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35DB35/T1992—2021番鸭细小病毒和鹅细小病毒双重实时荧光定量PCR鉴别诊断技术Diagnostictechniqueofduplexreal-timefluorescentPCRforthedetectionofmuscovyduckparvovirusandgooseparvovirus福建省市场监督管理局发布I 8 91本文件规定了鉴别检测番鸭细小病毒（Muscovyduckparvovirus,MDPV）和鹅细小病毒（Gooseparvovirus，GPV）双重实时荧光定量聚合NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运融解（解链）温度meltingtemp核酸加热变性过程中，紫外光吸收值达到最大值的50%时的温度称为核酸的解链温度，并在PCR反应体系中加入过量双链嵌合荧光染料，荧光染料非特异性地掺入脱氧核糖核酸通过重新加热扩增产物（反应温度逐渐升高使结合了荧光染料分子的双链DNA解离或“融解”链DNA，荧光强度发生显著变化，形成一幅融解曲线图。由于上述两个特异性片段的Tm值不同，造成不同的PCR产物融解曲线特性不一样（出现峰值所对应的温度不同），通过分析扩增后融解曲线，可单、直接地判断实时荧光定量PCR反应产物的目的基因片25.2PBS(磷酸盐缓冲溶液):0.01mol/L(pH7.2)PBS的配制方法5.5蛋白酶K(10mg/mL)。5.7酚-氯仿-异戊醇混合液(25:24:1):在一灭菌棕色瓶中按25:24:1比例分别加入酚、氯仿、6.2高速冷冻离心机：可控温至4℃,最大离心速度可达12000r/min3d)加等量的酚-氯仿-异戊醇(25:24:1),充分混匀，12000r/min离心5min,小心吸出上层e)加1/10体积3mol/L的乙酸钠(pH5.4),2.5倍体积预冷的无水乙醇，12000r/min离心7.2荧光定量PCR检测450.01mol/L（pH7.2）磷酸盐缓冲液磷酸二氢钠水溶液（NaH2PO4•H2O）27.磷酸氢二钠水溶液（Na2HPO4•12H2O）71.6MDPV和GPV双重实时荧光定量PCR鉴别检测方法所用引物见表B.1。5'-TAATGGTGGCAGGAATG7MDPV和GPV双重实时荧光定量PCR鉴别检测反应体系组分见表C.1。SYBRGreen荧光定量PCR酶混合物（aSYBRGreen荧光定量PCR试剂盒内提供，内含DNA聚合酶，脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucl），8(资料性)MDPV和GPV双重实时荧光定量PCR鉴别检测标准扩增曲线MDPV和GPV双重实时荧光定量PCR鉴别检测标准扩增曲线见图D.1。Threshold121(AdjustedBaselinesetings:automatic,Dritcome图D.1MDPV和GPV双重实时荧光定量PCR鉴别检测标准扩增曲线9(资料性)MDPV和GPV双

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