第9章 遗传工程课件

第9章遗传工程

§9.1细胞工程(自学）

§9.2基因工程

§9.3克隆技术(了解)第9章遗传工程

遗传工程就是人类用近代科学技术的最新成就，在离体条件下进行遗传操作，按照既定目标，有计划地改变生物遗传性，甚至建造新物种的一门学科。

广义的遗传工程包括细胞工程、染色体工程、基因工程和在此基础上的克隆技术等几个方面的内容。

狭义的遗传工程则指在分子水平上进行遗传操作的基因工程。第9章遗传工程植物细胞融合TomatoPotato+Pomato薯茄第9章遗传工程（1）定义：按照预先设计的生物施工蓝图，采用分子生物学和现代生物技术，对基因进行操纵，以达到定向改变生物的目的。（2）目的：将目的基因引入宿主细胞，并在宿主细胞中整合、表达和传代，从而创造出新型的生物，如新型微生物，转基因动物、植物等。

9.2.1.基因工程的概念

§9.2基因工程第9章遗传工程（3）作用：

○克服常规杂交育种的盲目性，大大缩短育种周期；○打破物种亲缘关系的限制，有可能使生物的基因在人、动物、植物和微生物四大系统里进行广泛交流，创造出自然界原本没有的生物类型。

第9章遗传工程9.2.2基因工程施工的程序

●施工准备材料,即“目的”基因，载体和工具酶等。●把目的基因与载体结合成重组DNA分子。●把重组DNA分子引入受体细胞，即基因转移，建立分子无性繁殖或称克隆。●鉴定筛选转基因系，即把目的基因能表达的受体细胞挑选出来。第9章遗传工程关键元件与技术

1）载体用来运载目的基因的工具称为载体(vector)。常用的载体包括质粒载体和病毒栽体。第9章遗传工程载体的条件：①具有复制原点，能自我复制；②具多克隆位点，即有多种限制酶的酶切位点；③具有可供筛选的遗传标记，如抗生素基因，鉴别有无载体的宿主细胞；显色表型，检测重组质粒存在与否；④易从宿主细胞中回收。第9章遗传工程

细菌质粒pBR322如果将这种质粒导入无质粒的、对抗生素敏感的细菌寄主细胞中，则细菌表现型将变为对两种抗生素的有抗性。在质粒的抗四环素基因中，具有若干酶切位点。当外源DNA片段插入到这些位点时，位点所在的抗四环素基因将表现失活；但与这些位点无关的抗氨苄青霉素基因不受影响。——携带着若干种限制酶的单一切点和两个抗性基因：

抗氨苄青霉素基因和抗四环素基因第9章遗传工程Ti质粒（Tumourinducingplasmid）T-DNA(转移DNA)是Ti质粒的重要组成成分，大约有20kb，在感染植物细胞后能够随机地共价整合到植物染色体DNA中，成为正常的遗传成分。这个区域所含的冠瘿碱合成酶基因的启动子，能够启动外源基因在植物细胞中表达。目前已经以Ti质粒为基础，构建了许多新的载体，如PGV-3850，PMONl28，PTIB6S3(SEV系统)等。TL、TR分别表示T-DNA片段的左端和右端第9章遗传工程第9章遗传工程●病毒载体：λ噬菌体（λPhage）λ噬菌体(温和型)：噬菌体DNA中间约1/3的序列为中间基因簇，位于两端的为DNA左、右臂。中间基因簇可被外源DNA替代而不影响浸染细菌的能力。能接受15kb外源DNA片段，可以作为cDNA或核DNA克隆的载体。第9章遗传工程Schematicrepresentationofthefullvirusvectorstrategyandofsomeexamplesofthedeconstructedvirusstrategy.CP,coatprotein;GOI,geneofinterest;MP,movementprotein;P,promoter;Pol,RNAdependentRNApolymerase;RS,recombinationsite;T,terminator第9章遗传工程Schematicdescriptionofinfectionandspreadofrepliconsbasedon(a)first-generationand(b)second-generationviralvectors.第9章遗传工程2）重组DNA分子的构建

重组DNA（recombinantDNA）分子：外源DNA与载体DNA相连接而形成的DNA分子。基因工程的核心：

——体外DNA重组(Recombination)，即人工将一段目的DNA插入一个载体的过程。第9章遗传工程●构建重组DNA分子的方法：天然粘性末端切口的限制性核酸内切酶分别处理目的基因DNA和载体DNA→粘性末端→碱基互补形成双链→连接酶弥合切口→重组DNA分子。第9章遗传工程第9章遗传工程平切的限制性内切酶处理载体和目的基因→平口→端部人工建造粘性末端→两个DNA分子粘合→重组DNA分子。平切的限制性内切酶处理载体和目的基因→平口→T4噬菌体的连接酶直接把平口连起来→重组DNA分子。第9章遗传工程高油酸转化事件MON87705表达载体pMON95829抗除草剂转化事件MON87701表达载体pMON53570抗除草剂转化事件MON89788目标基因插入位置

无冗余序列和额外编码框、序列优化、启动子（增强子、内含子、信号肽序列等）、UTR序列、终止子序列、MAR序列等。商业化载体的构建及载体质量控制第9章遗传工程3）受体细胞

受体细胞是接受重组DNA分子，目的DNA在其中得以复制扩增、目的基因得以表达产生出正确的表达产物的细胞。从理论上讲，任何原核生物和真核生物的细胞，植物和动物的细胞都可以作为受体细胞。第9章遗传工程

大豆未成熟子叶转化（转化效率1.2%）

大豆子叶节转化（0.6%）

大豆胚尖转化再生系统（0.9%）第9章遗传工程受体选择：○受体细胞来源的生物类型要与所使用的载体相互适应，即要选择合适的载体——受体系统。○受体细胞要易于培养，适应于大规模生产或易于再生成完整的生物个体。○有时由于特殊的要求而需要选用特定的受体。如某些蛋白药物需要翻译后糖基化修饰才具有功能，必需要以真核细胞为受体。第9章遗传工程4）重组DNA分子转入受体

将目的基因的DNA分子连结到载体DNA分子上后，就可以通过它进入到宿主细胞中。转化（transformation）：以细菌质粒DNA作载体，将外源DNA导入宿主细胞的过程。转染（transfection）：以噬菌体或病毒DNA为载体，将外源DNA片段导入宿主细胞的过程。第9章遗传工程9.2.3.植物的转化技术

一个成熟、实用性强的植物转基因系统应该具备以下条件：

●获得转基因植株的效率高；●重复性好；●设备要简单，易于操作；●由转化至获得转基因植株的时间相对较短；●无基因型的依赖性，即方法的适用范围广，能在同一个植物种的许多基因型上成功。

第9章遗传工程AgrobacteriumremainedthefavouredDNAdeliverymethodforthetransformationofplantsby57%,followedbyparticlebombardment(25%)anddirecttransferofDNAintoprotoplasts(14%).第9章遗传工程1）用Ti和Ri质粒进行基因转移利用农杆菌的Ti质粒作为载体的农杆菌介导法进行植物基因的转移起初只被用于双子叶植物中，对于作为重要粮食作物的禾谷类单子叶植物来说其侵染率是很低，限制了其在基因转移中实际应用。但近年来，农杆菌介导转化在一些单子叶植物（尤其是水稻）中也得到了广泛应用。

转基因方法：第9章遗传工程ShrawatAK&Lǒrz,ThePlantBiotechnologyJoural,2006,4:575-603第9章遗传工程2）微注射法(microinjection)

首先将植物细胞游离出原生质体，用一种特制的仪器将单个原生质体吸住，然后用锋利微管（注射针）刺入原生质体中，将目的基因DNA通过微管注射到受体细胞中。

第9章遗传工程3）电穿孔法

短时间的高压直流电脉冲的冲击可以使原生质膜的分子疏松，形成暂时性的小孔(3nm～4nm)，以后可以恢复正常，对原生质体生活力无大影响。存在于原生质体周围溶液中的外源DNA可以通过这种小孔进入原生质体，实现基因的直接转移。这种方法转化效率较高，操作简便。第9章遗传工程4）微束激光打孔法

原生质体在短时间微束激光照射下也可在质膜表面形成小孔(约0.25μm2左右)，使DNA分子进入细胞。此法与电激穿孔法相比，要求的仪器比较复杂，而且对细胞的伤害较高，若光强度和照射时间掌握不好，形成的小孔无法恢复，原生质内容物流出后会引起细胞死亡。第9章遗传工程5）基因枪法——又称为高速微弹法(particlebombardment)，通过高速飞行的金属颗粒将包被其外的目的基因直接导人到受体细胞内，从而实现转化。与农杆菌转化相比，基因枪法转化的一个主要优点是不受受体植物范围的限制。

第9章遗传工程第9章遗传工程基因枪转化的特点（1）克服了农杆菌介导的寄主限制；（2）对靶细胞几乎没有要求；

（3）简化了质粒的构建；（4）简化了转化方法；（5）避免了农杆菌污染造成的假阳性；（6）可以获得持续时间较长的瞬时表达。第9章遗传工程6）通过植物性器官进行基因直接转移

在棉花等植物受粉后，用外源DNA涂抹柱头或将其注射入子房内，当子房和胚珠处于感受态时，外源DNA可以通过花粉管通道和珠孔进入胚囊和卵细胞，使后代某些性状发生变化。这种方法简便易行，可在植物体上操作。第9章遗传工程Ovary-drip

transformationPollen-tubepathwaymethod:DNAsolutionwasappliedtothecutstyles.

Ovary-dripmethod:DNAsolutionwasappliedtotheovarieswithentirelydecapitatedstyles第9章遗传工程Piercing

and

vacuum

infiltration

ofthematureembryoProcedureoftransformation.A.Seedssoakedinwaterfor2days.Thearrowheadsshowtheembryoregion.B.Inoculationofaseedwithaneedle.C.Anillustrationshowingthedirectionofpiercing.Thedirectionofpiercingwasshownindetailinthetoprightcornerillustration.Theneedlepiercedthesideoftheplumulewhichliedbeneaththehuskwhereashootwouldlateremerge.D.ThepiercedseedssoakedintheAgrobacteriuminoculumanddrawnvacuumforinfiltration.E.Seedlingsafterincubationindarkfor9days第9章遗传工程

除农杆菌介导的转化用Ti和Ri质粒为载体进行基因转移外，其他5种方法（微注射法、电穿孔法、微束激光打孔法、基因枪法、花粉管通道法）均不需载体，属于基因的直接转移。

基因的直接转移大大扩大了植物基因转移的范围，特别是能对禾谷类等原生质体培养比较困难的重要粮食作物进行基因转移。

第9章遗传工程转化方法PEG法电击法微针注射法花粉管通道法受体材料原生质体原生质体原生质体卵细胞宿主范围无无无有性繁殖植物组培条件复杂复杂复杂无嵌合体比例无无无无操作复杂性简单复杂复杂简单设备要求便宜昂贵昂贵便宜工作效率低低低低单子叶植物应用可行可行可行广泛第9章遗传工程9.2.4.动物的转基因技术（自学）

世界上第一只转基因动物——转基因小鼠

美国科学家戈登(Gordon)等（1981）将小鼠的受精卵取出来，在显微镜下将胸苷激酶基因用玻璃微管送入受精卵的雄原核，然后立刻输入假孕母鼠的输卵管中，使其在子宫内着床，最终发育成转基因小鼠。第9章遗传工程9.2.5应用领域与意义●基因工程是研究分子遗传学基本理论的一个重要手段。与细胞分化、生长发育、肿瘤发生、基因的精细结构、功能、调控机理等研究有关。●基因工程为解决农业、工业、医学、环境和能源等方面的许多重大问题开辟了新途径。如固氮基因的转移，提高谷类作物的蛋白质含量，提高工业发酵产品的产量和质量，创造清除环境污染的新微生物类型，人类遗传疾病的治疗，用工业微生物发酵方法生产人类所需要的疫苗、抗体、激素、酶和维生素等。第9章遗传工程

（1）种植业方面：转基因新品种的选育和利用

利用基因工程技术可以将外源基因导入植物细胞获得转基因植物，为农林育种提供了一条十分有用的途径，人们可以在一定范围内根据自己的意愿来改造植物的一些性状。到目前为止，国内外已经获得60多种转基因植物（如抗病毒、抗真菌、抗虫害和抗除草剂等特性的植物），其中玉米、大豆、油菜、马铃薯、番茄和棉花等已经大面积种植。第9章遗传工程●转基因植物

转Bt基因棉花——抗棉铃虫第9章遗传工程●转基因植物

转基因番木瓜——抗环斑病毒第9章遗传工程改变花色的转基因矮牵牛花第9章遗传工程蓝色玫瑰一直是人类美丽的梦想基因工程正在将它变为现实第9章遗传工程

据国际农业生物技术应用服务组织（ISAAA）统计，2012年全球转基因作物种植面积达到1.7亿hm2，相当于我国耕地面积的1.38倍，总产值约1800亿美元。种植转基因大豆的国家达到11个（转基因作物种植国家总数为28个）。第9章遗传工程2012年，转基因作物种植面积最大的作物为大豆（8100万公顷，48%）、玉米（5565万公顷，32.7%）、棉花（2430万公顷，14.3%）、油菜（930万公顷，5.5%）。转基因大豆仍然是是主要的转基因作物。2012年，转基因大豆种植面积约占全球大豆种植总面积的81%，玉米为35%，棉花为81%，油菜为30%。第9章遗传工程法规评价、产品开发目标作物规模化转化、性状鉴定基因及元件优化、目标作物转化大通量基因筛选、模式作物测试阶段4：法规评价阶段3：转化及鉴定阶段2：基因优化阶段1：基因验证产品上市阶段5：商业化开发研发周期：10-15年研发投入：360万美元/天研发成本：1.35亿美元/转基因作物国外公司转基因作物开发流程第9章遗传工程项目阶段1阶段2阶段3阶段4阶段5高产大豆第二代高产大豆抗虫、抗除草剂大豆第二代抗虫、抗除草剂大豆抗线虫大豆抗病大豆易加工高品质大豆高油大豆第二代高油大豆Omega3大豆低亚麻酸大豆高饱和脂肪酸大豆未来5-10年内有望进入商业化应用的转化事件第9章遗传工程

转基因大豆材料室内接种斜纹夜蛾，感虫指数在0-14.29之间,表现为高抗，已完成中间试验，正在申报环境释放。转cry1Ac-pta基因大豆室内接种斜纹夜蛾鉴定结果材料名平均感虫指数/%抗性AH3004-120HRAH3005-214.29HRAH3008-111.43HRAH6001-15.71HRAH6001-20HRAH6006-15.71HRAH6006-68.57HRAH6001-2对照HC6转cry1Ac基因抗食叶性害虫大豆第9章遗传工程

（2）畜牧业方面

一是获得转基因家畜和家禽，培育出更适合人类需要的畜禽新品种，已获得了转基因兔、鸡、猪、牛、羊等基因工程动物。

另一方面是生产基因工程疫苗，为兽医提供新的预防和治疗药物以及诊断的探针等。第9章遗传工程

（3）医学方面

A、医药工业：用大肠杆菌生产人的生长激素释放抑制因子是基因工程第一个成功的实例。目前用基因工程方法商业化生产医药品投产的10多种，如胰岛素、干扰素、人生长激素因子、表皮生长因子、乙肝疫苗等。

基因工程方法生产的药品纯度高，疗效显著，副作用小，由于是工业化发酵生产，成本低，经济效益十分显著。生物制药已经成为21世纪的朝阳产业。第9章遗传工程小鼠单克隆抗体的生产第9章遗传工程第9章遗传工程

B、基因治疗

——指利用基因工程技术，将外源基因导人患者的靶细胞或组织内，纠正或补偿致病基因的缺陷，关闭或抑制异常表达的基因，从而达到治疗某种疾病的目的。如进行遗传病治疗，用正常的基因来代替缺陷基因或者来补救缺陷基因的致病因素。第9章遗传工程基因治疗：

方法：减毒的病毒DNA作载体(retrovirusDNA)→构建重组DNA分子→用病毒包装物包装后形成的减毒病毒感染患者的细胞→将正常基因整合到染色体上。第9章遗传工程

（4）环境保护方面

环境监测：利用基因工程技术合成特异的核酸片段(DNA或RNA)作为探针来快速而灵敏地检测环境中有害微生物的存在和数量。

环境净化：利用基因工程技术改造微生物或植物，使之能有效降解环境中的污染物，或利用工农业废料再生有用的产品，或富积环境中的某些元素达到净化环境和回收利用的目的等（如，合成的“超级细菌”能吞食和分解多种污染环境的物质)。

第9章遗传工程GreenFuture—Bioenergyorbiodisel第9章遗传工程9.2.6.转基因的安全Goodorbad?第9章遗传工程Footandmonthdisease,birdflu第9章遗传工程第9章遗传工程第9章遗传工程第9章遗传工程Questions?Aregeneticmodifiedcropsnew?What’sthedifferenceofGMcropscomparedtotraditionalcropbreeding?HowweproducedGMcrops?Isthereanyneedforsomenewregulatoryapproach?WhataretheprinciplesorcriterianeededforGMcrops?第9章遗传工程Questions(cont’d)6.WhataretheimpactsofGMcropsonecology(environment)andeconomy(tradeorsociety)?7.HowwejudgethesafetyofGMfoods?8.HowwedecidetherelatedpolicyofGMcrops(riskassessmentandevaluation)?9.HowwegrowandmanagetheGMcropsgrowthandproduction?第9章遗传工程PlantBiotechnologyTimeline

Adaptedfrom:CouncilforBiotechnologyInformationhttp://=2157第9章遗传工程PlantBiotechnologyTimeline(Con’t)Adaptedfrom:CouncilforBiotechnologyInformationhttp://=2157第9章遗传工程

Plantbiotechnologyisanextensionofthistraditionalplantbreedingwithoneveryimportantdifference--plantbiotechnologyallowsforthetransferofagreatervarietyofgeneticinformationinamoreprecise,controlledmanner.Adaptedfrom:CouncilforBiotechnologyInformation第9章遗传工程9.2.6.转基因的安全1.植物基因工程与人类食物安全2.植物基因工程与生态安全3.植物基因工程与社会发展4.植物基因工程的新策略5.转基因植物的安全评价第9章遗传工程1.植物基因工程与人类食物安全

PotentialRiskstoHumanHealthallergieshorizontaltransferandantibioticresistanceeatingforeignDNAchangednutrientlevels

第9章遗传工程1996InternationalFoodBiotechnologyCouncil/theAllergyandImmunologyInstituteoftheInternationalLifeSciencesInstitute(IFBC/ILSI)DecisionTree第9章遗传工程第9章遗传工程●Co-transformation●Site-specificrecombination-mediatedmarkerDeletion●Transposon-basedmarkermethods●Intrachromosomalrecombinationsystem●Removalofchloroplastmarkergenes●MarkersnotbasedonantibioticorherbicideresistanceMethodstoproducemarker-freetransgenicplantsDarbaniB.,etal.Methodstoproducemarker-freetransformedplants.Biotechnol.J.,2007,2:83-90第9章遗传工程

Geneticengineeringofcanolaoilthatishighinlauricacid第9章遗传工程第9章遗传工程Adaptedfrom:...

Processandgenesinvolvedingoldenriceproduction第9章遗传工程

“Onedayinthefuture,oralpoliovaccinewillbestoppedandcountrieswillbefreeofpolio.”

—DavidL.Heymann,MD

Backgroundimage:Poliovirus.Source:CDC/J.J.EspositoandF.A.MurphyWorld'sfirstoralplantvaccinehepatitisBvirus,CornellUniversityPlantscanbeusedtodeliverediblevaccinesforhumanhealthybenefit第9章遗传工程2.植物基因工程与生态安全

Damagetothenaturalenvironmentcrop-to-weedgeneflowleakageofGMproteinsintosoilreductionsinpesticidespraying:aretheyreal?第9章遗传工程第9章遗传工程第9章遗传工程SuzanneI,etal.,GeneFlow,Invasiveness,andEcologicalImpactofGeneticallyModifiedCrops.THEYEARINEVOLUTIONARYBIOLOGY2009第9章遗传工程Disruptionofcurrentpracticesoffarmingandfoodproductionindevelopedcountriescrop-to-cropgeneflowDisruptionoftraditionalpracticesandeconomiesinlessdevelopedcountriesLackofresearchonconsequencesoftransgeniccropsdisruptionofnaturalecosystemsintroductionofdiseasescreationofbiologicalweapons3植物基因工程与社会发展第9章遗传工程4.植物基因工程的新策略

1）基于RNAi的基因操作2）核酶基因操作3）定点重组系统4）质体/叶绿体的转化策略5）多基因转化第9章遗传工程安全性评价过程华恢1号及Bt汕优63的选育1995-1998年中间性试验1999-2000年环境释放试验2001-2002年生产性试验2003-2004年申报安全证书2005年获得安全证书2009/8/17农业部组织的第三方验证2007-2008年第9章遗传工程ReactionofBtShanyou63(right)andShanyou63control(left)againstartificialinfestationofyellowstemborer抗鳞翅目害虫转基因水稻新材料研制第9章遗传工程华恢1号安评批件第9章遗传工程Conceptforbio-safetyregulationAlwayscasebycase,stepbystep (precautionaryprinciple)2.Safetyrequirementdependsonwhereyouare.第9章遗传工程§9.3克隆技术

自英国科学家利用体细胞培养克隆羊成功后（发表在1997年2月27日出版的《自然》杂志上），在全世界引起了一场“克隆风暴”。

第9章遗传工程9.3.1克隆的概念

克隆（clone）一词源于希腊语“Klón”，意为“小分枝”或“后代”。在生物学里，“克隆”表示复制一个生物个体，如用一只动物或一株植物，复制出一群个体，其中的每一个体都具有与母本相同的基因(遗传因子)。“克隆”一词原先被用于描述由植物体通过无性繁殖所生产出来的后代。由单个细胞经无性繁殖发育成新的生物个体称为克隆。

第9章遗传工程△根据其研究或操作的对象，克隆可分为四大类：

基因