生长发育，可暂时不套纸袋，待籽粒长大时再套纸袋，以防鸟类啄食。9）收获。杂交籽粒成熟后，将每个杂交稻穗单独脱粒、保存，供来年播种观察。三、植物人工杂交技术（二）小麦杂交技术1）确定组合、种植亲本。根据育种目标，确定杂交组合。根据双亲生育期调整播期，晚熟的早播，早熟的迟播或分2～3期播种，每期相隔10～15天，以确保花期相遇。2）选穗。根据杂交组合，在母本种植区内，选择具有该亲本典型性状且健壮无病虫害的植株作为杂交母本株，选取抽穗但未开花、中部小穗的花药呈黄绿色的麦穗作为杂交母穗。3）整穗。用剪刀剪去上下部发育不良或过嫩的小穗，有芒品种剪去芒，每穗留中部小穗8～10个；用镊子夹去小穗上部的小花，每小穗只保留基部外侧两朵小花供去雄。4）去雄。从穗的一侧上部小穗开始顺序而下，用剪刀剪去小花上部1/3左右的颖壳，用镊子轻轻取出每朵小花中的3枚花药。如花药破裂或伤及柱头，则将该小花除去，并将镊子浸入乙醇以杀死所沾花粉。三、植物人工杂交技术（二）小麦杂交技术5）套袋。将麦穗上全部小花去雄后，立即套上透明硫酸纸袋，并将其下端斜折，用大头针别好。在麦穗和剑叶叶鞘间挂上小纸牌，注明母本名称、去雄日期和操作者姓名等，并在工作簿上逐一记录。6）授粉。在去雄后第2～3天内授粉，通常在上午开花盛期进行，阴雨天可略推迟。普通授粉法；捻穗授粉法。授粉后在小纸牌上注明父本名称和授粉日期，并在工作簿上逐一记录。7）收获。待种子成熟后，及时按杂交组合将杂交穗收回，晒干脱粒，调查结实率，并按杂交组合或代号进行登记、编号，以备下季种植。三、植物人工杂交技术（三）棉花杂交技术1）母本选株和定蕾。在棉花开花的前一天16：00以后，在拟定组合的母本行中选择具有母本典型性状的生长健壮、无病优良的植株。第二天早晨必开的花的外观是：花冠呈螺旋形折叠，但花瓣已经长大露出苞叶。2）去雄。授粉前一天下午，先检查和摘除田间已自花授过粉的棉铃，再对第二天将要开放的花朵实施剪雄去雄。用剪刀在花萼基部或花冠两侧剪开一条缝，然后把缝拨开，使雄蕊和雌蕊露出（也可剪去一部分花冠），再用剪刀或镊子除去花药。3）父本隔离。在母本去雄的同时，选父本植株上次日可以开花的花蕾，用线或回形针或麦管隔离，注意用线扎花冠顶端时不要太松，以免次日花冠上张开的小孔让昆虫进入，使父本花粉混杂；也不要过紧，以免扎破花冠和扎住柱头。三、植物人工杂交技术（三）棉花杂交技术4）授粉。在去雄后第2～3天内授粉，棉花绝大部分花在天气晴朗的上午8时左右开放。当露水退后，即可在父本行中采集花粉或摘花，给母本的花授粉。采集花粉，可用毛笔蘸取花粉涂抹在不育花的柱头上。如果摘下父本的花，可直接在母本的柱头上涂抹。5）挂牌。授粉后在塑料牌上写明组合名称或代号、授粉日期和操作者姓名，挂在铃柄上。6）检查受精情况。授粉3～4天后，若子房膨大，柱头失去光泽说明杂交成功。7）管理收获和保存。对杂交株要注意摘老叶、整枝、摘去亮度心和果枝上多余的花蕾，改善通风透光条件，注意防治病虫，以提高结铃率和杂交种子数。吐絮后及时将杂交铃连同塑料牌一起收摘，放入种子袋中，晒干后可按组合剥出棉籽，妥善保存，以供下季种植。三、植物人工杂交技术（三）棉花杂交技术三、植物人工杂交技术（四）玉米杂交技术1）调节开花期。由于玉米是单性花，在调节开花期方面，必须使母本的雌穗和父本的雄穗的花期一致。可用分期播种的方法调节父、母本的花期。2）选株。父、母本均应选择生长健壮、无病虫害和具有本品种典型性状的植株，作为杂交对象。3）套袋隔离。当母本植株的雌穗已经露出而没有伸出柱头以前，用牛皮纸袋套好雌穗。当母本雌穗开始抽出柱头时，要在当天用牛皮纸袋套在父本植株的雄穗上。雌、雄穗的纸袋，要用细绳或回形针扎紧，以免脱落。4）采粉。根据玉米的开花习性，其雄穗在始花后的第2～4天内开花最多，进入盛花期；一天中开花最多的时间是上午8～10时，而此时花粉的生活力也最强。雌穗在始花后的第2～4天处于盛花期，柱头已基本抽齐。采集花粉时，将父本雄穗稍稍下弯，轻轻抖动，用人工辅助授粉器（用光滑的厚纸制成1个圆锥形的纸筒，用厚纸作纸盖盖住下口。三、植物人工杂交技术（四）玉米杂交技术5）授粉。授粉时，先取下雌穗上的纸袋，立即用人工辅助授粉器的下口对准雌穗的柱头，轻轻抖动授粉器，使花粉落在柱头上。授粉后，仍用原来的纸袋将雌穗套好，但应在袋顶和穗顶之间留出一定距离，以防止因果穗伸长而顶破纸袋。6）挂牌。纸袋套好后，应在雌穗基部拴上纸牌（或塑料牌），写明杂交组合、授粉日期和操作者姓名等内容。7）收获。母本果穗成熟后，应连同纸牌（或塑料牌）一起收获，并单独保存，供来年播种以检验杂交是否成功。三、植物人工杂交技术（一）果蝇杂交技术1）果蝇培养（1）培养基制备：酵母菌是果蝇幼虫和成虫的主要食物，凡是能发酵的物质都可成为果蝇的培养基。早年果蝇研究者用香蕉捣成泥糊做成培养基，现在实验室多用玉米粉琼脂培养基培养果蝇。果蝇培养基的配制方法很多，以配制1000mL为例说明配制的过程。培养基成分如下：四、动物人工杂交技术（一）果蝇杂交技术1）果蝇培养（2）果蝇培养：温度对果蝇的生长发育影响很大。20～25℃是果蝇的最适生长温度；30℃以上高温能致果蝇死亡；在20℃以下时可使果蝇的生活周期延长；低于10℃时则影响果蝇的生活力和繁殖力。可以利用这一特点来调节果蝇生长的速度，控制其群体的大小。如原种的培养旨在保种，可先将果蝇在22℃条件下培养一周，当幼虫出来后可将温度调至18℃左右培养；杂交实验时需要较大的群体，可将培养温度设为23℃左右。杂交时还可根据实验的时间安排随时调整果蝇的培养温度。2）果蝇处理技术（1）雌雄鉴别：利用果蝇做杂交实验时，必须准确地识别性别。雌雄成蝇的区别表现在多个方面，可用放大镜、显微镜（低倍）、解剖镜或直接从外形上加以辨认。四、动物人工杂交技术（一）果蝇杂交技术2）果蝇处理技术雌雄果蝇的主要区别如下：四、动物人工杂交技术（一）果蝇杂交技术2）果蝇处理技术（2）果蝇的麻醉及观察：无论是进行果蝇性状观察还是进行果蝇杂交实验分析，都必须先将果蝇麻醉使其处于静止状态后方可进行。首先，在一软木塞上钉一图钉，在图钉上缠上脱脂棉，将此软木塞盖在一250mL的广口瓶上，做成麻醉瓶。将一培养皿的底部粘一条滤纸，做成麻醉用的麻醉皿。其次，麻醉时，准备好培养瓶、麻醉瓶和乙醚。轻拍瓶壁，让果蝇震落到培养基上。如瓶塞上附着果蝇，则稍稍晃动瓶塞，并将它们拍落到培养基上。拔去麻醉瓶塞与培养瓶塞，迅速将培养瓶口倒扣在麻醉瓶口上。轻拍培养瓶让果蝇落入麻醉瓶中（如果培养瓶中的培养基已很稀松，则切勿倒扣，应将麻醉瓶扣在培养瓶上，果蝇具有趋光性和向上性，会主动向上向有光的方向爬）。最后，把麻醉瓶中的果蝇拍落瓶底，拔出瓶塞，在塞子上滴几滴乙醚，重新塞上麻醉瓶。麻醉约1min后果蝇便不再活动，纷纷落入瓶底，此时果蝇的翅膀呈收紧状态。长时间麻醉、乙醚用量过多时会使果蝇死亡。四、动物人工杂交技术（一）果蝇杂交技术3）杂交操作（1）选处女蝇：将培养瓶内的成蝇全部除去，12h内培养瓶中将重新孵化出许多果蝇。将新孵化出来的果蝇引入麻醉瓶麻醉，根据雌雄果蝇的特征将12h内重新孵化出的雌雄果蝇分开，即可得到处女蝇。（2）杂交：将选出的突变型处女蝇转入杂交瓶中（内有新配制的培养基）。同时麻醉选取野生型雄蝇8～10只，放入同一个杂交瓶中。在杂交瓶上贴上标签，注明杂交组合、杂交日期和操作者姓名等。在25℃条件下或室温下进行培养。（3）培养：25℃条件下或室温下培养7～8天后，除去亲本蝇。（4）观察F1代：11～13天后，F1代羽化为成蝇。（5）观察F2代：从观察统计的F1代成蝇中，各选雌雄果蝇8～10只，转入自交瓶中，在自交瓶上贴上标签，注明自交日期、操作者姓名等。在25℃条件下或室温下进行培养。12天后，F2代羽化为成蝇，将其麻醉后于白瓷砖上用放大镜观察，或用解剖镜、显微镜观察各种表现型的果蝇。四、动物人工杂交技术（二）小鼠杂交技术1）小鼠操作方法（1）性别鉴别：成年鼠性别很容易区分，雄鼠的阴囊明显；雌鼠可见阴道开口和五对乳头。幼鼠或仔鼠则主要从外生殖器与肛门的距离判定，近者为雌，远者为雄。另外，雌鼠肛门和生殖器之间有一无毛小沟，而雄鼠则在肛门和生殖器之间长毛。再者，雌鼠比雄鼠明显多很多的乳头。（2）小鼠固定操作技术：绝大多数品系的小鼠经过长期的驯养和人为的挑选，性格都是很温驯的，除了受到攻击以外都不会咬人。小鼠实验过程中，操作要平稳快速，如果在操作中发现小鼠变得焦躁不安，应停止对小鼠的动作，等其平静下来后再重新开始操作。

抓颈部的动作好坏是固定小鼠的关键，要将小鼠固定好须用手抓住小鼠颈部背后的所有疏松的皮。四、动物人工杂交技术（二）小鼠杂交技术2）杂交繁育技术不同品系、不同种群有不同的繁殖方法，适宜的繁殖方法是保证小鼠质量的前提。（1）种鼠：种鼠可由外单位引入，也可由本单位自己保种。引种的小鼠必须遗传背景明确，来源清楚，有完整的资料，包括种群名称、来源、遗传基因特点及主要生物学特性等。进入生产的种鼠要经过挑选，也就是选种。选种在小鼠离乳时进行初选，种鼠应符合该品系的遗传学特征，无变异。双亲体质健康无疾病，活力强。初选时按健康标准一般选留2～5胎的仔鼠，适当延长哺乳期到23天，然后雌雄分开，同时做好记录。（2）杂交繁育方法：将种鼠按事先定的配种方案置于繁殖盒中，建立杂交繁育卡。杂交配种方案因小鼠的种类品系不同而不同。广义的杂交繁育（如大群生产）有两种方法：长期同居法、定期同居法。四、动物人工杂交技术（二）小鼠杂交技术3）不同类型鼠群的繁育（1）近交系的维持和生产：繁殖用原种小鼠必须遗传背景明确，来源清楚，有完整的谱系资料，包括品系名称、近交代数、遗传基因特点及主要生物学特征等。引种小鼠应来自近交系的基础群，以2～5对同窝个体为宜。小鼠近交系一旦育成，应按保种的有关规定，维持其特定的生物学特征的稳定，保持其基因同一性和基因纯合性。近交系小鼠的维持和生产包括4个群。生产过程一般是从基础群移出种鼠，经扩大群扩增后，建立生产群，由生产群繁殖仔鼠进入供应群。（2）封闭群小鼠的维持和生产①维持。小鼠保种时应尽可能多的保留繁殖个体。②生产。常用的方法有一雄多雌同居交配法和雌雄1：1同居交配法。四、动物人工杂交技术（一）大肠杆菌杂交技术1）培养基制备LB培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，其成分为：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl10g/L。若制备固体培养基，只需再加入琼脂粉15g/L，调节pH至7.4～7.6，配好后高压灭菌即可。2）杂交操作（1）亲本选择：亲本选择供体菌、受体菌。（2）菌种活化：分别接一环供体菌和受体菌于5mLLB培养液中，37℃振荡培养10～12h。（3）扩大培养：扩大培养需各取1mL过夜培养物，分别加入两个盛有5mLLB培养液的250mL三角瓶内，37℃振荡培养2～3h。五、微生物人工杂交技术（一）大肠杆菌杂交技术2）杂交操作（4）混合培养-杂交：混合培养-杂交需吸取0.5mL供体菌和4.5mL受体菌，加入一个无菌的250mL三角瓶中混合，置37℃摇床上培养100min。（5）观察统计：将上述接合菌液用生理盐水稀释10、100倍。各吸取0.1mL稀释液涂布在选择培养基平板上，每一种稀释液涂布两个平板。同时将供体菌及受体菌分别吸取0.1mL涂布在选择培养基上作为对照，每种菌各两个平板，均于37℃条件下培养48h。最后，观察统计菌落数目。

五、微生物人工杂交技术（二）放线菌杂交技术1）混合培养法（1）选择性平板法：选择性平板法所使用的两亲株必须是互补的营养缺陷型。将用来进行重组的两亲株混合，接种到丰富的完全培养基斜面上；孢子形成后制成单孢子悬浮液。然后在选择培养基平板上进行分离，长出的菌落即为各种类型的重组体。（2）异核系分析法：将混合培养后所制得的单孢子悬浮液，分离在基本培养基平板上，其中长成的小而丰富的菌落即为异核系。然后将异核系再分离在完全培养基上，长出的菌落即为分离子。2）平板杂交法平板杂交法是先将菌落培养在非选择培养基上，当菌落形成孢子后，用影印培养法将菌落印至已铺有试验菌孢子的完全培养基平板上，再培养至孢子形成。然后把上面的孢子影印到一系列选择培养基上，以便于各种重组体子代的生长。

五、微生物人工杂交技术（二）放线菌杂交技术3）玻璃纸转移法使用玻璃纸转移法必须具备两个条件：①直接亲本必须带有两个遗传标记，即一个直接亲本带有一种营养要求和抗药性（如抗链霉素），而另一个直接亲本则为对该药物敏感（如对链霉素敏感）和带有另一种营养缺陷型；②选择培养基是带有抗性药物的补充培养基。玻璃纸转移法是在选择培养基上挑选异核系菌落，其原理是：异核体带有链霉素敏感的等位基因，在含有链霉素的选择培养基上不能生长。敏感性亲本和抗药性亲本因为营养要求得不到满足也不能在该选择培养基上生长，而不带链霉素敏感等位基因的两直接亲本的局部结合则能在该选择培养基上生长、繁殖成为异核系菌丛。五、微生物人工杂交技术（三）真菌杂交技术1）选择直接亲本直接亲本的遗传标记多种多样，如营养突变型、抗药性突变型、形态突变型等。2）异核体的形成在基本培养基上，强迫两株营养缺陷型互补营养，则这两个菌株经过菌丝细胞间的吻合形成异核体。直接亲本形成异核体的方法有：完全培养基液体混合培养法、完全培养基斜面混合培养法、液体有限培养基混合培养法、有限培养基平板异核丛形成法、基本培养基斜面衔接接种法、基本培养基平板穿刺法等。五、微生物人工杂交技术（三）真菌杂交技术3）双倍体的检出（1）用放大镜观察异核体菌落的表面，如果发现有野生型颜色的斑点和扇面，即可用接种针将其孢子挑出，进行分离纯化，即得杂合双倍体。（2）将异核体菌丝打碎，在基本培养基和完全培养基平板上进行分离，经培养挑出异核体菌落。个别异核体菌落上长出野生型原养性的斑点和扇面，将其挑出进行分离纯化即可。（3）将大量异核体孢子分离于基本培养基平板上，从中长出野生型原养性菌落，将其挑出分离纯化，即得杂合双倍体。前两种方法只能从每个异核体菌落上挑取一个斑点或扇面，以排除无性繁殖的干扰。五、微生物人工杂交技术（三）真菌杂交技术4）分离子的检出（1）将杂合双倍体单孢子分离于完全培养基平板上，培养至菌落成熟，从每个菌落挑出一个斑点或扇面的孢子于完全培养基斜面上，培养后经过纯化和鉴别即得分离子。（2）用选择培养基筛选分离子。五、微生物人工杂交技术（四）酵母菌杂交技术1）培养基制备（1）完全液体培养基：蛋白胨2g、酵母浸母汁1g、葡萄糖2g、水100mL（pH为6.0）、58.8kPa高压蒸气灭菌30min。（2）完全固体培养基：在完全液体培养基中加入2%琼脂。（3）基本液体培养基：葡萄糖10g、(NH4)2SO41g、K2HPO40.125g、KH2PO40.875g、KI母液（10mgKI溶于100mL水中配成）1mL、MgSO4·7H2O0.5g、CaCl2·2H2O0.lg、NaCl0.1g、微量元素母液（H3PO41mg、ZnSO4·7H2O7mg、CuSO4·5H2O1mg、CoCl2·6H2O5mg、水100mL，配成溶液）1mL、维生素母液（烟碱酸40mg、维生素B140mg、肌醇200mg、核黄素20mg、对氨基苯甲酸20mg、吡哆醇40mg、泛酸40mg、生物素0.2mg、水100mL，配成溶液）1mL、水1000mL，pH为5.3，58.8kPa高压蒸气灭菌30min。五、微生物人工杂交技术（四）酵母菌杂交技术（4）基本固体培养基：在基本液体培养基中加入2%琼脂。（5）产孢子培养基：乙酸钠8.2g、KCl1.86g、吡哆酵母液（20mg吡哆醇、100mL水）1mL、泛酸母液（20mg泛酸、100mL水）1mL、生物素母液（2mg生物素、100mL水）1mL、琼脂20g、蒸馏水1000mL。（6）补充培养基：①基本固体培养基100mL+组氨酸3.5mg；②基本固体培养基100mL+腺嘌呤3mg。五、微生