脂肪间充质干细胞促进皮肤创面修复及其作用机制探讨

脂肪间充质干细胞促进皮肤创面修复及其作用机制探讨大面积深度烧伤以及慢性难愈性创面修复一直是临床治疗的难点。随着干细胞研究的开展和深入，体内外实验证明位于皮下脂肪组织内的脂肪干细胞[1]（adipose-derivedstemcells,ADSCs）可以有效促进皮肤创面愈合。皮肤创面愈合[2]是一个复杂的多因素过程，涉及炎症反应、细胞增殖、细胞迁移、再上皮化、血管生成、细胞外基质沉积以及重塑等多方面。在创伤条件下，伤口渗液和其中的炎性因子以及有丝分裂原等趋化因子促进ADSCs增殖，向伤口迁移[3]。实验证明，ADSCs在体、内外均可以向皮肤表皮细胞、成纤维细胞和血管内皮细胞等多种细胞分化，分泌多种生物活性分子限制炎症和凋亡、促进血管形成、促进创周组织细胞，参与损伤修复等，最终实现促进创面愈合的作用。1脂肪干细胞的生物学特性以及低免疫原性ADSCs是成体间充质干细胞的一种，广泛分布于不同物种，如人、鼠、猪、犬及兔等不同部位的脂肪组织中。其数量巨大，1g脂肪组织可以产生大约5×103脂肪干细胞，大约是1g骨髓中获取干细胞数量的500倍；取材安全简便，在局麻下即可获取大量细胞，体外扩增和自我更新能力很强；可以向多种细胞系分化：脂肪、骨、软骨、骨骼肌、平滑肌、心肌、内皮、肝细胞、造血细胞以及神经元细胞[4-5]，ADSCs是真正意义上的具有多向分化潜能的干细胞。ADSCs具有间充质干细胞这一类细胞的特异性表面标记[6]，表达大量的粘附分子：ADSCs持续性表达CD9、整合素β1(CD29)和α4(CD49d)、细胞间粘附分子1(ICAM-1，即CD54)、CD105、血管细胞粘附分子(VCAM，即CD106)和活化淋巴细胞粘附分子(ALCAM，即CD166)，表达Ⅰ类组织相容性蛋白HLA-ABC。ADSCs不表达造血细胞表面标志CD14、CD34或CD45，不表达Ⅱ类组织相容性抗原HLA-DR及内皮细胞标志CD31，不表达共刺激因子B7-1（CD80）、B7-2（CD86）和CD40。ADSCs表面标记物会随着培养时间的延长而有所改变。早期原代培养的ADSCs(也称为stromalvascularfraction,SVF)中存在造血干细胞以及内皮祖细胞的标志分子，如：CD11a、CD14、CD45、CD86、HLA-DR。自第2代以后，ADSCs均匀一致地表达间充质干细胞特有标记：CD13、CD29、CD44、CD73、CD90，这可能与原代培养的ADSCs含有多种细胞成分有关[7-8]。人ADSCs不表达MHC2Ⅱ类分子和B7-1（CD80）、B7-2（CD86）和CD40等共刺激分子，这些分子是效应性T细胞激活所必需的，共刺激分子的缺乏，使得T细胞活化的第二信号丧失，导致Th细胞的无反应性而促成免疫耐受，表现出低免疫原性。2ADSCs向表皮细胞、成纤维细胞分化，促进创面皮肤再上皮化脂肪干细胞具有定向分化为组织修复所需要的终末分化细胞的能力，为组织修复以及构建组织工程皮肤提供充足的细胞来源。在体外将ADSCs定向诱导分化为表皮细胞的方法较多。雷永红等[9]采用皮肤匀浆液处理ADSCs，单独培养或与热休克损伤的HEKa细胞共培养，诱导rADSCs向表皮细胞定向分化表达CK10、CK14、CK19，其诱导分化效率高于单纯使用表皮生长因子EGF。王先成等[10]利用EGF以及维甲酸等成分诱导ADSCs分化，10天后细胞出现铺路石改变，细胞表达CK19。这与Brzoska等[11]的实验相一致，ADSCs在全反式维甲酸诱导作用下向上皮细胞分化，表达上皮细胞早期的表面标记-角蛋白CK18，不再表达波形蛋白（vimentin）等间充质干细胞标志。Ebrahimian[12]则是将ADSCs在角质细胞条件培养基中培养3周，发现ADSCs向角质形成细胞分化，表达K5和K14。干细胞在局部微环境的影响下定向诱导分化为创伤部位的靶细胞，该现象称为局部专一分化（site-specificdifferentiation）[13]。在体实验[14-15]以真皮基质或者蚕丝蛋白-壳聚糖支架（SFCS）作为载体，将GFP标记人ADSCs与之形成的复合物移植到裸鼠背部，移植后2周发现GFP-ADSCs分化为成纤维细胞，表达热休克蛋白HSP47；移植后4周GFP-ADSCs分化成表皮细胞，表达CK19。Nie等[16-18]利用脱细胞真皮支架作为载体或者采用创周皮内注射的方式将ADSCs应用于创面，发现ADSCs分化为表皮细胞，表达pan角蛋白、CK5和CK14。3向血管内皮细胞和平滑肌细胞分化，分泌促进血管生成因子Cao等[18]利用体外实验，将ADSCs在体外与VEGF共培养时可以表达血管内皮细胞ECs标志。雷永红[19]应用30%大鼠血管匀浆液诱导大鼠ADSCs3天，细胞向血管内皮细胞分化，表达CD34和血管性假血友病因子vWF。杨平等[20]应用TGF-β1、PDGF-BB体外诱导ADSCs，细胞呈现明显的血管平滑肌细胞VSMCs特性，表达血管平滑肌蛋白α-SMA、SM-MHC以及Calponin。体内实验将ADSCs直接或者以支架为载体应用到皮肤创面后，发现GFP-ADSCs向血管内皮细胞分化，表达SMA、vWF[14-15]或者CD31[16-17]。分泌血管原性生成因子如VEGF、HGF、FGF2、TGFβ3，促进肉芽组织生长和新生血管形成，增加血管密度，增加随意皮瓣的血流供应[21]，提高全厚皮肤移植的成活率[22]，促进生理性和病理性创面愈合。4旁分泌作用，增强组织修复单独使用ADSC分泌的细胞因子即条件培养液ADSC-CM有助于调节局部细胞对创伤的反应，促进创面愈合。皮肤损伤波及到脂肪组织时，会释放FGF-2，激活JNK通路，促进ADSCs增殖和分泌，促进血管形成以及促进细胞分裂，促进组织再生，减轻组织纤维化[23]。ADSCs[24-25]可以分泌大量促进血管生成和抗凋亡的细胞因子：VEGF，粒系/巨噬细胞系集落刺激因子M-CSF，基质来源因子SDF-1α，HGF，IGF-1，KGF以及FGF-2。ADSCs分泌产生KGF不受辐射的影响[12]。外源性的细胞因子对ADSCs的分泌功能具有一定的促进作用。TNF-α促进ADSCs分泌的IL-6和IL-8，在体内皮肤伤口模型加速伤口愈合、血管形成、增殖、免疫细胞浸润中起主要作用[26]。胰岛素[27-28]后的ADSCs-CM含有更高水平的VEGF和HGF，有效促进人血管内皮细胞增殖、迁移并抑制其凋亡，有利于组织血管化。动物创伤模型显示，ADSCs-CM中的TGF-β1[29]通过增加透明质酸酶HAS-1以及HAS-2表达，促进透明质酸合成；ADSCs-CM还可以上调细胞外基质Ⅰ、Ⅲ型胶原、纤连蛋白的mRNA水平，下调MMP-9的mRNA水平，增强HDF分泌Ⅰ型胶原，刺激胶原合成和成纤维细胞迁移，在体内促进伤口愈合。局部注射ADSCs到糖尿病缺血模型创面[30]，提高血浆和组织中VEGF的含量，明显缩小创面面积，局部新生血管增加，加快愈合速度，改善创面愈合后质量。Valerie等[31]利用ADSCs、自体角质形成细胞以及自体成纤维细胞或者新生儿包皮成纤维细胞构建组织工程皮肤，呈现表皮、真皮以及皮下组织三层结构，不需要任何合成的或者外源的支架材料，且这种三层结构的皮肤替代物可以分泌TGF-β、VEGF、KGF和bFGF，具有创伤修复更强的潜力。5促进细胞增殖和迁移作用ADSCs可以通过细胞接触或者旁分泌作用促进临近组织细胞的增殖和迁移，有效提高创面的愈合速度。Kim等[32]发现ADSCs通过共培养、transwell培养方式均可以促进人真皮成纤维细胞（HDF）增殖以及迁移；ADSCs经TGF-β1[33]处理后对皮肤成纤维细胞的迁移作用增强；胰岛素[28]则具有促进ADSCs对血管内皮细胞的迁移作用，增加新生血管形成；鼠源ADSCs与细胞直接接触共培养后促进人表皮角质细胞（HEKa）分裂增殖和迁移[34]。6低氧增强ADSCs的创面修复作用在影响ADSCs功能的众多因素中，周围环境中的氧气浓度特别是低氧环境发挥了重要作用。缺氧[35]通过活化ADSCs细胞膜的受体酪氨酸激酶，接着磷酸化细胞外信号调节激酶（ERK）以及Akt信号通路成员，缺氧诱导因子1a（HIF-1a）明显增加，ADSCs分泌更多抗凋亡和促进血管生成的生物活性物质：胰岛素样生长因子结合蛋白（IGFBP-1）、IGFBP-2、M-CSF、M-CSFR、血小板来源生长因子PDGFR-beta、VEGF、bFGF、HGF、IGF、瘦素leptin、血管生成素-2、Bcl2、BclxL，促进细胞生长，减少细胞凋亡。其中VEGF的转录是诱发血管生成级联反应的关键步骤。在20%、5%、1%氧浓度下，ADSCs分泌的VEGF的表达进行性增高。ADSCs具有向SDF-1迁移的能力，低氧可以上调ADSCs表面的SDF-1受体趋化因子受体CXCR4的表达，促进ADSCs的迁移；低氧还促进ADSCs的增殖，发挥再生潜力[36]。在低氧环境下培养的ADSC条件培养液hypoCM与正常氧浓度下的norCM相比较，VEGF和bFGF的mRNA和蛋白表达增加，促进胶原合成和真皮成纤维细胞迁移，加速创面愈合[37-38]。低氧环境下的ADSC-CM促进毛囊毛乳头细胞以及表皮角质形成细胞增殖，诱导毛发进入生长期，促进毛发再生[39]。7安全、无致瘤性ADSCs[40-41]在实验室中经过长期传代或冻存仍然保持干细胞特征，增殖分化能力无改变，仍可以保留其免疫原性，无明显的免疫学特性改变和分化倾向。陈光平等[42]研究证实ADSCs在体外进行增殖分化过程中，其端粒酶活性以及染色体核型未发生异常变化。ADSCs应用于皮肤伤口，局限于损伤局部，没有向全身扩散，不会影响机体远位肿瘤的扩大和恶化[43]。向免疫缺陷小鼠静脉内注射2.5×108细胞/kg体重，小鼠存活且无副作用。向Balb/c-nu裸鼠静脉内注射2.0×108细胞/kg体重，观察26周无肿瘤发生。在人体临床试验，向8名脊髓损伤超过12个月的男性患者单次注射4.0×108细胞，随访3个月无严重副作用发生。全身应用ADSCs显然是安全的，不会诱导肿瘤发生[44]。综上所述，ADSCs具有多向分化潜能，促进新生血管形成，加速创面愈合。相对于骨髓干细胞，ADSCs来源于低氧环境，有助于耐受细胞移植后短暂的营养匮乏期[45]。治疗所用的ADSCs来自患者自身的脂肪，因此，有望在不引起任何免疫排斥的情况下修复受损组织。ADSCs来源充足，易于分离，安全无致瘤性，是用于自体干细胞移植治疗的最佳细胞来源。8问题与展望既往ADSCs促进皮肤创面愈合的相关实验研究均采用的是同种异体或者异种ADSCs经过体外诱导或者纯化后,直接应用或者以各种支架为载体移植到创面，来观察ADSCs的治疗作用；创面模型均采用的是皮肤切除模型。目前,尚无将ADSCs应用到烧伤创面的相关实验报道,但是烧伤创面有别于皮肤切除，有着其独特的病理过程，烧伤创面的微环境与ADSCs的相互影响规律是什么？干细胞用于烧伤创面治疗的时机？转归如何？烧伤后，位于烧伤创面基底的脂肪组织中的大量的ADSCs，是否被启动参与到烧伤创面的修复中？相信随着ADSCs的基础和临床应用研究的不断深入，ADSCs必将成为皮肤创伤特别是烧伤创面修复的最佳细胞来源。[参考文献][1]ZukPA,ZhuM,AshjianP,etal.Humanadiposetissueisasourceofmultipotentstemcells[J].MolBiolCell,2002,13(12):4279-4295.[2]GurtnerGC,WernerS,BarrandonY,etal.Woundrepairandregeneration[J].Nature,2008,453:314-21.[3]ScherzedA,HackenbergS,FroelichK,etal.Theeffectofwoundfluidonadipose-derivedstemcellsinvitro:astudyinhumancellmaterials[J].TissueEngPartCMethods,2011,17(8):809-817.[4]GimbleJM,KatzAJ,BunnelBA.Adipose-derivedstemcellsforregenerativemedicine[J].CircRes,2007,100(9):1249-1260.[5]FraserJK,WulurI,AlfonsoZ,etal.Fattissue:anunderappreciatedsourceofstemcellsforbiotechnology[J].TrendsBiotechnol,2006,24:150-154.[6]GronthosS,FranklinDM,LeddyHA,etal.Surfaceproteincharacterizationofhumanadiposetissue-derivedstromalcells[J].JCellPhysiol,2001,189(1):54-63.[7]McIntoshK,ZvonicS,GarrettS,etal.TheImmunogenicityofHumanAdiposeDerivedCells:TemporalChangesInVitro[J].StemCells,2006,24:1246-1253.[8]MitchellJB,McintoshK,ZvonicS,etal.ImmunogenicityofHumanAdipose-DerivedCells:TemporalChangesInStromal-AssociatedandStemCell-AssociatedMarkers[J].StemCells,2006,24:376-385.[9]雷永红,付小兵,盛志勇,等.诱导脂肪干细胞向表皮细胞表型的转分化研究[J].中华整形外科杂志,2007,3(23):151-153.[10]王先成,乔群,管利东,等.人脂肪间充质干细胞生物学特征及向体外类角质细胞的分化[J].中国组织工程研究与临床康复,2007,11(37):7333-7336.[11]BrzoskaM,GeigerH,GauerS,etal.Epithelialdifferentiationofhumanadiposetissue-derivedadultstemcells[J].BiochemBiophysResCommun,2005,330:142-150.[12]EbrahimianTG,PouzouletF,SquibanC,etal.Celltherapybasedonadiposetissue-derivedstromalcellspromotesphysiologicalandpathologicalwoundhealing[J].ArteriosclerThrombVascBiol,2009,29(4):503-510.[13]LiechtyKW,MackenzieTC,ShaabanAF,etal.Humanmesenchymalstemcellsengraftanddemonstratesite-specificdifferentiationafterinuterotransplantationinsheep[J].NatMed,2000,6:1282-1286.[14]AltmanAM,MatthiasN,YanY,etal.Dermalmatrixasacarrierforinvivodeliveryofhumanadipose-derivedstemcells[J].Biomaterials,2008,29(10):1431-1442.[15]AltmanAM,YanY,MatthiasN,etal.IFATScollection:Humanadipose-derivedstemcellsseededonasilkfibroin-chitosanscaffoldenhancewoundrepairinamurinesofttissueinjurymodel[J].StemCells,2009,27(1):250-258.[16]NieC,YangD,MorrisSF.Localdeliveryofadipose-derivedstemcellsviaacellulardermalmatrixasascaffold:anewpromisingstrategytoacceleratewoundhealing[J].MedHypotheses,2009,72(6):679-682.[17]NieC,YangD,XuJ,etal.Locallyadministeredadipose-derivedstemcellsacceleratewoundhealingthroughdifferentiationandvasculogenesis[J].CellTransplant,2011,20(2):205-216.[18]CaoY,SunZ,LiaoLM,etal.Humanadiposetissue-derivedstemcellsdifferentiateintoendothelialcellsinvitroandimprovepostnatalneovascularizationinvivo[J].BiochemBiophysResCommun,2005,332:370-379.[19]雷永红，付小兵,盛志勇,等.诱导脂肪干细胞向血管内皮细胞分化的实验研究[J].中华外科杂志,2010,48(14):1106-1110.[20]杨平,尹烁,崔磊,等.脂肪干细胞向血管平滑肌细胞诱导的实验研究[J].中国修复重建外科杂志,2008,22(4):481-486.[21]LuF,MizunoH,UysalCA,etal.Improvedviabilityofrandompatternskinflapsthroughtheuseofadipose-derivedstemcells[J].PlastReconstrSurg,2008,121(1):50-58.[22]ZoqrafouA,TsiqrisC,PapadopoulosO,etal.Improvementofskin-graftsurvivalafterautologoustransplantationofadipose-derivedstemcellsinrats[J].JPlastReconstrAesthetSurg,2011,64(12):1647-1656.[23]SaqaH,EtoH,ShiqeuraT,etal.IFATSCollection:Fibroblastgrowthfactor-2-inducedhepatocytegrowthfactorsecretionbyadipose-derivedstromalcellsinhibitspostinjuryfibrogenesisthroughac-JunN-terminalkinase-dependentmechanism[J].StemCells,2009,27(1):238-249.[24]RehmanJ,TraktuevD,LiJ,etal.Secretionofangiogenicandantiapoptoticfactorsbyhumanadiposestromalcells[J].Circulation,2004,109:1292-1298.[25]MeligaE,StremBM,DuckersHJ,etal.Adipose-derivedcells[J].CellTransplant,2007,16(9):963-970.[26]HeoSC,JeonES,LeeIH,etal.Tumornecrosisfactor-a-activatedhumanadiposetissue-derivedmesenchymalstemcellsacceleratecutaneouswoundhealingthroughparacrinemechanisms[J].JInvestDermatol,2011,131(7):1559-1567.[27]折涛,胡大海,张彦刚,等.胰岛素干预后脂肪干细胞旁分泌对人血管内皮细胞的作用[J].中华烧伤杂志,2011,27(1):32-36.[28]折涛,胡大海,张军,等.胰岛素对脂肪干细胞旁分泌功能的影响[J].中华烧伤杂志,2009,25(4):268-271.[29]JungH,KimHH,LeeDH,etal.Transforminggrowthfactor-beta1inadiposederivedstemcellsconditionedmediumisadominantparacrinemediatordetermineshyaluronicacidandcollagenexpressionprofile[J].Cytotechnology,2011,63(1):57-66.[30]KimEK,LiG,LeeTJ,etal.Theeffectofhumanadipose-derivedstemcellsonhealingofischemicwoundsinadiabeticnudemousemodel[J].PlastReconstrSurg,2011,128(2):387-394.[31]TrottierV,Marceau-FortierG,GermainL,etal.IFATSCollection:UsingHumanAdipose-DrivedStem/StromalCellsfortheProductionofNewSkinSubstitutes[J].StemCells,2008,26(10):2713-2723.[32]KimWS,ParkBS,SungJH,etal.Woundhealingeffectofadipose-derivedstemcells:acriticalroleofsecretoryfactorsonhumandermalfibroblasts[J].JDermatolSci,2007,48(1):15-24.[33]ChoJW,KangMC,LeeKS.TGF-β1-treatedADSCs-CMpromotesexpressionoftype1collagenandMMP-1,migrationofhumanskinfibroblasts,andwoundhealinginvitroandinvivo[J].IntJMolMed,2010,26(6):901-906.[34]袁方,雷永红,付小兵,等.脂肪干细胞促进人表皮角质形成细胞创面模型愈合的研究[J].中华外科杂志,2008,10(46):1575-1579.[35]ZacharV,DurouxM,EmmersenJ,etal.Hypoxiaandadipose-derivedstemcell-basedtissueregenerationandengineering[J].ExpertOpinBiolTher,2011,11(6):775-786.[36]ThangarajahH,VialIN,ChangE,etal.IFATScollection:adiposestromalcellsadoptaproangiogenicphenotypeundertheinfluenceofhypoxia[J].StemCells,2009,27(1):266-274.[37]LeeEY,XiaY,KimWS,etal.Hypoxia-enhancedwound-healingfunctionofadipose-derivedstemcells:increaseinstemcellproliferationandup-regulationofVEGFandbFGF[J].WoundRepairRegen,2009,17(4):540-547.[38]ChungHM,WonCH,SungJH.Responsesofadipose-derivedstemcellsduringhypoxia:enhancedskin-regenerativepotential[J].ExpertOpinBiolTher,2009,9(12):1499-1508