生物化学-蛋白质

蛋白质一、蛋白质的一般特性（一）含量：细胞干重一半（二）作用（三）相对分子质量：6000~6000000（四）元素组成：CHONSN含量平均：16%。可通过测量N，估算蛋白质的含量。二、氨基酸（一）氨基酸的结构和类型1.α-氨基酸的结构和旋光性氨基酸：至少含有一个氨基和一个羧基的有机小分子。组成蛋白质的氨基酸：α-氨基酸甘氨酸不具有旋光性，其余氨基酸具有旋光性。蛋白质中的氨基酸几乎都是L-氨基酸2.氨基酸类型蛋白质氨基酸：30多种（常见的20种）非蛋白质氨基酸：β、Γ、δ氨基酸，D-型氨基酸，如鸟氨酸、瓜氨酸、γ-氨基丁酸、β-丙氨酸等。疏水性：远离水相。膜中暴露。位于蛋白质的角落，使其易于折叠。亲水性：暴露在大分子表面与水接触。形成--s-s-键（二）氨基酸的酸碱性质和等电点

1.氨基酸的酸碱性质两性电解质2.氨基酸的等电点调节溶液的PH可使氨基酸表现出各种带电形式当溶液在某特定的pH时，氨基酸主要以两性离子形式存在，在溶液中所带的净电荷为零，即一个氨基酸所带正电荷与负电荷数相同，这时虽在电场作用下，它也不会向正极或负极移动，这时溶液的pH值称为该氨基酸的等电点，常用pI表示。每一种氨基酸都有特定的pl。等电点pI等于电中性状态的两性离子两侧pK值的平均值。酸性氨基酸的pI<7，碱性氨基酸的pI>7，其他氨基酸的pl<7但很接近于7。（三）氨基酸的分离和分析鉴定1.依据各种氨基酸在水中和在其他某种溶剂中有不同溶解度为原理的两种方法（1）纸层析法（2）薄层层析法先将样品点在滤纸一端距纸边约2～3厘米处，然后将点有样品的一端浸入某一有机溶剂系统中，不没及样品，经毛细管作用使溶剂从纸的一端流向另一端，样品中的混合物也得以分离，滤纸干后再以适当显色剂显色或在紫外灯下观察所得的层析图谱，加以鉴定。将纤维素、硅胶、氧化铝或聚酰胺等之一作为支持剂涂布在玻璃或其他载体上制成均匀的薄层，然后将被分析的样品滴加到薄层的一端上，再用适当的溶剂展开就可使样品得以分离（图1-15）。2.依据各种氨基酸有不同等电点为原理的三种方法（1）离子交换柱层析法离子交换树脂：是带有官能团（有交换离子的活性基团）、具有网状结构、不溶性的高分子化合物。调节相应氨基酸溶液的pH值，使相应氨基酸呈阳离子或阴离子，再选用阳离子交换树脂或阴离子交换树脂进行离子交换层析而分离得到相应的氨基酸。阳离子交换树脂阴离子交换树脂（2）沉淀法调节溶液pH值等于某种氨基酸的pI时，该氨基酸会由于静电引力的作用，溶解度最小，容易发生沉淀。（3）电泳法处于一定pH溶液中的不同氨基酸分子，其正、负电荷量和相对分子质量是不相同的，因而在一定电场强度下的电场中向相反电极移动的速度不同而得到分离和提纯。茚三酮反应测定氨基酸的含量原理:含有α-氨基的化合物与茚三酮反应生成紫色。通过比色法可以定量测定氨基酸含量。但是脯氨酸与之反应生成亮黄色化合物。三、二肽和多肽氨基酸残基α羧基C端α氨基N端有双键性质，不可旋转。四、蛋白质（一）蛋白质的空间结构按构象分纤维蛋白（结构蛋白）：二级或超二级结构球蛋白（功能蛋白）：三级或四级结构1.蛋白质的一级结构多肽链中氨基酸的数目、种类和排列顺序，多肽链的数目，多肽链之间的连接方式和连接部位，二硫键的数目和位置.一级结构：肽键、二硫键2.蛋白质的二级结构指蛋白质分子中的肽链向单一方向卷曲而形成的有周期性重复的主体结构或构象。二级结构：氢键类型：α螺旋、β折叠（1）α螺旋3.6个氨基酸残基右手螺旋居多螺距0.54nm（2）β-折叠并列的比α螺旋更为伸展的肽链，互相以氢键连接起来而成片层状的结构。肽链比较伸展，弹性较差。（3）β-转角和不规则卷曲β转角：使多肽链发生180°的回折。不规则卷曲：使一种没有规律的松散肽链结构。酶的功能部位常常位于这种构象区域里。3.超二级结构和结构域蛋白质二级结构和三级结构的过渡态。（1）超二级结构二级结构组合体，但没有结构域。几种超二级结构胶原蛋白弹性蛋白角蛋白胶原蛋白脊椎动物中最多、最普遍的蛋白质普遍存在于结缔组织、真皮、腱、韧带、骨及软骨、血管壁、角膜等处的细胞外基质中。每条肽链是α左手螺旋3条α-螺旋共价相连，形成右手螺旋。原胶原分子原胶纤维共价键随着动物年龄的增长，肽链间的共价键数目增加，使胶原纤维越来越硬而脆，结果改变了结缔组织的机械性能。·弹性蛋白缺乏规则的二级结构，更不形成超螺旋，但含有各种各样的不规则卷曲。当施加张力时，卷曲可以拉伸;张力除去后，卷曲又可复原，因此弹性蛋白有弹性。·角蛋白a-角蛋白（呈α-螺旋的纤维蛋白）：指甲，毛发。有蹄类蹄，角，羊毛。毛发：3条α右手螺旋

→左手螺旋初原纤维→微原纤维（9+2式）→纤维束β-角蛋白（呈β-折叠）:存在于蚕丝，蛛丝。鸟类和爬行类的羽毛和皮肤。（2）结构域结构域(domain)是位于超二级结构和三级结构间的一个层次。多肽链上相邻的超二级结构紧密联系，进一步折叠形成一个或多个相对独立的致密三维实体，即结构域。结构域有独特的空间构象，并承担不同的生物学功能。对于较小的蛋白质分子或亚基来说，结构域和它的三级结构往往是一个意思。3.蛋白质的三级结构相关化学键：氢键，疏水键，盐键，二硫键，范德华力球蛋白的三级结构表明，一条多肽往往是由一部分α-螺旋和一部分β-折叠，通过β-转角成不规则卷曲连接，紧密折叠成球状的结构。表面富含亲水基团，易溶于水，所以能发挥各自的作用。含Fe的色素功能蛋白至少需要几级结构？肌红蛋白三级结构5.蛋白质的四级结构两个以上的肽链，以弱键连接，形成一定的构象，就是四级结构。化学键：离子键（盐键）、疏水键、氢键、范德华力等次级键（即非共价键，又称弱键）血红蛋白的四级结构①4条肽链②每条肽链都是一个三级结构的球蛋白。并各带一个血红素基团。③四条肽链挤在一起形成一定构象。（二）蛋白质的理化性质1.蛋白质是两性电解质2.蛋白质是高分子化合物，在水中呈胶体3.蛋白质沉淀4.蛋白质的变构和变性1.蛋白质是是两性电解质

蛋白质分子的每条多肽链，至少含有一个氨基和一个狻基，所以蛋白质是两性电解质每种蛋白质都有特定的pI值。蛋白质混合液中，各蛋白质的pI和相对分子质量大小不同，所以在同一pH溶液及同一电场强度中，它们的移动速度是不相等的。根据这一原理就可以用电泳法使混合的蛋白质得到分离。2.蛋白质是高分子化合物，在水中呈胶体蛋白质是大分子、外带有水化膜、具有同性电荷，因而在水中能形成稳定的胶体。

蛋白质分子在pH不等于其pI的任何溶液中都是带同性电荷的。等电点时更容易沉淀3.蛋白质沉淀①盐析

高浓度盐离子的水化作用，使蛋白质分子除去水化膜则凝聚沉淀的过程，叫盐析。不同的蛋白质盐析时所需盐类浓度不同，因此可以用逐渐加大盐溶液浓度的方法使不同蛋白质分段析出加以分离，这种操作称为分段盐析。②加入亲水力强的有机溶剂

酒精、丙酮等有机溶剂对水的亲和力很大，因此亦能破坏蛋白质的水膜。如果在等电点时加入这些有机溶剂即可使蛋白质沉淀析出。③加人可与蛋白质结合成不溶解的化合物的物质重金属离子酸根（不变性）（变性）（温度高则变性）4.蛋白质的变构和变性（1）变构蛋白质与效应物的结合引起整个蛋白质分子构象发生改变的现象就称为蛋白质的变构作用，又称别构作用。（只涉及非共价键的断裂，是可逆的）（2）变性蛋白质分子的空间结构发生改变和破坏从而丧失生物活性的现象叫变性。一级结构不变，破坏二级结构以上的结构，即氢键等次级键部分或全部断裂。溶解度降低，易沉淀（内部的疏水基团暴露）；失去结晶能力；肽链松散，易被水解；辅酶脱离。蛋白质复性：如果不过于剧烈，变性后的蛋白质可以在一定的条件下恢复其生物活性。②致变因素高温、振荡、搅拌、超声波、X射线、紫外线;重金属离子、强酸、强碱、尿素，去污剂以及酒精、丙酮等有机溶剂等。（三）蛋白质的分类化学分类简单蛋白结合蛋白(有非蛋白部分)功能分类结构蛋白功能蛋白（四）蛋白质的颜色反应1.双缩脲反应肽键在碱性溶液中与硫酸铜反应形成红紫色络合物。2.酚试剂（福林试剂）反应酪氨酸中的酚基，与磷钼酸及磷钨酸反应生成蓝色化合物。用于比色法定量测定蛋白质含量。3.米伦氏反应米伦氏试剂为硝酸汞、亚硝酸汞、硝酸和亚硝酸的混合液。含有酪氨酸残基的蛋白质遇米伦试剂产生白色沉淀，加热后沉淀变成红色。4.乙醛酸反应含有色氨酸残基的蛋白质溶液加入乙醛酸混匀后,徐徐加入浓硫酸,在两液接触面处呈现紫红色环.吲哚基5.蛋白质遇碘呈黄色。（五）蛋白质的相对分子质量测定凝胶过滤层析SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳超速离心法质谱法凝胶过滤层析：

凝胶过滤层析是利用具有多孔网状结构的颗粒的分子筛作用，根据被分离样品中各组分相对分子质量大小的差异进行洗脱分离的一项技术。

在分子筛（凝胶过滤）层析中，小分子物质可进入凝胶颗粒的孔洞中，流经路程长，所以流出慢；大分子不能进入凝胶，所以流经路程短，流出快。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(简称SDS—PAGE)

根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条区带。

SDS是一种阴离子表面活性剂，能打断蛋白质的非共价键，并按一定的比例和蛋白质分子结合形成密度相同的短棒状复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，