文章解读多位点取样测序揭示多发性骨髓瘤基因组空间异质性

文章解读多位点取样测序揭示多发性骨髓瘤基因组空间异质性在多发性骨髓瘤中，恶性浆细胞在骨髓内扩张。由于骨髓是充分灌注的，可以预期到恶性浆细胞的更优克隆的快速传播。然而，在医学成像却中经常观察到多发性骨髓瘤的不均衡分布。在本研究中，研究者对包括51例患者的髂骨活检和基于放射学引导取样的病灶标本进行多区域测序，以了解空间克隆的结构。超过75％的患者存在空间基因组异质性，其中包括CDKN2C和TP53的失活以及影响促分裂原活化蛋白激酶基因的突变。研究表明，空间异质性的程度与活检局部病灶的大小正相关，与晚期克隆的区域性生长一致。研究结果支持了多发性骨髓瘤在早期阶段进行克隆更替、晚期阶段进行区域进化的疾病进展模型。本研究提示多区域测序研究对于了解患者的异质性和多发性骨髓瘤的进展过程至关重要。文章题目：Spatialgenomicheterogeneityinmultiplemyelomarevealedbymulti-regionsequencing研究人员：来自阿肯色大学医学科学骨髓瘤研究所的研究人员发表时间：2017.08期刊名称：Nature

Communications影响因子：12.124研究背景多发性骨髓瘤（MM）是抗体分泌B细胞浆细胞（PC）的恶性进化物。MM不是一种单一的疾病，而是由一些以特定染色体变异为特征的分子亚型构成。与肿瘤进化相关的获得性基因组变异事件进一步导致患者间和患者自身内的克隆异质性，进而导致不同的临床结果。多发性骨髓瘤是一个特别有趣的模型系统，它的突变负荷位于常见的肿瘤突变范围之内——介于基因复杂的固体恶性肿瘤和分布在整个骨髓、较少受解剖限制、基因简单的白血病之间，因此可以借此深入了解癌症的分子进展。根据达尔文理论模型，顺序性的突变的获得可以使得克隆细胞更好地适应微环境，导致更优克隆的生长胜过先前占优势的克隆。与白血病类似，MM主要在骨髓中生长，因此推测多发性骨髓瘤可以通过外周循环在多个位点之间自由移动或者转移，该推测与使用流式细胞术在外周血中观察到少量骨髓瘤克隆细胞的实验结果相一致。基于流式细胞的观察结果，可以预期与实体癌症相反，多发性骨髓瘤在整个含骨髓的骨骼系统中快速和均匀地分布更优克隆。然而，对于多发性骨髓瘤而言，这一预期并未得到证实，事实上，正电子发射断层扫描（PET）的全身成像结果与疾病的不均衡分布一致。80％以上的新诊断患者只在有限区域内出现恶性肿瘤局部病灶；所谓局部病灶，常常呈现出弥漫性间质性生长模式。局部病灶的数量（平均每个患者18）预示肿瘤的进展。为了避免取样偏差，研究者的诊断取样方法包括由介入性放射引导的局部病灶取样和传统的髂骨活检。研究者开展应用来自临床的配对样本的基因组分析。通过对42个新诊断的和11个已经治疗过的多发性骨髓瘤患者多区域测序，研究者证实了大多数患者的空间层面的基因组异质性。此外，研究者表明空间异质性的程度与活检局部病灶大小正相关，符合晚期克隆的生长过程。研究者认为多区域测序对于了解患者内部的异质性和多发性骨髓瘤的进化过程至关重要。研究方法样本选择：对42例新诊断的可获得DNA的患者随机采集的髂嵴诊断样本（RNAS）和CT引导的细针抽吸物（FNAS）进行空间基因组分析（图

1）。研究治疗对空间异质性的影响使用来自11名患者的样品进行分析，其中两名患者也在新诊断患者组中（图

1）。位点特异性高风险克隆的预后影响研究使用了263名患者的配对的RNAS/FNASGEP70数据。研究成果图1染色体臂层面的异质性研究者使用高分辨率单核苷酸多态性（SNP）微阵列和全外显子（WES）数据来检测拷贝数变异（CNA）。为了说明这种方法对亚克隆检测的灵敏度（阈值：~20％），研究者只使用以克隆的方式起码出现在配对样品当中的一个的拷贝数变异。基于这一策略，研究者发现在42例新诊断的患者中有17（40％）例染色体景观存在空间异质，就平均而言，每个样本有三个不共有的拷贝数变异（范围在1-28之间，图2a）。研究者们还发现所有的常用预后指标在其样本中都出现空间异质。关键的不良预后指标del（17p）在6例患者中有2例（33％）显示空间异质；其次是MYC基因座（t（MYC））的易位，16例患者中有4例（25％）携带这种易位（图2a）。尽管1p的删除缺失和1q21的扩增，与进展相关的重要变化经常在不同的空间位置之间共有，但在21位患者中有4位（19％），呈现出局部变异特性（图2a）。有趣的是，杂合性缺失（LOH），例如1q的杂合性缺失，往往导致空间异质性，并且在9名患者（21％，补充数据2）中是普遍存在的。染色体1和4的变化是空间异质性最常见的贡献者（n=7），其次是染色体5和8个（n=6），包括缺失，扩增和杂合性缺失LOH。突变水平上的异质性研究者对非沉默SNV和Indel进行了综合分析，其中不普遍但可检测的突变被归类为“非共有”(Unshared)。普遍存在的突变，在配对样本之间的癌细胞克隆比例（CCF）至少有三倍差异的，也称为共有异质（“shared-diff”）。研究者将这些共有异质变异也归类为异质性突变，因为它们位点之间的克隆结构非常的不一致。突变分析的表明，空间层面的基因组异质性比在CNA水平上看到的更显著（图2c）。在新诊断的患者中分别有32例（76％）和30例（71％）发现非共有和共有异质突变，所有CAN差异患者也在突变水平上表现出异质性。值得注意的是，异质性突变的比例在患者之间差异也很大：有三个患者显示>50％的非共有突变，另外三个的患者没有显示任何可检测的基因组异质性。每个患者的非沉默突变总数（中位数为50，范围：19-435，图2b）与未共有和共有异质突变的比例没有显著相关性（Spearman秩相关ρ=0.3（P=0.055）和ρ=0（P=1））。治疗与空间异质性联合药物化疗（如全面疗法（TT））的治疗目标，是增加药物反应的深度和根除残留的耐药性克隆。因此，对于最初的对药物有响应的患者，研究者预计复发癌是由高强度药物筛选之后所遗留下来的数量有限的克隆所组成，从而导致空间异质性降低。为了验证这个假设，研究者分析了一组在MM治疗的不同阶段严重治疗的患者（图1）。所有患者均在1号染色体上呈现不良预后标记，除2例外均有MAPK通路基因突变，表明治疗有较强的选择压力（图2d）。然而，研究者仍然观察到1q的持续事件，导致这个区域在两个患者的特定部位进一步扩增（分别为5VS4和4VS3拷贝），RB1的区域限制性双等位基因失活，以及具有由NRAS和KRAS突变定义的两个空间分离的显性克隆的情况（图2a，d）。染色体和突变水平的异质性平均水平没有显著偏离新诊断患者的相应值（Wilcoxon检验，P>0.05）。总之，这些结果表明，克隆的选择性和治疗的选择性压力与进一步的肿瘤局部进化有关。图2位点特异性的高风险克隆驱动肿瘤进展基于包括荧光原位杂交和基因表达谱（GEP）数据在内的风险分层已成为多发性骨髓瘤常规诊断的一个组成部分，可用于指导临床治疗。在所分析的一组患者中，25％（13例）显示不同部位之间GEP70风险状态的差异，比如，1号病人（图3a）。在这种情况下，在髂骨处的显性GEP70低风险克隆具有HRD核型，并且还包含位点特异性t（MYC）和BRAFV600E突变。重要的是，与髂骨克隆形成对比，L4上的优势克隆是GEP70高风险相关的，伴随着超高风险的TP53双等位基因缺失和涉及染色体臂1p的不良事件。通过靶向测序（654×）确认了L4处BRAF缺失突变。在这种情况下，基于单独评估髂嵴标本的诊断方法会错误地将该患者归类为GEP70低风险组，如果对BRAFV600E使用靶向治疗方法，则将在GEP70高风险癌症部位失败。为了解这一概念的临床意义并阐明位点特异的高危克隆的预后影响，研究者额外分析了的263名患者。这些病例具有成对的髂骨取样样本和计算机断层扫描（CT）辅助的局灶病灶抽吸物的GEP70风险评分。该系列的中位随访时间为4.8年，13％（34名患者，仅局部病灶类风险高的20名）具有不一致的GEP70评分。生存分析显示GEP70高危的克隆的非均匀分布情况的结果很差，这与存在两个位点部位的GEP70高风险患者（28例）的结果相似（Cox模型，P=0.2，Fig.3b）。这一结果表明，高风险亚克隆即使不是普遍分布也能驱动疾病预后恶化。局部病灶大小与肿瘤区域生长优势研究者探索是否可以使用其他疾病特征预测空间异质性。多重检验校正后的分析显示，在新诊断的患者中，包括国际分期系统（ISS）25、基因组倍性、高风险细胞遗传学和髂骨部位的GEP70风险状态在内的标准临床和分子特征均未与空间异质性有着显著性相关（线性回归和Wilcoxon检验，P>0.05）。在较高的国际分期阶段和在涉及1p缺失的髂骨部位，共有异质突变的比例较低。当将全身影像资料纳入分析时，研究者发现活检局部病灶的最大尺寸与未共有突变的比例之间存在高度显著的正相关（Spearman相关性ρ=0.62，P<0.001）。利用局部病灶最大尺寸作为异质性预测因子，并将1cm和2.5cm肿瘤直径作为分组截断值，得到三种分组，对应着越来越高的非共有突变数量。总结上述，既不是局部病灶的总数，也不是研究位点之间的解剖距离与空间异质性相关。此外，以不同亚克隆成分（共有异质型）为特征的空间异质性不能通过任何基于图像的参数来预测（p>0.05）。0.001）。利用局部病灶最大尺寸作为异质性预测因子，并将1cm和2.5cm肿瘤直径作为分组截断值，得到三种分组，对应着越来越高的非共有突变数量。总结上述，既不是局部病灶的总数，也不是研究位点之间的解剖距离与空间异质性相关。此外，以不同亚克隆成分（共有异质型）为特征的空间异质性不能通过任何基于图像的参数来预测（p>图3疾病发展过程中的多区域进化事件为了阐明单个局部病灶的基因组景观轮廓是否可以代表同一患者的其他局部病灶，研究者研究了四个含有大局部病灶（>2.5cm）的患者不同克隆部位之间的系统发育关系。为了说明“主要”事件和“分支”事件，研究者集中讨论克隆畸变。这一分析的结果清楚地表明了多发性骨髓瘤进化过程的复杂性（图4）。在12号患者中，被分类为GEP70高风险的四个局部病灶呈现出非常相似的基因组谱，共同出现了CDKN2C，扩增（1q）和删除缺失（17p13）的高风险染色体双等位基因缺失（图4a）。在GEP70低风险克隆中未发现这些事件。这个分析的结果表明这些局部病灶有一个共同的高风险祖先。其他的样本也同样呈现出不一样的进化关系，涉及到的一些关键性基因可以在图4中查看。图4骨髓瘤的非中性进化上面描述的肿瘤进化模式强烈地表明了非中性演化。在此，引入一个区分克隆选择与中性进化的数学模型。该模型利用变异等位基因频率（VAF）边界的亚克隆突变来提供肿瘤生长动力学信息。研究者将这个模型应用在来自于新诊断患者突变数据上，以确定多发性骨髓瘤主要进化类型。在99个样品中，有62个样品由于少于12个突变处于指定的VAF边界内（补充数据5），因此没有被当作中性生长。其余37个样本没有呈现中性生长的VAF分布特征（R2≥0.98，在补充图9中显示了两个例子）。进一步的克隆性分析显示，在25个异质性突变的患者中，不同的克隆在不同位点占优势，进一步表明多发性骨髓瘤是克隆选择而不是中性进化生长模式。讨论该多区域取样基因组分析是第一个描述多发性骨髓瘤空间异质性的系统研究。到目前为止，多发性骨髓瘤被认为是一种适用达尔文进化理论，更优克隆选择性替代先前的不适合亚克隆，并进一步扩散的肿瘤。最近，在实体实体瘤领域中引入了替代进化模型，为解释空间异质性提供了新的方法。癌症生长的确可以是中性的，突变的分布由它们出现的时间点决定，而不是由它们内在的适应性优势决定。使用数学模型预测中性进化动力学，三分之一的癌症显示了这种中性类型的进化。然而，这项研究的结果使科学家将多发性骨髓瘤归为凭借非中性克隆进化在克隆群体内形成竞争力，并且适应微环境的恶性肿瘤类属。支持非中性进化的证据包括：（1）特定位点的驱动性突变是一种常见的现象，但这在中性进化系统中是不常见的，毕竟突变的分布由其时间点决定，中性进化系统中关键驱动突变通常是多点共有的事件；（2）没有观察到肿瘤遵循在中性进化中才会出现的中性生长模式幂律分布；（3）异质性突变常常具有较高的亚克隆百分比（CCF≥0.8），该现象支持不同位点富集特定克隆的模型；（4）非共有突变和拷贝数变异程度与局部病灶的大小呈现正相关性，这与非共有突变和异质化拷贝数变异驱动病灶生长一致。图5因此，克隆竞争是多局部病灶患者肿瘤空间异质性增加的最可能的解释。浆细胞生物学的一个重要特性就是长期生存浆细胞和新浆母细胞为了有限的骨髓空间存活生态位的竞争，竞争失败一方将会凋亡。这种对骨髓空间微环境的依赖性通常也适用于恶性浆细胞，另外一点，浆细胞通常不能在体外存活。在不同骨髓空间已经被高级克隆占据的情况下，额外的竞争性克隆的适应水平需要更先进才能实现转移侵染和克隆替换。因此，在疾病的后期阶段，当几乎所有的生态位被占据，区域限制性的进化将会出现，而不是后来克隆清扫替换先前克隆，也就是说由于后来克隆无法做到拥有绝对优势清扫替换已有克隆，只好多种克隆在有限的生态位同时生存。这种现象通过在四个不同的地点对四个不同的显性克隆的描述来突出。研究者认为，与中性的“大爆炸”进化模型类比，在成功入侵某一位点之后替换该肿瘤位点已有的优势克隆的困难可能仅仅是类似于区域性