试管婴儿胚胎实验室操作流程课件

胚胎培养及ICSI（含IVM）目录01辅助生殖技术介绍02传统IVF流程03ICSI04IVM辅助生殖技术介绍定义：一对健康夫妇在未采取避孕的前提下，经过一年的有规律的性生活，未能受孕，称为不孕。目前常用的助孕技术促排卵(OvulationInductionOI)宫腔内人工授精(IntrauterineInseminationIUI)体外授精--胚胎移植(InVitroFertilization-EmbryoTransferIVF-ET)

精子卵浆内注射(IntracytoplasmaSpermInjectionICSI)体外授精--胚胎移植(IVF-ET)

InVitroFertilization-EmbryoTransfer

就是活生生地把卵子和精子都弄到体外，搞上了之后过个3、5天放回子宫里头去IVF-ET

的操作程序降调节+刺激卵巢取卵(监测卵泡至发育成熟)体外受精(ICSI)胚胎移植（及妊娠检测）募集多个卵泡阶段一：卵巢刺激和监测阶段一：卵巢刺激和监测卵巢刺激的目的是通过对卵巢进行人为干预以期获得更多的成熟卵泡。相反，自然情况下，每个月只能得到一个优势卵泡。阶段二：卵母细胞收集卵母细胞收集通常是一个通过B超指导，经阴道的手术程序。此过程可以选择麻醉。阶段三：受精当获得成熟卵母细胞之后，随即将精子和卵母细胞在实验室为其提供的模拟女性生殖道的环境中进行共培养。阶段四：胞浆内单精子注射在ICSI程序中，通过使用显微操作设备将单一精子分离出来，随后注射进入卵母细胞的胞质内部。阶段五：胚胎移植胚胎移植是一个无痛手术过程，因此，可以不进行麻醉。通常会使用导管将3个以下的胚胎同时经阴道和子宫颈移植进入子宫腔。传统IVF流程Day-1:培养液准备，传统IVF准备用于取卵的培养液每例患者清洗准备2个培养皿和试管将添加蛋白的G-IVF™置于培养皿中，在CO2培养箱内过夜平衡加热8–10mL添加蛋白的G-MOPS™用于卵母细胞清洗（37℃且无CO2的培养箱内过夜平衡）在牢固密封好的试管内加热用于冲洗卵泡的G-MOPS™，如果需要，可以添加肝素（减少取卵过程中的血凝现象）将用于清洗取卵针和塑料器材的G-RINSE™置于CO2培养箱内过夜平衡Day0：取卵当天取卵：在这个过程中所用的冲洗液为预热的G-MOPS培养液（使用前确保温度在37℃）此时卵泡液有的是蛋白，所以用的是不加蛋白的G-MOPS卵泡抽取物应该收集到无菌无毒性的一次性组织培养用试管中，并立即由实验室进行检验卵母细胞的辨别：把取卵液移到空培养皿中，辨别卵母细胞，立即用预先冲洗过的无菌吸管将卵母细胞从卵泡液和可能存在的血液污染中取出预先冲洗无菌吸管应使用已添加蛋白的G-MOPS（捡出的卵子要洗个澡，精子才乐意同床，这会的卵子沐浴液就要用加蛋白的）在已添加蛋白的G-MOPS中冲洗后，然后再在平衡过的已添加蛋白的G-IVF冲洗（至少重复两次），然后把卵母细胞移送到装有平衡过的并添加蛋白的G-IVF培养皿中，然后立即放进培养箱中（37℃，6%CO2）

Day0：取卵当天Day0：取卵当天卵母细胞培养及受精体外受精：方法1：将卵母细胞转移至预平衡的中央孔培养皿内（皿内有含合适浓度精子的G-IVFTMPLUS），将中央孔培养皿置于+37℃，6%CO2

养箱内过夜。（注意此方法授精皿中精子浓度为75000-200000个/ml，避免精子浓度过高影响受精）

方法2：在含有卵母细胞的平衡过的培养皿中添加平衡过的精子悬浮液。此时加入约50ul处理后精子悬液（约5000-10000条精子）Day1：受精评估（加入精子后约15-20个小时）1.将卵母细胞转移至预热的G-MOPS

PLUS的培养皿内（在CO2培养箱外部的环境中将pH值维持在7.2-7.4之间）2.显微镜下观察记录原核、极体以及可能出现的胚泡（GV）的数目，只有正常受精的卵母细胞形成的胚胎（2PN）可以考虑用于胚胎培养和移植3.评估完成后，受精的卵母细胞应在数滴平衡过的已添加的G-1充分冲洗，然后在平衡过已经添加蛋白的G-1进行培养，最好封盖培养油。第二天：评估胚胎卵裂，换液备G-2TMPLUS第三天：评估胚胎卵裂

移植或冷冻保存。继续培养第四天：

转移胚胎至新鲜的G-2TMPLUS液滴中37℃，6%CO2过夜培养。第五天早晨：

评估胚胎卵裂以确定移植或冷冻保存ICSIICSI操作是把精子注射到卵母细胞中的过程。ICSI技术可以帮助因男方具有严重不育症而无法生育的夫妇实现成功妊娠ICSI操作前剥卵（去除卵母细胞附近的颗粒细胞）HYASE（透明质酸酶）可以促进卵丘颗粒细胞团和放射冠在HYASE中操作处理时间不可超过30秒，否则可能会损伤卵母细胞步奏：1.HYSAETM：使用前用G-MopsTMPlus稀释（1:10）2.制皿（两种方式，见下图）A.盖油液滴B.4孔或者5孔板a）HYSAETM溶液

b-f）G-MopsTMPlus3.使用大口径的吸管，将3~5枚卵母细胞放进稀释的HYASE中。轻轻吸打，不要超过30s4.将部分剥离的卵母细胞转移至第一冲洗液中，轻轻吹打每一个卵母细胞以除去放射冠，其余液滴中重复此项操作5.观察卵母细胞中是否有极体（有极体-M2；无极体-M1）成熟的M2，如果准备立即注射，置于ICSI液中如果还需要孵育一段时间的，可以将卵母细胞置于已添加蛋白的G-1中直到开始注射制备ICSI皿1.37℃预热已添加蛋白的G-MOPS以及OVOIL约15分钟2.取出ICSI液并且平衡到20±5℃3.快速制备ICSI皿，在培养皿中央位置添加一滴1-10μL的ICSI液滴，以及数个6-10μL（已加蛋白）G-MOPS液滴ICSI操作1.在ICSI液滴中间放入少量（1-2μL）准备好的精子悬液。在恒温台上平衡数分钟使得精子迁移到液滴中悬液的外围2.将剥离的卵母细胞置于已添加蛋白的G-MOPS液滴中，每液滴一个卵母细胞3.用显微注射针将精子的尾部压断以制动精子。实际操作过程中不要损伤精子颈部区域，其含有中心体。中心体在细胞分裂染色体迁移时非常重要。4.移动培养皿，使卵母细胞液滴处于视野内。使用固定针固定卵母细胞，以供注射（卵母细胞极体处于7点或1点钟方向）为减少对减数分裂中形成的纺锤体的损伤风险，须在4点钟位置注入精子。5.当完成所有卵母细胞的注射后，在数滴已添加蛋白的G-1中冲洗，然后置于准备好的G-1培养体系中过夜培养6.注射后的第二天，根据两个PN和两个极体的出现与否来判断卵母细胞的受精情况。退化的应终止培养。评估完成后，受精卵应用平衡的已添加蛋白的G-1冲洗，再转到已添加蛋白的G-1的新鲜培养皿中培养。内容IVM未成熟卵母细胞体外成熟（IVM）定义：“获取窦卵泡中的未成熟的颗粒细胞-卵母细胞复合体（COC），进行体外成熟”（左）控制性超促排卵后PCOM/PCOS患者卵巢；（右）未行促排卵治疗的PCOM/PCOS患者IVM技术主要针对卵子成熟障碍，即所有卵子均不能成熟，或者卵子成熟率低（<20%）的患者，如多囊卵巢综合征的患者、促性腺激素刺激高反应患者、卵巢低反应患者、需要生育力保存的女性肿瘤患者操作步奏：1.首先将抽取的血性卵泡液放在体视显微镜下观察拾卵（在60~100倍的体视显微镜下可以见到卵母细胞的发生泡GV，确定为GV期未成熟卵）2.用MOPS冲洗后