常见测蛋白浓度方法的优缺点比较

第第页常见测蛋白浓度方法的优缺点比较蛋白浓度测定的方法有很多，但每种方法都有其特点和局限性，因而需要在了解各种方法的基础上依据不同情况选用恰当的方法，以满足不同的要求。例如凯氏定氮法结果精准明确，但操作多而杂，用于大批量样品的测试则不太合适；Lowry法精准明确度较高，但是比较费时，且每步的时间要求相对严格；Bradford法灵敏简便，但易受去垢剂的影响；BCA法以其试剂稳定，抗干扰本领强，结果稳定，灵敏度高而受欢迎。在蛋白浓度测定中，以下面四种方法为常见：1.Bradford法：原理：在酸性环境中，蛋白质结合考马斯亮蓝G250染料，导致染料的汲取峰发生位移，从红棕色形式（汲取峰465nm）转化为蓝色形式（汲取峰610nm）。这两种形式在595nm处光汲取差别most大，因此595nm是测定考马斯染料—蛋白复合物的蓝色的best波长。结合到每个蛋白质分子上的考马斯染料分子数大概与蛋白所带正电荷的数量成正比，因此通过比色法可以测定溶液中蛋白质的含量。优点：1.灵敏度高，可以检测到1μg/ml的蛋白质浓度。2.反应时间短，反应时间只需5—10分钟。3.操作简单，只需加入试剂，混合均匀即可。4.适用范围广，适用于大部分类型的蛋白质。5.不受溶液中还原剂的影响。缺点：1.受干扰：某些离子和化合物会干扰测定结果，去垢剂（表面活性剂）会产生猛烈干扰，使得与很多常用的缓冲液不兼容。2.灵敏度不稳定：不同蛋白质的灵敏度不同，有些蛋白质可能无法被检测到。肽或蛋白质的分子量必需大于3,000道尔顿才略被检出。3.需要标准曲线：需要制备标准曲线来计算蛋白质浓度，加添了操作步骤。近来市场上已显现能兼容去垢剂的Bradford法蛋白定量试剂盒，可以兼容各种常用的蛋白缓冲液，大大拓展了应用范围。2.BCA法：原理：在碱性环境下，蛋白质将铜离子还原成亚铜离子，二喹啉甲酸（BCA）与亚铜离子形成紫色的络合物，这种络合物溶于水并在562nm处产生光汲取峰值，光汲取强度在肯定范围内与蛋白质含量呈貌似线性关系，因此使用比色法可以对蛋白质进行检测和定量。BCA法没有反应终点，反应会随着时间而连续进行；通过一段时间的孵育后，反应速度会变慢，从而可以对大量样品进行检测。优点：1.灵敏度高，可以检测到低至0.5μg/mL的蛋白质。2.对蛋白质分子量没有要求，小分子量肽也可检测。3.结果稳定可靠，重复性好。4.可用于高通量的蛋白质测定。5.与Bradford法相比，可耐受肯定浓度的去垢剂。缺点：1.受螯合剂和略高浓度的还原剂的影响：EDTA小于10mM，DTT和巯基乙醇均低于1mM。2.对不同蛋白质的反应性不同，因此不同蛋白质灵敏度有差别。3.与Bradford法相比，操作相对较多而杂，需要多个步骤。3.Lowry法：原理：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。在肯定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。通过比色法测定溶液中蛋白质的含量。适合于测定20mg/L—400mg/L含量的蛋白质溶液，可检测的蛋白质量低达5mg，通常测定范围是20～250mg。优点：灵敏度高，可检测低至1μg/mL的蛋白质；对于大部分蛋白质都有较好的线性关系。缺点：1.操作相对较多而杂，需要多个步骤；2.干扰物比较多，不但还原剂和去垢剂会产生干扰，酚类、柠檬酸、硫酸铵、tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。4.UV汲取法：原理：利用蛋白质中的芳香族氨基酸（如酪氨酸、色氨酸）在280nm处的汲取峰，测定溶液中蛋白质的含量。优点：操作简单，无需添加试剂；可同时测定多个样品。缺点：灵敏度较低，只能检测高浓度的蛋白质；对于某些蛋白质（如酶）会产生干扰，导致测定结果不准确。5.琼脂糖凝胶电泳：原理：通过比较待测样品与已知浓度标准品的相对强度，估算待测样品中蛋白质的含量。优点：1.琼脂糖凝胶电泳测蛋白浓度简单易行，不需要昂贵的仪器设备。2.可以同时测定多个样品的蛋白质浓度。3.可以测定不