蒲公英总黄酮的提取及其抑菌性能

1、第 35卷 第 8期 东 北 林 业 大 学 学 报 Vol . 35No . 82007 8JOURNAL OF NORT HE AST F ORESTRY UN I V ERSI TY Aug . 2007蒲公英总黄酮的提取及其抑菌性能谷肄静 王立娟(生物质材料科学与技术教育部重点实验室 (东北林业大学 , 哈尔滨 , 150040 摘 要 研究了蒲公英总黄酮的提取条件及其抑菌性能 , 考查了乙醇质量分数 、 料液比 、 提取温度 、 提取时间 和提取次数等因素对蒲公英总黄酮提取效果的影响 , 并在单因素试验基础上进行了正交实验以确定最佳的提取条 件 。 试验结果表明 , 蒲公英总黄酮的最

2、佳提取条件为 :以 40%乙醇为提取剂 , 在 70 、 料液比 1 20条件下提取 4次 , 每次提取时间 30min, 蒲公英粗总黄酮的提取率为 17. 51%(以芦丁计 。 最佳提取条件下 , 相对标准偏差为 0. 41%, 说明试验重复性很好 。 利用蒲公英总黄酮对黑曲霉 、 宛氏拟青霉 、 酿酒酵母和枯草杆菌进行了抑菌试验研究 。 结 果表明 , 0. 43g/L(以芦丁计 对酿酒酵母具有一 定的抑菌作用 , 而对黑曲霉没有抑菌作用 。关键词 蒲公英 ; 总黄酮 ; 提取条件 ; 抑菌性能分类号 R285. 5Extracti on of Tot a l Fl avono i ds

3、fro m m mance /Gu Yijing, W ang L ijuan (Key Laborat ory of i 2(Forestry University , M inistry of Educa 2 ti on, Harbin Forestry University . -2007, 35(8 . -4345An experi m t study the extracti on conditi ons of t otal flavonoids fr om Taraxacum m ongolicum and its bacteri ostatic perfor The of eth

4、anol volu me fracti on, rati o of material t o liquid, te mperature, extracting ti m e and extracting ti m es on extracti on effect of t otal flavonoids fr om T . m ongolicum were discussed . The op ti m u m extracti on conditi ons of t otal flavonoids by using orthogonal experi m ent based on singl

5、e fact or were obtained as ethanol s olvent 40%, rati o of material t o liquid 1 20, extracti on at 70degree C for 4ti m es and 30m in for each ti m e . Yield of rude t otal fla 2 vonoids is 17. 51%(as rutin . Relative standard deviati on is 0. 41%under the op ti m u m conditi ons, which indicates a

6、 good repeatability . Bacteri ostatic perf or mances against A spergillus niger , Pacelio m yces variotii bainier , Saccharo m yces cere 2 visiae and B acillus subtilis for t otal flavonoids fr om T . m ongolicum were measured res pectively . Results show that the t otal flavonoids have str onger in

7、hibiti ons on P . variotii bainier and B. subtilis , and inhibit S. cerevisiae t o s ome extent, but have no inhibiti on on B. subtilis under a concentrati on of 0. 43g/L.Key words Taraxacum m ongolicum ; Total flavonoids; Extracti on conditi ons; Bacteri ostatic perf or mances 蒲公英是一种常见的药食两用植物 , 其提取

8、物的抑菌研 究主要针对于金黄色葡萄球菌 、 变形杆菌 、 大肠杆菌 、 绿脓杆 菌等细菌方面 , 在国内未见有关对霉菌的抑菌研究报道 1-4。 另外 , 针对蒲公英总黄酮的研究很少 , 尚未见与蒲公英中总黄 酮提取条件及其抑菌方面相关的研究 。 本研究针对蒲公英总 黄酮提取条件进行探讨 , 并考察其对 4种菌的抑菌性能 , 旨在 开发出一种全新的天然抑菌剂 。因为 , 目前常用的防腐剂大 多都为合成的化学物质 , 毒性较大 , 长期使用 , 危害人体健康 。 本研究还将为蒲公英的深加工及综合利用开辟新的途径 。 1 材料与方法1. 1 材料及试剂试验用蒲公英 (Taraxacum m ongo

9、licum 为 2004年秋采自 东北林业大学校园 ; 芦丁标准品 (美国 Sig ma 公司 ; 无水乙 醇 、 硝酸铝 、 亚硝酸钠 、 氢氧化钠等化学试剂均为分析纯 。 试验用菌为黑曲霉 (A sp . niger 、 宛氏拟青霉 (B aeclio m y 2 ces variotii Bainier 和酿酒酵母 (Sac . cerevisiae , 均购于广州 微生物研究所 ; 枯草杆菌 (B ac . subtilis 为自行分离 ; 培养基 为察式培养基 、 马铃薯培养基 (P DA 和牛肉膏蛋白胨培养基 。 试验仪器和设备有 :可见分光光度计 (722型 、 水浴锅 、 旋转

10、蒸发器 、 手提式压力蒸汽灭菌器 、 洁净工作台 、 恒温培养 箱 、 电子天平等 。1. 2 试验方法1. 2. 1 蒲公英总黄酮的提取蒲公英干粉 (1g 溶剂提取 过滤 滤液 测定总黄第一作者简介 :谷肄静 , 女 , 1979年 7月生 , 东北林业大学材料科 学与工程学院 , 在读硕士研究生。通讯作者 :王立娟 。收稿日期 :2006年 9月 28日。责任编辑 :戴芳天 。 酮并计算提取率 。1. 2. 2 蒲公英总黄酮的测定 标准曲线 :精密量取芦丁标准液 0、 1、 2、 3、 4、 5mL, 分 别置于 10mL 的容量瓶中 , 各加 30%的乙醇至 5mL; 然后分 别加入 5

11、%亚硝酸钠溶液 0. 3mL, 摇匀 , 放置 6m in 。各加 10%的硝酸铝溶液 0. 3mL, 摇匀 , 放置 6m in; 再各加 1mol/L的氢氧化钠溶液 4mL, 最后分别用蒸馏水稀释至 10mL, 摇 匀 , 放置 15m in, 在 510n m 测定吸光度 5。以芦丁质量浓度 为横坐标 , 吸光度为纵坐标绘制标准曲线 , y =0. 9044x -0. 01, R 2=0. 9982。 样品的测定 :提取后过滤 , 取滤液 1mL, 加蒸馏水稀释 100倍 , 测出吸光度 。 根据标准曲线可以测出样品中总黄酮 的量 (以芦丁计 。 提取率计算 :利用蒲公英总黄酮的提取率来

12、评价提取 效果 , 其计算式如下 :提取率 =(总黄酮质量 /蒲公英质量 ×100%。1. 2. 3 抑菌试验分别配制察式培养基 、 马铃薯培养基 (P DA 、 牛肉膏蛋白 胨培养基 。 用察式培养基培养黑曲霉 , P DA 培养基培养宛氏 拟青霉和酿酒酵母 , 牛肉膏蛋白胨培养基培养枯草杆菌 。选 择培养 4d 生长旺盛的试管斜面菌种 , 用灭好菌的移液管量 取 3mL 生理盐水 , 加入菌种试管 , 充分摇匀全部倒入另一只 含有玻璃珠的 9mL 生理盐水的试管中 , 充分震荡 ; 玻璃珠将 从斜面培养基上溶下的孢子完全打开 , 制作菌悬液 。 将 1mL 质量浓度为 0. 43

13、g/L(以芦丁计 的蒲公英粗总黄酮溶液均 匀涂于事先铺好培养基的培养皿中 ; 然后将菌悬液定量涂于 涂有蒲公英总黄酮的培养基表面 , 同时做空白试验 。 28 下 恒湿培养 , 定时观察 , 并对比分析结果 。2 提取条件对提取率的影响乙醇质量分数对提取率的影响 :以料液比为 1 15加入不同质量分数的乙醇 , 60 提取 1次 , 时间 1h 。 乙醇质量分数 对提取效果的影响见表 1。乙醇质量分数从 10%增至 30%, 提取率变化不大 ; 质量分数由 30%到 40%, 提取率大幅度增 加 ; 乙醇质量分数大于 40%以后 , 提取率逐渐减小 。因此 , 40%乙醇对蒲公英总黄酮的提取率

14、较高 , 提取效果最好 。 表 1 乙醇质量分数对提取率的影响 % 乙醇质量分数 提取率 乙醇质量分数 提取率106. 44506. 96 306. 56606. 26 407. 10705. 96 料液比对提取率的影响 :分别以不同料液比加入 40%乙 醇 , 60 提取 1次 , 时间为 45m in 。 料液比对提取效果的影响 见表 2。 料液比由 1. 0 10. 0增加至 1. 0 17. 5, 提取率呈缓慢上 升趋势 ; 当料液比为 1. 0 17. 5时提取率为 8. 53%, 达到最大 。 但当料液比大于 1. 0 17. 5后 , 提取率反而有所下降 ; 因为料 液比为 1.

15、 0 17. 5时 ,物 。 料液比增大 , ,较大的误差 。 17.表 2料液比 (g mL 提取率 料液比 (g mL 提取率 /% 1. 0 7. 55. 741. 0 17. 58. 53 1. 0 10. 05. 141. 0 20. 05. 54 1. 0 12. 55. 431. 0 22. 56. 03 1. 0 15. 07. 00 提取时间对提取率的影响 :以料液比为 1. 0 17. 5, 加入 40%乙醇 , 60 提取 1次 。 提取时间对提取效果的影响见表 3。 随着提取时间的延长 , 提取率先是不断地增加 , 而且幅度 较大 ; 当提取时间超过 45m in 后

16、, 提取率稍有下降 , 但幅度不 大 。 这说明提取时间为 45m in 时 , 蒲公英总黄酮的提取达到 平衡状态 , 继续延长提取时间 , 也无法使更多的黄酮类物质溶 出 。 所以 , 浸提时间 45m in 较适宜 。表 3 提取时间对提取率的影响提取时间 /min 提取率 /%提取时间 /min 提取率 /% 156. 15606. 67 306. 62756. 67 457. 00 提取温度对提取率的影响 :以料液比为 1. 0 17. 5, 加入 40%乙醇 , 不同温度下提取 1次 , 时间为 45m in 。 提取温度对 提取效果的影响见表 4。 提取率在温度为 3050 过程中

17、变 化不大 , 但在 50 处开始增大 , 温度达到 60 时 , 提取率达到最大值 。 这说明黄酮类化合物随着温度的升高其溶解度也越来越大 , 浸提效果也越来越好 。 但是温度过高 , 杂质的溶出 量也越多 , 而且对黄酮类化合物的稳定性不利 , 容易使其发生 氧化变质 , 失去应有的性质 。 所以 , 提取温度选择 60 。 表 4 提取温度对提取率的影响提取温度 / 提取率 /%提取温度 / 提取率 /% 305. 370607. 317 405. 270706. 270 505. 487806. 780 提取次数对提取率的影响 :以料液比为 1. 0 17. 5加入 40%乙醇 , 6

18、0 提取 , 每次提取时间为 45m in, 提取次数对提 取效果的影响见表 5。随着提取次数的增加 , 提取率也不断 增加 , 效果也越来越好 ; 当提取次数为 4次时蒲公英总黄酮提 取率基本达到最大值 , 残渣中的黄酮类化合物已基本提尽 , 效 果最好 ; 再继续增加提取次数 , 提取率变化很小 , 已没有意义 。 由此 , 为了保证总黄酮的提取率和节省时间 , 本试验选择最佳 提取次数为 4次 。表 5 提取次数对提取率的影响提取次数 /次 提取率 /%提取次数 /次 提取率 /% 16. 84416. 95 27. 93517. 00 39. 67 提取条件优化试验设计 :根据单因子试

19、验结果 , 选出料液 比 、 提取时间 、 提取温度和提取次数等因素进行 L9(34 正交 试验 , 结果见表 6。 由表 6的结果可知 , 在正交试验设计的范围内 , 最佳的实验方案为 A3B 1C 3D 2, 即料液比 1. 0 20. 0, 浸提 温度 70 , 提取次数 4次 , 每次提取时间 30m in 。 7号试验的 条件与最佳方案相同 , 其所对应的提取率也是最高的 , 说明正 交试验的结果是正确的 。表 6(A / mL (B温度(C /次数(D /次提取 率 /% 11. 0305039. 40 04560411. 26 31. 0 15. 06070516. 09 41.

20、 0 17. 53060511. 50 51. 0 17. 54570310. 39 61. 0 17. 5605049. 83 71. 0 20. 03070417. 51 81. 0 20. 0455059. 81 91. 0 20. 0606039. 95 k 112. 2412. 809. 669. 91k 210. 5810. 4710. 9012. 86k 312. 4211. 9614. 6612. 46极差 1. 842. 335. 002. 96最佳条件 A 3B 1C 3D 2 精密度试验 :取蒲公英粉末 4份 (每份 0. 5g , 按正交试 验所确定的最佳条件 , 加

21、40%乙醇溶液进行提取 , 过滤收集 滤液 ; 取滤液 1mL, 加水稀释至 5mL, 再取 1mL 稀释液进行 显色 , 于 510n m 处平行测定吸光度 , 并计算提取率 , 结果见表 7。 经计算 , 试验的相对标准偏差为 0. 41%, 说明试验精密度 高 , 重复性非常好 。表 7 精密度试验结果试验号 蒲公英粉 /g吸光度 A 提取率 % 10. 50020. 203018. 8 20. 50010. 201018. 7 30. 49970. 201518. 7 40. 50010. 202518. 8 3 抑菌试验结果蒲公英粗总黄酮对黑曲霉、 宛氏拟青霉、 酿酒酵母和枯草 杆菌

22、的抑菌效果见表 8。 分别观察培养 24、 36、 50h 时的菌种 生长情况 , 结果表明 , 蒲公英总黄酮对霉菌中的宛式拟青霉和 革兰氏阳性菌的典型菌种枯草杆菌具有良好的抑菌作用 , 24、 36h 几乎没有菌体生长 , 50h 产生的菌体较少 ; 对真菌中的酿 酒酵母具有一定的抑菌作用 , 24h 时没有菌体生长 , 36h 有少 量菌体生长 , 而 50h 产生的菌体较多 ; 对黑曲霉没有抑菌作用。 表 8 蒲公英总黄酮的抑菌效果时间 /h黑曲霉空白 粗总黄酮宛氏拟青霉空白 粗总黄酮酿酒酵母空白 粗总黄酮枯草杆菌 空白 粗总黄酮 24+-+-+-36+-+-50+ 注 :-无菌生长 ;

23、 +菌体较少 ; +菌体较多 ; +菌体很多。44 东 北 林 业 大 学 学 报 第 35卷4 结论研究了从蒲公英中提取总黄酮的提取条件 , 通过对提取影 响因素的试验研究 , 得出优化的提取条件为 :以 40%乙醇为提 取剂 , 在 70 、 料液比 1 20条件下提取 4次 , 每次提取时间 30m in, 蒲公英粗总黄酮的提取率为 17. 51%(以芦丁计 。最佳提取条件下 , 试验的相对标准偏差为 0. 41%, 说明 试验重复性非常好 。分析了蒲公英粗总黄酮对黑曲霉 、 宛氏拟青霉 、 酿酒酵母 和枯草杆菌的抑菌效果 。 结果表明 , 0. 43g/L的蒲公英总黄 酮对霉菌中的宛式

24、拟青霉和革兰氏阳性菌的典型菌种枯草杆 菌具有良好的抑菌作用 , 对真菌中的酿酒酵母具有一定的抑 菌作用 , 对黑曲霉没有抑菌作用 。可以考虑提高粗总黄酮的 加入量来进一步研究其对黑曲霉的抑菌效果 , 并有必要研究 蒲公英粗总黄酮对不同菌种的最低抑菌质量浓度 , 从而为开 发一种天然的抑菌剂奠定良好的基础 。参 考 文 献1 渊小春 , 魏希颖 , 张荣奎 , 等 . 两种培养基对蒲公英体外抑菌效果观察 J.陕西师范大学学报 :自然科学版 , 2004, 32(2 :97-100. 2 吕俊华 , 邱世翠 , 张连同 , 等 . 蒲公英体外抑菌作用研究 J .时珍国医国药 , 2002, 13(

25、4 :215-216. 3 刘华 , 吴国荣 , 孙晓明 , 等 . 不同生境下的蒲公英及其不同器官的分段提取物抑菌作用比较研究 J .中国野生植物资源 , 2001, 20(3 :37-38. 4 代红 , 李慧芬 , 王承务 . 蒲公英五种提取物的体外抑菌试验 J .首都医药 , 1999, 6(8 :32-33. 5 王立娟 . 桔皮总黄酮的提取条件 J .东北林业大学学报 , 2006,34(5 :70-72.(上接 42页 图 12 三聚氰胺聚乙烯醇改性脲醛树脂总反应结束时的 13C -NMR 谱图3 结论研究了脲醛树脂及其几种改性树脂不同反应阶段的化学 位移 , 并给出了它们的结构

26、变化 , 详细讨论了改性剂存在条件 下化学位移的变化规律及结构上存在的差异 。分析表明脲醛树脂和聚乙烯醇改性脲醛树脂存在相同的 反应特征和结构特征 , 比较脲醛树脂和聚乙烯醇改性脲醛树 脂 , 未发现聚乙烯醇参加反应的结构特征 。 因此 , 在本研究范 围内聚乙烯醇的改性作用不是化学上的 。三聚氰胺的改性作用在于 , 它不仅能与甲醛反应 , 而且能 与尿素甲醛发生共缩聚反应 , 使改性脲醛树脂既表现出三聚 氰胺甲醛树脂的特性 , 也表现出了不同于脲醛树脂的特性 。结构分析表明 , 在缩聚阶段除了有亚甲基化的反应外 , 还 存在着醚键的分解反应 。少量的醚键在反应结束后仍然存 在 , 这是人造板

27、在热压阶段或使用过程中仍存在甲醛释放的 原因之一 。通过对化学位移和化学结构的分析 , 说明通过分次加尿 工艺来降低脲醛树脂中的游离甲醛含量是合理的 , 游离尿素 其实并不存在 , 尿素主要以一取代脲和二取代脲的形式存在 , 这是树脂中游离甲醛含量降低的根本原因 。参 考 文 献1 T o mita B, Hse Chung -Yun . Analysis of cocondensati on of mela mineand urea thr ough f or maldehyde with carbon 13nuclear magnetic res o 2nance s pectr osco

28、pyJ.Mokuzai Gakkaishi, 1995, 41(3 :349-354.2 Tom ita B, H se Chung -Yun . Study of co -condensati on of mela 2m ine and urea with carbon 13enriched f or maldehyde by carbon 13nuclear magnetic res onance s pectr oscopyJ .Mokuzai Gakkaishi, 1995, 41(5 :490-497. 3 No B Young, Ki m Moon G . Syntheses an

29、d p r operties of l ow -levelmelam ine -modified urea -mela m ine -for maldehyde resins J .Journal of App lied Poly mer Science, 2004, 93(6 :2559-2569. 4 Sii m er K, Kaljuvee T, Christjans on P, et al . Changes in curing be 2havi our of am inoresins during st orageJ .Journal of Ther mal Anal 2ysis a

30、nd Cal ori m etry, 2005, 80(1 :123-130.5 Mercer A T, Pizzi A. A 13C -NMR analysis method f or MF andMUF resins strength and for maldehyde e m issi on fr om wood particle 2board . II . MF resins J .Journal of App lied Poly mer Science, 1996, 61(10 :1697-1702. 6 Ki m Moon G . Exa m inati on of selected synthesis para meters for typ i 2cal wood adhesive -type urea