凝胶电泳技术

第五章分子生物学

研究法重组DNA技术发展史上的重大事件

1869FMiescher首次从莱茵河鲑鱼精子中分离DNA。1944O.T.Avery证实DNA是遗传物质。1952A.D.Hershey和M.Chase再次证实和噬菌体的遗传物质是DNA。

1953J.D.Watson和F.H.C.Crick提出DNA分子结构的双螺旋模型。M.Wilkins用X-射线衍射法证实了这一结构。1957A.Kornberg从大肠杆菌中发现了DNA聚合酶I。1958Meselson和Stahl提出了DNA的半保留复制模型。1959-1960S.Ochoa发现RNA聚合酶和mRNA，并证明mRNA决定了蛋白质分子中的氨基酸序列。1961Nirenberg破译了第一相遗传密码；Jacob和Monod提出了调节基因表达的操纵子模型。1964Yanofsky和Brenner等人证明，多肽链上的氨基酸序列与该基因中的核苷酸序列存在着共线性关系。1965Holley完成了酵母丙氨酸tRNA的全序列测定；科学家证明细菌的抗药性通常由"质粒"DNA所决定。

1966Nirenberg，Ochoa、Khorana、Crick等人破译了全部遗传密码。1970Smith，Wilcox和Kelley分离了第一种限制性核酸内切酶。Temin和Baltimore从RNA肿瘤病毒中发现反转录酶。1972-1973Boyer，Berg等人发展了DNA重组技术，于72年获得第一个重组DNA分子，73年完成第一例细菌基因克隆。1975-1977Sanger与Maxam、Gilbert等人发明了DNA序列测定技术。1977年完成了全长5387bp的噬菌体φ174基因组测定。1978首次在大肠杆菌中生产由人工合成基因表达的人脑激素和人胰岛素。1980美国联邦最高法院裁定微生物基因工程可以专利化。1981Palmiter和Brinster获得转基因小鼠；Spradling和Rubin得到转基因果蝇。1982美、英批准使用第一例基因工程药物--胰岛素；Sanger等人完成了入噬菌体48,502bp全序列测定。1983获得第一例转基因植物。1984斯坦福大学获得关于重组DNA的专利。1988Watson出任“人类基因组计划”首席科学家1989DuPont公司获得转肿瘤基因小鼠--Oncomouse

1992欧共体35个实验室联合完成酵母第三染色体全序列测定(315kb)1994第一批基因工程西红柿在美国上市。1996完成了酵母基因组(1.25×107bp)全序列测定。1997英国爱丁堡罗斯林研究所获得克隆羊。DNA提取方法

选材真核生物基因组DNA非常庞大，含有大量重复序列，使分离相应靶基因很困难。从不同的生物材料中提取DNA用于研究DNA分子在生命代谢中的作用，由于DNA分子在生物体内的分布及含量不同，要选择适当的材料提取DNA。

动植物中，小牛胸腺、动物肝脏、鱼类精子、植物种子的胚中都含有丰富的DNA。cDNA不含重复序列，通过特异探针筛选cDNA文库，可以较快地分离到相关基因。微生物中，谷氨酸菌体含7%~10%，面包酵母含4%，啤酒酵母含6%，大肠肝菌含9%~10%。从各种材料中提取DNA方法不同，分离提取的难易程度也不同。

低等生物，如从病毒中提取DNA比较容易，多数病毒DNA分子量较小，提取时易保持其结构完整性。细菌及高等动植物中提取DNA难度大一些。细菌DNA分子量较大，，因此易被机械张力剪断。细菌DNA，除核DNA外，还有质粒DNA等。

1、核酸的理化性质RNA和核苷酸的纯品都呈白色粉末或结晶，DNA则为白色类似石棉样的纤维状物。除肌苷酸、鸟苷酸具有鲜味外，核酸和核苷酸大都呈酸味。DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水，RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L。DNA在水中为10g/L，呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。天然状态的DNA是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。要从细胞中提取DNA时，先把DNP抽提出来，再把Pro除去，再除去细胞中的糖，RNA及无机离子等，从中分离DNA。DNP和RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响不同DNP在低浓度盐溶液中，几乎不溶解，如在0.14mol/L的氯化钠溶解度最低，仅为在水中溶解度的1%，随着盐浓度的增加溶解度也增加，至1mol/L氯化钠中的溶解度很大，比纯水高2倍。RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小，在0.14mol/L氯化钠中溶解度较大。因此，在提取时，常用此法分离这两种核蛋白。2.细胞的破碎细菌有坚硬的细胞壁，首先要破碎经胞。方法有三种：①机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法；②化学试剂法：用SDS处理细胞；

③酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶，都可使细胞壁破碎。高等动物DNA提取的两个困难①破碎细胞难:从处死动物、取组织器官到破碎细胞费时长。在此期间DNA可能会被DNase降解，而动物组织，特别是肌肉组织很难破碎，即使是较易破碎的肝、肾组织也往往使用组织匀浆器，易造成DNA断裂。

②分子量大，一般比细菌的大2—3个数量级，比病毒的大4—5个数量。对不同生物材料，要根据具体情况选择适当的分离提取方法。

3.DNA提取的几种方法(1)浓盐法

利用RNP和DNP在电解溶液中溶解度不同，将二者分离，常用的方法是用1M氯化钠抽提，得到的DNP粘液与氯仿一起摇荡，再离心除去蛋白质，此时蛋白质停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中，用2倍体积90%乙醇可将DNA钠盐沉淀出来。

以稀盐酸溶液提取DNA时，加入适量去污剂，如SDS可有助于蛋白质与DNA的分离。在提取过程中为抑制组织中的DNase对DNA的降解作用，在氯化钠溶液中加入柠檬酸钠作为金属离子的烙合剂。通常用0.15MNacl，0.015M柠檬钠，并称SSC溶液，提取DNA.两种方法比较，后种方法使核酸降解可能少一些。

（2）阴离子去污剂法:

用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性，可以直接从生物材料中提取DNA，由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合，阴离子去污剂能够破坏这种价键，所以常用阴离子去污剂提取DNA。

（3）苯酚抽提法:苯酚作为蛋白变性剂，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA。此时DNA是十分粘稠的物质，可用玻璃慢慢绕成一团，取出。此法的特点是使提取的DNA保持天然状态。

RNA的提取

细胞总RNA一个细胞总RNA包括mRNA,rRNA,tRNA和snRNA，80～85％rRNA，15～20％tRNA和snRNA。它们具有确定的大小和核苷酸序列。mRNA占总RNA的1～5％。rRNA电泳产生3条特征性条带28S，18S和5S，用来鉴定RNA纯度和完整性。由于mRNA代表了基因表达的水平，因此mRNA的分离、定量和检测极为重要。RNA和无RNA酶的环境

应用RNA对细胞和分子生物学的各个方面进行研究非常普遍。RNA存在于从简单的逆转录病毒到哺乳动物细胞的所有的生命形式之中。由于当前没有一种方法能够直接扩增RNA，因此，RNA的分离通常是决定实验结果质量的第一步，也是关键的一步。

提取RNA过程中防止RNA酶的污染所采取的步骤处理RNA样品时必需仔细小心，其程度取决于样品的用途和来源。由于RNA酶存在于所有的生物中并且能够抵抗诸如煮沸这样的物理破坏，因此建立一个无RNA酶的环境对于制备优质RNA很重要。方案：

1）工作区域应与进行普通微生物实验的区域分离，特别是那些用于细菌接种、培养基和试剂配制的区域，那些培养基和试剂用于从细菌和动物细胞中进行DNA的制备和操作，这些区域富含RNA酶。

2）如有可能，使用标有“无RNA酶”的商品试管、吸头、溶液和水。通常新的无菌处理过的塑料试管和吸管无RNA酶。

3）双蒸水(ddH2O)和溶液应该用RNA酶的抑制剂DEPC(焦碳酸二乙酯)进行处理：每100mL溶液或水中加入0.1mLDEPC原液，放在摇床上充分混匀并在37℃下作用数小时。然后将溶液高压灭菌15min使DEPC失活。4)用分子级的试剂和DEPC处理过的水配制的溶液通常没有RNA酶。5)分离RNA以前，将一些实验室玻璃制品置于烤箱在300℃烘烤4h以灭活核酶。如有可能，将其他设备也灭菌处理。从组织中提取RNA则要注意：

动物器官的解剖器械存放组织块的玻璃器皿冻存组织块所用的器皿组织器官的冲洗液人汗含有RNA酶，故在所有步骤中均应戴手套并经常更换。记住我们的周围环境含有大量的微生物和气雾，它们来自吸液操作或来自我们自己的呼吸。这些可能造成RNA酶的污染一些组织像脾脏可能比其它组织含有更多的RNA酶。细菌比哺乳动物细胞中有更多的RNA酶。因此从这些细胞中制备RNA应采取更严格的预防措施。分离后的RNA通过琼脂糖凝胶电泳再经溴化乙锭染色后便可检查其是否完整。rRNA(18s和28s)条带模糊可能表明由RNA酶引起的RNA的降解。

一步法分离RNATripurereagent是一种用于RNA分离的商品溶液。它更便于使用并且结果更加可靠。对于来源有限的样品，推荐使用这种试剂。这种试剂能从同一样品中同时分离RNA,DNA,蛋白质。

方案．用lmL

Tripure／50－100mg(组织)匀浆组织样品。对于细胞、每10cm2面积(贴壁的单层细胞)或每106个细胞(细胞沉淀)使用1mL。将样品转至1.5mLEP管中。(-70℃可保存1月)

室温下放置样品5min。每1mLTripure中加入0.2mL氯仿并摇动15s，置于室温下2—15min。RNA分子敏感又脆弱难以扩增，为了研究mRNA的信息，常将其反转录为cDNA，再扩增为双链，并插入到自我复制的载体上。一个高质量的cDNA文库代表了生物体某一器官或组织mRNA中所含有的全部或绝大部分遗传信息。Trizol法抽提总RNA（异硫氰酸胍－苯酚抽提法）Trizol可迅速破坏细胞结构，使存在于细胞质及核内的RNA释放出来，并使核糖体蛋白与RNA分子分离，还能保证RNA的完整性。提取首先用液氮研磨材料，加入Trizol液，进一步破碎细胞；加入氯仿抽提，离心，分离水相和有机相，收集含有RNA的水相，异丙醇沉淀，获得较纯的总RNA。硅胶膜纯化柱法将含有目的RNA的细胞破碎液通过该硅胶柱时，RNA吸附在硅胶膜上，从而与其他成分分开，在低盐浓度下可从硅胶膜上直接洗脱RNA，方法简单、纯度高。RNA纯度、浓度检测RNA呈单链状态，易形成二级结构，也易降解，因此RNA电泳是在变性条件下进行的，可用甲醛、加热或尿素变性。电泳后如果rRNA大小完整且28SrRNA和18SrRNA亮度接近2:1，mRNA分布均匀，则RNA质量好。RNA的检测：

将样品稀释液于三处波长处读取OD值。记录OD值，通过计算确定RNA浓度或纯度。公式如下对于ssDNA：[ssDNA]＝33×(OD260-OD310)×稀释倍数

对于dsDNA：[dsDNA]＝50×(OD260—OD310)×稀释倍数对于ssRNA：[ssRNA]＝40×(OD260一OD310)×稀释倍数以上浓度单位为ug／mL.注意事项

1)OD310值是背景，若盐浓度较高，OD310值也高。

2)OD260／OD280对DNA而言其值大约为1.8。

3)OD260／OD280。对RNA而言其值大约为2.0。小结所有可能与RNA接触的器材均得用DEPC处理。操作过程中应带口罩，手套。DEPC有致癌之可能，尽量避免接触皮肤提取的RNA应尽早逆转录成 cDNA.mRNA的纯化纤维素柱色谱法真核细胞mRNA具有5’端帽子结构—m7G和3’端的polyA尾巴，因此用寡聚（dT）－纤维素柱色谱法获得高纯度mRNA。利用mRNA3’端含有polyA的特点，当RNA流经寡聚dT柱时，在高盐液作用下，mRNA特异结合在柱上，再用低盐溶液或蒸馏水洗脱mRNA。经过两次柱子后可得到较高纯度mRNA。PolyA－TTractmRNA分离系统将生物素标记的寡聚dT引物与细胞总RNA温育，加入与微磁球相连的抗生物素蛋白以结合polyAmRNA，通过磁场吸附作用将polyAmRNA从总RNA中分离。cDNA的合成合成过程包括第一和第二链cDNA的合成。第一链cDNA的合成是以mRNA为模板，反转录成cDNA，由反转录酶催化，该酶合成DNA时需要引物引导，常用的引物是oligo

dT。Oligo

dT引物一般包含12～20个dTTP，后面加一个连接引物（通常为酶切位点）以便于克隆构建。在cDNA合成的过程中，应选用活性较高的的反转录酶及甲基化dCTP，cDNA两端应加上不同内切酶识别接头，保证cDNA双链的方向性。反应体系中一般加入甲基化dCTP，保证新合成的cDNA链被甲基化修饰，以防止构建克隆时被限制性内切酶切割。第二链cDNA的合成是以第一链为模板，由DNA聚合酶催化。常用RNAaseH切割mRNA－cDNA杂合链中的mRNA序列，所产生的小片段为引物合成第二链cDNA，在通过DNA连接酶连成完整DNA链。再加入含有另一个酶切位点的黏性接头（如EcoR1），与cDNA连接后用Xho1酶切，使cDNA双链5’端和3’端分别具有不同黏性末端，保证它与载体相连的方向性。cDNA文库的构建载体由于cDNA的长度一般在0.5~8kb，常用的质粒载体和噬菌体载体都能满足要求。cDNA文库的载体要根据该文库的用途选择。Uni-zapXR载体：是一种λ噬菌体载体，具备噬菌体的高效性和质粒载体系统可利用蓝白斑筛选的便利，可容纳0～10kbDNA片段。该载体内部含有pBluescript载体的全部序列，重组后可通过体内剪切反应cDNA插入片段转移到质粒系统中进行筛选、克隆和序列分析。包装含有cDNA插入片段的重组噬菌体只有经过体外蛋白外壳包装反应，才能成为有侵染和复制能力的成熟噬菌体。包装反应的条件要求很精确，DNA和蛋白的浓度。两者体积比、反应温度及时间对包装效果都有很大影响，而包装反应结果的好坏对重组噬菌体的侵染能力有重要影响。侵染用经包装的噬菌体感染大肠杆菌培养物后涂布在琼脂平板上，会产生成千上万个独立噬菌斑，每个噬菌斑由一个重组噬菌体分子形成。一个比较完整的cDNA文库常包含大于5×105的独立克隆。一旦获得含有某种组织器官cDNA信息的噬菌体文库，就可用于筛选目的基因、大规模测序、基因芯片杂交等功能基因组学研究。基因文库的筛选基因文库的筛选是指通过某种特殊方法从基因文库中鉴定出含有所需重组DNA分子的特定克隆的过程。方法包括：核酸杂交法、PCR筛选法和免疫筛选法等。1、核酸杂交法用放射性标记的特异DNA探针适用于高密度的菌落杂交筛选。将一张圆形硝酸纤维素膜放在一个装有琼脂培养基的培养皿表面，将待筛选菌落从其生长的平板上转移到硝酸纤维素膜上，进行适当温育。同时保留原来的菌落平板作对照。取出已经长有菌落的膜，用碱液处理，使菌落发生裂解，DNA随之变性。接着用蛋白酶k处理硝酸纤维素膜去除蛋白，形成菌落DNA印迹。80℃烘烤滤膜，将DNA固定在膜上。将滤膜与放射性标记的DNA或RNA探针杂交，通过放射自显影显示杂交结果。在X线片上显黑色斑点的就是实验中寻找的目的克隆，可以通过对应于平板上的位置找到相应克隆。2、PCR筛选法当已知足够的序列信息并获得基因特异性引物，可采用此技术。要从一个基因组DNA文库筛选目的基因，首先将整个文库（质粒形式或细菌形式均可）保存在多孔培养板上，用设计好的目的基因探针对每个孔进行PCR筛选，鉴定出阳性的孔，把每个阳性孔中的克隆再稀释到次级多孔板中进行PCR筛选。重复以上程序，直到鉴定出与目的基因对应的单个克隆为止。基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)cDNA文库(cDNAlibrary)

基因文库(genelibrary)是指一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体。基因组DNA文库疾病相关基因的克隆与鉴定

CloningandIdentificationofDiseaseRelativeGenes克隆疾病相关基因的策略（一）功能性克隆(functionalcloning)（二）定位克隆(positionalcloning)（三）非定位候选基因克隆策略(position-independentcandidategeneapproaches)（四）定位候选基因克隆策略(positionalcandidategeneapproaches)定义

从对一种致病基因的功能出发，克隆该致病基因。（一）功能性克隆应用

生化机制已明确、基因表达产物较易得到的遗传性疾病。克隆方式

①利用特异性抗体筛选表达型cDNA文库；②根据已知的部分氨基酸序列合成寡核苷酸作探针，筛选cDNA文库。（二）定位克隆定义从一种致病基因的染色体定位出发逐步缩小范围，最后克隆该基因。系统的定位克隆工作①

遗传学分析(确定致病基因染色体定位)交换分析、连锁不平衡分析②分子生物学分析染色体异常(缺失、易位等)分析、基因文库的筛选与基因克隆（三）非定位候选基因克隆策略由于基因组作图的完成和分子病理学的发展，人们可以不依靠染色体定位，直接根据病理学变化和对各种基因产物功能的了解，预测出候选致病基因。（四）定位候选基因克隆策略当致病基因的染色体定位确认后，人们可以利用因特网上的基因网站所提供基因序列数据，鉴定出候选致病基因。一、核酸的凝胶电泳

核酸凝胶电泳是分子克隆核心技术之一，用于分离、鉴定和纯化DNA或RNA片段；

优点：（1）便于分离;（2）便于检测;（3）便于回收。将某种分子放到特定的电场中，它就会以一定的速度向适当的电极移动。某物质在电场作用下的迁移速度叫作电泳的速率，它与电场强度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正比，而与分子的磨擦系数成反比（分子大小、极性、介质的粘度系数等）。（一）核酸电泳原理在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化的，所以，DNA和RNA实际上呈多聚阴离子状态（Polyanions）。将DNA、RNA放到电场中，它就会由负极→正极移动。由于在电泳中往往使用无反应活性的稳定的支持介质，电泳迁移率（或迁移速度）与分子的摩擦系数成反比。而摩擦系数是分子大小、介质粘度等的函数。在同一凝胶中、一定电场强度下、分离出不同分子量大小或相同分子量但构型有差异的核酸分子。在凝胶电泳中，一般加入溴化乙锭（ethidiumbromide，EB）染色，此时，核酸分子在紫外光下发出荧光，肉眼能看到约50ngDNA所形成的条带。AgaroseGelElectrophoresis+_SampleWell25ng1kbladder0.8%AgaroseAgaroseGelElectrophoresisEtBrDetectionLimit:~5-10ngDNA124SeparationRangeVs.%AgaroseLowGeling

Agarose4-6 0.02-0.4

1DNA分子的大小

双链DNA分子迁移的速率与其碱基对数的常用对数近似成反比；

2琼脂糖浓度浓度越低，相同核酸分子迁移越快；

3DNA的构象

一般同一分子：超螺旋环状＞线状＞切口环状。

4凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭

溴化乙锭（EB）插入双链DNA造成其负电荷减少、刚性和长度增加。（二）DNA的迁移速率决定因素

5所用的电压低电压时DNA片段迁移率与所用的电压成正比。

6琼脂糖种类常见的有两种：标准琼脂糖和低熔点琼脂糖；（三）常用电泳缓冲液比较

1）TAE的缓冲容量最低，如长时间电泳会被消耗，此时凝胶的阳极一侧将发生酸性化；2）TBE和TPE比TAE花费稍贵，但有高得多的缓冲容量；3）双链线状DNA片段在TAE中比在TBE或TPE中迁移快10%；4）对于高分子质量的DNA，TAE的分辨率略高于TBE或TPE，对于低分子质量的DNA，TAE要差些。超螺旋DNA在TAE中的电泳分辨率要好于TBE。（四）凝胶载样缓冲液载样缓冲液：临上样到凝胶加样孔之前与待电泳的样品相混合的一种缓冲液。载样缓冲液有三个作用：1）增加样品密度保证DNA沉入加样孔内；2）使样品带有颜色便于简化上样过程；3）其中的染料在电场中以可以预测的泳动速率向阳极迁移。6×凝胶载样缓冲液类型6×缓冲液贮存温度I0.25%溴酚蓝4℃0.25%二甲苯氰FF40%(m/V)蔗糖水溶液II0.25%溴酚蓝室温0.25%二甲苯氰FF15%Ficoll(Type400)水溶液III0.25%溴酚蓝4℃0.25%二甲苯氰FF30%甘油水溶液IV0.25%溴酚蓝4℃40%(m/V)蔗糖水溶液1、稳定电压首先将电压的准确数值输进去，其它电流或功率值要高于正常工作值，否则电压不能恒定。例如：恒定电压为200V预设电流(100mA,工作电流+30mA)通常1V电压≈0.35mA工作电流，200V电压预计工作电流为70mA，电流再向上加30mA=100mA预设功率值（20W）：用电压值除以10倍即200V÷10≈20W实际工作电功率=工作电压（V）×工作电流（A）

=200V×0.03A=6W（五）电泳仪参数设定操作方法电泳仪参数设定操作方法2、稳定电流首先将电流的准确数值输进去，其它电压或功率值要高于正常工作值，否则电流不能恒定。3、恒定功率首先将功率的准确数字输进去，其它电压电流值要高于正常工作值,否则功率不能恒定。例如，恒功率10—30W时电流150mA电压1000V40W以上时电流200mA(或设最高值400mA)电压1500V设定好各项恒定值后，一按启动键，实际电流，电压，电功率值显示出来，黑色光标闪烁处为恒定的数值。注:五型电泳仪恒压之前,先要把电流的指针开到最大,反之恒流时,要把电压指针开到最大.（六）琼脂糖凝胶中DNA的检测通过染色,紫外灯下检测。

主要有溴化乙锭（ethidiumbromide,EB）染色法和SYBRGold染色法。电泳照片使用EB染色注意事项（1）EB被认为是一种强致癌物质（2）EB可用来检测单链或双链核酸（3）EB使用时的配制、贮存及使用

EB常用水配制成10mg/ml的贮存液，于室温保存在棕色瓶或用铝箔包裹的瓶中，使用终浓度为0.5μg/ml（4）当要知道DNA片段准确大小时，凝胶应在无EB情况下电泳，电泳结束后再用EB染色。凝胶SYBRGold的染色SYBRGold是一种新型极敏感染料的商品名称。其与DNA结合的亲和力高，并且结合后，能够极大增强荧光信号。GoldViewTMDNA染料（溴化乙锭的替代品）

GoldView

是一种可代替溴化乙锭（EB）的新型DNA染料，使用方法与之完全相同，在100ml琼脂糖溶液中加入5ulGoldView即可。在紫外灯下双链DNA呈现绿色荧光，而单链DNA呈现红色荧光。λDNA（EcolⅠ,HindⅢ双酶切）用无毒染料(GoldViewTMDNA)所做的实验结果GoldView无毒荧光染料实验结果RAPD—PCR扩增用制胶器灌胶，插梳子上样凝胶中DNA的成像可以用透射或入射紫外光对EB染色的凝胶成像，图像可以直接输出到计算机观察。二、聚丙烯酰胺凝胶电泳

polyacrylamidegelelectrophoresis

PAGE在TEMED(四甲基乙二胺)催化过硫酸铵还原产生的自由基的存在下，