蛋白质工程-复习提纲

蛋白质工程第一章——绪论蛋白质工程的定义？狭义定义：蛋白质工程就是通过基因重组技术改变或设计合成具有特定生物功能的蛋白质广义定义：蛋白质工程是通过物理、化学、生物和基因重组等技术改造蛋白质或设计合成具有特定功能的新蛋白质（简单来说：蛋白质工程就是一门改造设计蛋白质的学科）蛋白质工程的基本研究内容？研究内容总体可分为四大部分：蛋白质的基础知识——结构、理化性质、生物功能、功能与结构的关系蛋白质的物质准备——表达、纯化蛋白质的研究方法——结构解析、分析鉴定、蛋白质组学研究蛋白质的改造应用——设计改变、功能应用、蛋白质生物信息学或者可分为三大部分：（1）蛋白质结构分析——基础（关系学）（2）结构、功能的设计和预测——基础的应用与验证（实验科学）（3）创造和/或改造蛋白质——新蛋白质——终目标（工程学）蛋白质工程的应用（1）蛋白质工程应用蛋白质多肽药物、新型疫苗、工业用酶……蛋白质工程意义1）在医药、工业、农业、环保等方面应用前景广泛2）对揭示生命现象的本质和生命活动的规律具有重要意义3）是蛋白质结构形成和功能表达的关系研究中不可替代的手段（3）蛋白质工程的支持技术定点突变等遗传操作技术；蛋白质结构解析技术；生物信息学分析技术；蛋白质的设计、表达、生产技术第二章——蛋白质结构与功能一、蛋白质的生物学功能调节功能、防御/攻击、支架作用、信息传递、运动功能、转运功能、储存功能、催化功能、结构成分蛋白质基本化学组件

（1）氨基酸（amino）氨基酸种类：二十种天然氨基酸、稀有氨基酸、非天然蛋白质氨基酸氨基酸的化学组成与结构：①均含有C、H、O、N、S，以一定比例存在。有些含有微量的金属元素（如铁、锌、钼、镍等）②易被酸、碱和蛋白酶催化水解为胨、肽。共同的化学结构（除脯氨酸）氨基酸的性质极性氨基酸：Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、His、Tyr——二硫键疏水氨基酸：Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Pro、Met、Trp——疏水内核荷电氨基酸：Arg、Lys、His（+）；Asp、Glu（-）——PI，蛋白分离谱特性、紫外线吸收特性——检测肽单位、多肽链1）肽键定义：由一个氨基酸的α-羧基与另一个氨基酸的α-氨基脱水缩合而形成的化学键。具有反式(trans)和顺式(cis)两种构型。2）肽键平面：由于肽键具有部分双键的性质，使参与肽键构成的六个原子被束缚在同一平面上，这一平面称为肽键平面或肽单位（peptideunit)。三、蛋白质空间结构组件（1）种类：α螺旋、β折叠、转角、环肽链1）α螺旋：多肽链中的各个肽平面围绕同一轴旋转，形成螺旋结构.稳定性好，原因：肽链内形成氢键，氢键的取向几乎与轴平行；中心无空腔。相关信息：螺旋一周，沿轴上升的距离即螺距为0.54nm,含3.6个氨基酸残基；两个氨基酸之间的距离为0.15nm特点：蛋白质分子为右手α-螺旋β折叠：伸展的构象，每圈只有2个氨基酸残基的特殊螺旋。α-碳原子处于折叠的角上，两个氨基酸之间的轴心距为0.35nm特点：氢键是在片层间而不是片层内形成3）转角：由四个AA组成;第一个AA的-C=O和第四个AA的–N-H之间形成氢键特点：一个不很稳定的环状结构。4）环肽链：通过一段短的环链将2条相邻的β链或者α链连接在一起四、蛋白质空间结构层次（1）超二级结构（super-secondarystructure）（2）结构域domain1）定义：是在二级结构或超二级结构的基础上形成三级结构的局部折叠区，它是相对独立的紧密球状实体。2）特点：特点是在三维空间可以明显区分和相对独立，并且具有一定的生物功能如结合小分子。通常由2～3二级结构单位组成，一般为α螺旋、β折叠和环（loop）。①结构域是蛋白质三级结构的基本单位。②对于较大的球状蛋白质或亚基，其三级结构往往由两个或多个结构域缔合而成。③有独特的空间构象并承担不同的生物学功能，因此结构域有时也指功能域（3）亚基1）定义：蛋白质分子的最小共价单位、具有完整的三级结构、是四级结构的基本组件2）空间结构：亚基的立体排布、相互作用及接触部位的布局；亚基之间不含共价键，次级键的结合也比二、三级结构疏松（4）四级缔合在结构和功能上的优越性1）增强结构稳定性——蛋白质的表面积与体积之比降低。——亚基缔合还可以屏蔽亚基表面上的疏水残基以避开溶剂水。2）提高遗传经济性和效率——所需的DNA比编码一条相对分子质量相同的多肽链要少。3）使催化基团汇集在一起——使不同单体亚基的催化基团汇集在一起以形成完整的催化部位。使寡聚蛋白具有别构效应和协同性——结合在蛋白质分子的特定部位上的配体对该分子的其他结合部位所产生的影响称为别构效应。——协同性（正、负）五、维系蛋白质结构的作用力（1）种类：肽键、二硫键、氢键、离子键、金属离子配位键、疏水键、范德华力六、蛋白质结构分类（1）种类：反平行α螺旋结构域(全α—结构)、平行或混合型β折叠片结构域(α，β—结构)、反平行β折叠片结构域(全β—结构)、富含金属或二硫键结构域(不规则小蛋白结构)1）蛋白质结构类型——α型——主要由α螺旋组成，60-80％，较刚性的棍状结构，但足够灵活α/β型——是已知数量最多的一类结构、均具有βαβ模体，右手型。TIM桶式折叠(TIMbarrele)、扭转开放式折叠(Rossmanfold)、马蹄式折叠(horseshoefold)①TIM桶式折叠(TIMbarrele)——该结构域的中间部分由若干平行排列的β-链绕成内筒，而α-螺旋则以右手交叉连接方式形成外筒②扭转开放式折叠(Rossmanfold)——由若干段β-片层平行交叉盘绕成马鞍形双层结构，并与若干段α-螺旋交叉连接而成。平行的β-片层链在内部，α-螺旋在两侧③马蹄式折叠(horseshoefold)——以α-螺旋和β-片层的重复单位从头至尾盘绕成马蹄状结构。其β-片层链只有轻微的倾斜，并几乎与中心轴平行3）全β—结构(反平行β折叠片)——这类结构域由4—10个β折叠股构成。它又可分为两个主要类型：反平行β桶、反平行β片。①反平行β桶——通常由偶数β折叠股组成。与单绕平行β桶类似。但对称性差，氢键强度小。②反平行β片——它是含3—15个β折叠股的单层反平行β折叠片，虽然也是扭曲的，但不闭合成桶。在β片的一侧有一层α螺旋和回环，片的另一侧暴露溶剂。4）蛋白质结构类型——α＋β型——这类结构中既含α螺旋又含β层结构，但α螺旋与β层在空间上彼此不混杂，分别处于分子的不同部位，有时α螺旋和β层分别形成两个结构域。5）富含二硫键和金属离子型——一类小蛋白质分子，它们没有典型的二级结构，或者所含二级结构的组成和组织没有明显的规律可循。这类蛋白质分子不大，但含有较多的二硫键或金属离子以稳定其三维结构，所以在有的分类中称它们为富含二硫键和金属离子型蛋白。七、蛋白质结构与功能的关系（1）蛋白质一级结构与功能的关系1）一级结构是空间构象的基础2）一级结构是功能的基础3）蛋白质一级结构的种属差异与分子进化（同种蛋白质的种属差异是分子进化的结果）4）蛋白质一级结构与疾病（2）蛋白质的空间构象与功能的关系功能的发挥有赖于特定空间构象的形成、不同的组件（域）功能不一功能=结构+运动第三章——蛋白质折叠一、Anfinsen经典变性蛋白重折叠实验——20世纪60年代，Anfinsen基于还原变性的牛胰RNase在不需其他任何物质帮助下，仅通过去除变性剂和还原剂就使其恢复天然结构的实验结果，提出了“多肽链的氨基酸序列包含了形成其热力学上稳定的天然构象所必需的全部信息”的“自组装学说”。二、蛋白质折叠的热力学（1）热力学——研究热现象中物质系统在平衡时的性质和建立能量的平衡关系，以及状态发生变化时系统与外界相互作用的学科。（2）热力学定律热力学第一定量、热力学第二定量、热力学第三定律、热力学第零定律1）熵判据和蛋白质折叠未折叠的状态包含很多具有不同构象的分子——疏水作用是多肽链折叠的主要驱动力，疏水作用的主要动力来自于蛋白质溶液体系的熵值的增加。2）吉布斯自由能判据和蛋白质折叠吉布斯自由能变化应同时考虑多肽链和溶剂两者对体系焓值变化和熵值变化的贡献热力学假说天然蛋白质多肽采取的构象是在一定环境条件下热力学上最稳定的构象，采取天然构象的多肽链和它所处的一定环境条件（如溶液组分、pH、温度、离子强度等）整个系统的自由能最低，所以处于变性状态的多肽链在一定的环境条件下能够自发折叠成天然构象三、蛋白质折叠的动力学牛顿第一定律（惯性定律）——一切物体在没有受到力的作用时，总保持静止状态或匀速直线运动状态牛顿第二定律（质点运动定律）——物体在受到合外力的作用会产生加速度，加速度的方向和合外力的方向相同，加速度的大小与合外力的大小成正比，与物体的惯性质量成反比。牛顿第三定律（作用和反作用定律）——两个物体之间的作用力和反作用力，在同一条直线上，大小相等，方向相反（1）重折叠与新生肽链折叠的区别①完整肽链在试管内的重折叠相当于翻译完成后才折叠，与新生肽链的合成延伸与折叠同时进行不同。②细胞内新生肽链折叠是一个比蛋白质体外重折叠快得多的过程。③温度、浓度、pH值不同④细胞和试管另一个重要差别是“大分子拥挤”问题。四、帮助蛋白质和新生肽链折叠的生物大分子分子伴侣（molecularchaperone）折叠酶：催化与折叠直接有关的化学反应的酶。——蛋白质二硫键异构酶(proteindisulfideisomerase,PDI)——肽基脯氨酰顺反异构酶(peptidylprolylcis-transisomerase,PPI)（1）分子伴侣（molecularchaperone）

1）发现和定义分子伴侣的发现和定义1978年，Laskey发现DNA和组蛋白体外重组为核小体时需要核质素(nucleoplasmin)的帮助。（一大类相互之间没有关系的蛋白质，它们具有的共同功能是帮助其他含蛋白质的结构在体内进行非共价的组装和卸装，但不是这些结构在发挥其正常的生物学功能时的永久组成部分）2）分子伴侣与酶的异同点①分子伴侣的定义完全是功能上的。②分子伴侣与酶的异同点——相同点参与促进一个反应而本身并不在最终产物中出现——不同点分子伴侣对靶蛋白不具有高度专一性分子伴侣的催化效率很低分子伴侣有时只是阻止肽链的错误折叠而不是促进其正确折叠。3）分子伴侣在蛋白质分子折叠中的作用分子伴侣首先会识别折叠过程中形成的折叠中间物的非天然构象，而不会去理会天然构象。（2）折叠酶催化与折叠直接有关的化学反应的酶。蛋白质二硫键异构酶(proteindisulfideisomerase,PDI)肽基脯氨酰顺反异构酶(peptidylprolylcis-transisomerase,PPI)1）蛋白质二硫键异构酶(PDI)催化新生肽链的巯基氧化形成二硫键。PDI在动力学错配折叠中间体加速二硫键的交换中起到非常重要的作用。2）肽基脯氨酰顺反异构酶(PPI)蛋白质的肽键几乎都是反式的（99.95%），但脯氨酰亚氨基的肽键有6%是顺式的。（3）动力学假说细胞内新生肽段的折叠一般意义上说是需要帮助的，而不是自发进行的。帮助蛋白质折叠的生物大分子主要是分子伴侣和折叠酶。不仅仅受“热力学”控制，也受到“动力学”的控制。五、折叠机制的理论模型（1）框架模型（FrameworkModel）

定义：框架模型假设蛋白质的局部构象依赖于局部的氨基酸序列。在多肽链折叠过程的起始阶段,先迅速形成不稳定的二级结构单元；随后这些二级结构靠近接触,从而形成稳定的二级结构框架；最后，二级结构框架相互拼接，肽链逐渐紧缩，形成了蛋白质的三级结构。这个模型认为即使是一个小分子的蛋白也可以一部分一部分的进行折叠,其间形成的亚结构域是折叠中间体的重要结构。（2）疏水塌缩模型（HydrophobicCollapseModel）

在疏水塌缩模型中，疏水作用力被认为是在蛋白质折叠过程中起决定性作用的力的因素。在形成任何二级结构和三级结构之前首先发生很快的非特异性的疏水塌缩。——疏水内核包埋

（3）扩散-碰撞-粘合机制（Diffusion-Collision-AdhesionModel）

（4）成核-凝聚-生长模型（Nuclear-Condensation-GrowthModel）

（5）拼版模型（Jig-SawPuzzleModel）

六、折叠密码蛋白质中氨基酸序列与其三维结构的对应关系，称之为第二遗传密码或折叠密码（1）第一遗传密码的特点：①方向性：从AUG或GUG到UAA,UGA或UAG②连续性：密码子之间没有空格，阅读mRNA时是连续的③简并性：两个或者多个密码子编码同一氨基酸④摆动性：原核和真核细胞都只合成约30种带有反密码子的tRNA，密码子和反密码子配对时前两对严格遵守碱基互补配对法则，但第三对碱基有一定的自由度可以“摆动”。⑤通用性：所有的生物都有相同的遗传密码。（2）折叠密码（第二遗传密码）的特点：简并性：氨基酸序列不同的肽链可以有极为相似甚至相同的三维结构。多意性：相同的氨基酸序列可以在不同的条件下决定不同的三维结构。全局性和复杂性：在肽链上相距很远的残基可以在空间上彼此靠近而相互作用，并对分子总体结构产生重要影响；后形成的肽段可以影响已经形成的肽段的构象从而造成对分子整体的影响等。（这些情况称之为第二密码的全局性）蛋白质折叠质量控制过程蛋白质折叠失败情形——新生肽链的不完整性形成最终成熟蛋白分子中不存在也不应该有的瞬间结构。——在大分子拥挤的环境下经常会产生错误折叠。——折叠中间态的正确途径与错误途径竞争失败时。——由分子伴侣和靠消耗三磷酸腺苷的能量而发挥作用的特定的蛋白水解酶组成。——分子伴侣帮助新生肽正确折叠；而特定的蛋白水解酶把不能继续正确折叠的或错误折叠的“垃圾”水解成小分子。分诊治疗机制（triage）细胞内新生肽“病人”的命运主要是由分子伴侣处理“病人”的能力和速度在动力学上来决定的。八、蛋白质折叠研究意义（1）生物工程应用“瓶颈”问题：在简单的微生物细胞内引入异体DNA后所合成的多肽链往往不能正确折叠成为有生物活性的蛋白质而形成不溶解的包含体或被降解。（2）与折叠有关的疾病1）“分子病”:由于基因突变造成蛋白质分子中仅仅一个氨基酸残基的变化就引起疾病的情况，如地中海镰刀状红血球贫血症2）“折叠病”:蛋白质分子的氨基酸序列没有改变，只是其结构或者说构象有所改变引起的疾病。由于蛋白质折叠异常而造成分子聚集甚至沉淀或不能正常转运到位3）常见折叠病：老年性痴呆症(Alzheimersyndrome)——病人脑中充满了由错误折叠蛋白形成的杂乱的蛋白