第九章-细菌类疫苗总结

1第九章细菌类疫苗2细菌类疫苗定义：用细菌、支原体、螺旋体或其衍生物制成，进入人体后使机体产生抵抗相应细菌能力的生物制品——细菌类疫苗种类：（1）减毒活疫苗（2）灭活疫苗（3）亚单位疫苗或成分疫苗第一节概述3（3）亚单位疫苗或成分疫苗主要指在细菌培养液中提取，用化学方法脱毒的类毒素，如破伤风类毒素、白喉类毒素。成分疫苗：主要指从荚膜细菌纯化的细菌多糖疫苗，其诱导机体产生的抗体可抵抗荚膜菌的感染。4附表：目前用于人群的细菌性疫苗卡介苗百日咳疫苗脑膜炎球菌疫苗伤寒疫苗精制破伤风疫苗（类毒素）霍乱弧菌疫苗痢疾疫苗用法：i.d.,s.c.,d.s.,i.m.,p.o.5基本流程菌液佐剂+乳化分装和保存原料配置灭活菌液灭活第二节细菌灭活疫苗6灭活疫苗的生产工艺与检定菌种检定与制备1）菌种检定：包括培养特性、血清学特性、毒力试验、抗原性试验、免疫力试验制苗用菌种多数为毒力强、免疫原性优良的菌株，通常使用1-3个品系，均由中国药品生物制品检定所或中国兽药监察所传代、鉴定、冻干保存和供应。各种用于制造菌苗的菌种应按规定定期复壮，并进行形态、培养特性、菌型、抗原性和免疫原性鉴定，合格菌种准许用于制苗。7灭活疫苗的生产工艺与检定菌种检定与制备2）菌种制备菌种启开：接种于适宜的培养基上，37±1°C一代培养；扩量转种：一代菌种的扩量接种，于37±1°C二代培养。将经鉴定符合标准的菌种接种于菌苗生产规程中所规定的培养基进行增殖培养，经纯粹检查、活菌计数达到标准后即为种子液，用于菌苗生产。种子液通常保存于2-8

C冷暗处，不得超过规程规定的使用期限。82.生产方法（1）固体培养法：克氏瓶、茄形瓶（2）液体静置培养法、液体深层通气培养法3.细菌采集（1）固体培养法采集时逐瓶检查，污染杂菌者废弃。（2）液体培养法采集时应做纯菌试验，确定无杂菌生长。94.杀菌、脱毒（灭活）杀菌剂对疫苗的质量至关重要，通常根据细菌的特性加入最有效的灭活剂，我国多用甲醛，终浓度不超过1%。杀菌检查：取样接种于不含琼脂的硫乙醇酸盐培养基、琼脂斜面及碱性琼脂斜面各一支，37℃培养5d，应无本菌生长。表几种灭活菌苗的灭活方法

105浓缩

为提高某些灭活菌苗的免疫力，在培养过程中采取提高菌数的基础上，再通过浓缩方法达到目的。

常用的浓缩方法：氢氧化铝胶吸附沉淀法离心沉降法羧甲基纤维沉淀法

以上方法可使菌液浓缩一倍以上。

此外，有些细菌在生长过程中产生分子量小的可溶性抗原（如猪丹毒杆菌产生的糖蛋白）也可经氢氧化铝吸附浓缩；将破伤风脱毒液按盐酸—食盐法处理，以作进一步精制成提纯破伤风类毒素。116.原液检定及保存：浓度测定：按“中国细菌浊度测定标准”测定浓度镜检：涂片染色，至少观察10个视野，应菌型典型，无杂菌凝集试验：血清型定型凝集试验，应呈阳性反应无菌试验:需氧菌、厌氧菌及真菌试验应阴性免疫力试验：原液保存：（2-8℃，3-4年有效）127.配苗及分装由于灭活菌苗所用的佐剂不同，所以配苗方法也不相同。

氢氧化铝菌苗：可在加入甲醛灭活的同时，按比例加入氢氧化铝胶配制；也可在菌液经甲醛灭活后再按比例加入氢氧化铝胶配苗。有的厂油佐剂菌苗的配制程序为：于灭菌的油乳剂135m110号白油、11.4m1Span-85、3.6mlTween80混合液中，在边搅拌下加入等量甲醛灭活菌液配制。配苗和分装：应充分混匀，及时塞塞、贴签或印字8.成品检定按规程进行13常用灭活细菌疫苗1.霍乱疫苗（1）霍乱简介由霍乱弧菌引起的烈性肠道传染病，霍乱弧菌在小肠分泌霍乱毒素（choleratoxin），引起腹泻及其他症状。（2）抗原鞭毛抗原：不耐热，无分型意义，有免疫保护作用。菌体抗原：主要成分为脂多糖（LPS），耐热，根据其抗原决定基可分为200多钟血清型，O1和O139为流行血清型。14（3）目前最常用的霍乱疫苗口服霍乱灭活全菌体+重组霍乱毒素B亚单位重组霍乱毒素B亚单位（sBS）具有黏膜免疫佐剂特性，该疫苗安全有效且无明显不良反应，保护力持久。152.伤寒疫苗（1）概述由伤寒沙门杆菌引起的急性全身感染，患者出现高热，胃肠炎，败血症等。含有三类抗原:LPS，荚膜多糖(vi)，鞭毛抗原，耐药性比较严重。（2）生产工艺与检定全菌体死疫苗分三种，按杀菌剂不同可分为丙酮灭活苗，加温加酚灭活苗，甲醛灭活苗。16①菌株我国现用两个菌株生产疫苗：国际通用Ty2株国内代表株②培养基及培养方法采用马丁琼脂、肉汤琼脂或其他经批准的培养基，主要采用固体培养法，也可进行发酵生产接种后35~37℃培养18~24h。17③成品检定鉴别试验、外观、化学检定、无菌试验、异常毒性试验、菌形及纯度检查④疫苗规格及有效期每安瓿瓶5ml，每人用剂量含伤寒菌6×107~3×108，2~8℃避光保存和运输，有效期1.5年。18（3）伤寒Vi多糖疫苗早期乙酸处理Vi多糖，抗原性明显降低，经溴化-16-烷基-3-甲基氨处理Vi多糖，得到的非变性多糖可显示较好的免疫原性，但是对2岁以下儿童无效，且多糖是T淋巴细胞非依赖性抗原，不具有加强免疫记忆的作用，蛋白质-Vi多糖结合疫苗正在研制当中。莢膜（Vi）抗原:即荚膜多糖（CPS）,是伤寒杆菌细胞外壁的一种荚膜抗原,Vi抗原与其致病性有关Vi来源于毒力的缩写。19（4）伤寒Ty21a口服减毒活疫苗德国学者将野生型菌株Ty2经化学突变剂亚硝基胍处理而获得的突变株，在提供较高免疫保力的同时具有很高的安全性。203.百日咳疫苗1）概述由百日咳杆菌引起的急性呼吸道传染病，主要侵犯婴幼儿，全病程较长，可持续几个月，故名百日咳。百日咳菌可分四种相变：Ⅰ相菌毒力最强，有免疫原性；Ⅳ相毒力消失，无免疫原性；Ⅱ、Ⅲ相菌介于Ⅰ、Ⅳ之间。222）百日咳死疫苗的生产工艺与检定①菌种生产用菌种采用百日咳Ⅰ相含1型、2型、和3型凝集原的菌株。②培养方法固体培养采用半综合碳琼脂培养基，也可发酵生产。23③原液检定浓度测定、镜检、血清学试验、无菌试验、特异性毒性试验、效价测定。④原液保存2~8℃，有效期3年⑤配合稀释及分装按原液中具有1、2和3型菌株的配比混合，也可制成百白破三联疫苗（百日咳、白喉、破伤风）24弱毒菌种多系冻干品，由中国药品生物制品检定所或中国兽药监察所传代、鉴定、保存与分发，少数由国家指定单位鉴定、保存与供给。菌种使用前应按规程规定进行复壮、挑选，并作形态、特性、抗原性和免疫原性鉴定，符合标准后方可用于制苗。将检定合格的菌种接种子于规定的培养基，按规定的条件增殖培养，经纯粹检查及有关的检查合格者即可作为种子液。种子液通常在0～4

C可保存2个月，在保存期内可作为菌苗生产的批量种子使用。第三节细菌减毒活疫苗

一、生产工艺与检定（一）菌种与种子25按1%～3%量将种子液接种于培养基，然后依不同菌苗要求进行培养。如猪丹毒弱毒菌须在在深层通气培养中加入适当植物油作消泡剂，通入过滤除菌的热空气进行培养制造菌液如人用炭疽活疫苗、卡介苗经固体表面培养完成后须按规定要求将菌苔洗下制成菌液菌液于0～4

C暗处保存，待抽样经纯粹、活菌数等检查合格后使用。（二）菌液培养26

经检验合格的菌液，按规定比例加入保护剂配苗，充分摇匀后随即进行分装，分装量必须准确。分装好的菌苗迅速送入冻干柜进行预冻、真空干燥，冻于完毕后立即加塞、抽空、封口，移入冷库保存，并由质检部门抽样检验。

（四）配苗与冻干

为提高某些弱毒菌苗的免疫效果，可进行浓缩，以提高单位活菌数，常用的依缩方法有吸附剂吸附沉降法、离心沉降法等，如于猪丹毒菌液内加入0.2%～0.25%羧甲基纤维素(CMC)进行浓缩，也可用离心沉淀浓缩。浓缩菌液应抽样作纯粹、活菌数等检查。（三）浓缩27流程图1——细菌疫苗制造工艺流程蛋白质、肉浸液等原料培养基细菌分离菌种弱毒菌种配置、灭菌鉴定减毒检验配制灭菌检验配制灭菌原料佐剂灭活菌液配苗、乳化灭活疫苗培养菌苗原液配苗活疫苗保护剂菌液分装、冻干分装灭活原料活化种子2829二、常用细菌减毒活疫苗

炭疽疫苗

结核疫苗

鼠疫疫苗1、炭疽疫苗1）概述：定义：由炭疽杆菌引起的人畜共患的一种急性传染病。特点：潜伏期3-5d。临床表现为皮肤、肺部、脑膜和肠道等处的急性感染。临床分型：①体表感染型②消化道感染型③呼吸道感染型30

2）炭疽菌的病原学①革兰氏阳性，个体最大的杆菌之一，呈竹节状，无鞭毛，在机体内或特殊培养条件下能形成荚膜。②营养要求不严，需氧，最适温度34~37℃炭疽杆菌的营养细胞抵抗力不强，芽孢抵抗力强，过氧乙酸、高锰酸钾、和甲醛对芽孢的杀灭力较强。31③抗原菌体抗原：多糖组分，耐热性强。荚膜抗原：由质粒决定，可以抵抗细胞的吞噬作用，引起感染，对动物没有免疫保护力，不能作为疫苗。毒素抗原：水肿因子（EF）；致死因子（LF）；保护性抗原（PA）；单独组分无毒性，成对结合才能获得毒素活性。323）炭疽疫苗（1）目前人用炭疽疫苗①减毒活疫苗②铝胶培养上清液疫苗（2）炭疽疫苗的生产工艺与检定①生产用菌株人、兽用的炭疽活疫苗生产均采用无荚膜具毒素（cap-tox+）菌株，我国采用的的A16R菌种均由药品生物制品检定所分发。33②培养及收获生产用培养基采用牛肉汁琼脂或其他批准培养基③半成品配置及分装用灭菌的50%甘油将原液稀释成每ml含菌数4×109④成品检定鉴别试验、外观、纯菌试验、特异性毒性试验活菌数测定、浓度测定、效力测定34⑤疫苗规格及有效期安瓿瓶装，10人份含菌2×109，2~8℃避光保存运输，有效期两年。（3）目前人用炭疽疫苗的缺点①毒力不稳定②采用划痕接种，免疫效果不均一③副反应较大④免疫保护力持续时间比较短352、结核疫苗病原菌为结核杆菌，能引起人畜共患结核病（1）流行概况全世界约1/3人口感染；每年约1600万人患病，其中300多万人死于结核病。中国治疗难题：①发现率低；②无法接受正规治疗或没钱治疗；③耐药性36（2）传染与传播方式主要由呼吸道传染，少数由消化道和皮肤粘膜的损伤处侵入。传播方式：①飞沫传染②痰液传染③食物传染④接触传染37（3）结核杆菌的潜伏和复燃结核杆菌类脂质等成分能对抗溶酶体中酶的破坏作用，使细菌在巨噬细胞内繁殖，导致巨噬细胞裂解死亡，病状扩散至邻近淋巴结，形成原发感染灶，当机体抗感染力较强时，淋巴结病灶逐渐纤维化和钙化，此时病灶内的结核杆菌处于休眠期，并潜伏下来，几年或十几年后，结合杆菌可以重新复燃，引起成年人肺结核。38（4）结合杆菌抗药性伴随着结核病回升的另外一个问题是抗药性的产生，多重抗药性的发生率也越来越高，研制和开发有效的结合新疫苗势在必行。392）结核杆菌的病原学①革兰氏阳性，含分枝酸，具有抗酸性，胞壁含大量脂质，有较强的抵抗力②灭菌方法③具有免疫佐剂活性403）结核疫苗——卡介苗的生产工艺与检定卡介苗（BCG）是牛型结合杆菌经培养后，收集菌体，加入稳定剂冻干后制成的，用于预防结核病①菌种卡介菌D2PB302菌株②培养和收集生产用培养基采用苏通马铃薯培养基、胆汁马铃薯培样基或液体苏通培养基，搜集菌膜压干，低温研磨，加入稳定剂，制成原液。41③半成品配置及冻干用特定的保护剂稀释成半成品，无菌分装到安瓿瓶内④成品检定鉴别试验、外观、溶解时间、水分、纯菌试验、无有毒分枝杆菌试验、活菌计数、效力测定⑤疫苗规格及有效期10人份含卡介菌0.4~0.6mg，2~8℃避光保存运输，有效期一年。42（4）新型结核疫苗的研究方向①以BCG为载体的基因工程结核疫苗②营养缺陷型结核减毒活疫苗（牛型/人型）③结核亚单位疫苗④结核DNA疫苗3、鼠疫疫苗（1）概述：鼠疫是由鼠疫杆菌引起的自然疫源性烈性传染病。主要以“鼠→蚤→人”为主要传播方式。43（2）鼠疫杆菌的病原学①鼠疫杆菌属肠杆菌科，耶尔森氏菌属。革兰染色阴性短小杆菌。有荚膜，无鞭毛，无芽胞。②抗原和免疫原性44（3）鼠疫疫苗的生产工艺与检定①菌种：采用鼠疫杆菌弱毒菌株EV株②培养及收获：培养基：厚金格尔琼脂培养基（pH6.8~7.2）肉眼检查及纯菌试验合格方可收获。③半成品配制及冻干细菌比浊标准调整原液浓度，加冻干保护剂，分装。④成品检定：鉴别试验、理化实验、纯菌试验、特异性毒性试验、活菌数测定、浓度测定、菌形检查、效力测定⑤疫苗规格及效期10人份含菌8×109，2~8℃避光保存运输，有效期一年。45第四节类毒素疫苗一、概述类毒素是一种主动免疫制剂，用于细菌毒素性疾病的预防。461.有关毒素的几个概念①细菌毒素：致病细菌产生的特异性毒性物质②外毒素：细菌在生长过程中产生，可扩散或自溶后释放到菌体外③内毒素：菌体细胞壁的结构成分，生存时不释放，死亡后释放至外界④类毒素：外毒素经处理后去除毒性但仍保留免疫原性472.细菌外毒素的特性1）毒性强2）亲组织性3）抗原性4）双组分结构蛋白质483.类毒素的生产1）产毒人工培养产毒细菌获得毒素①菌种产毒力强、稳定②产毒培养基49培养基应符合下面几个方面的要求（1）能提供产毒必要的成分（2）能调节影响产毒诸因素的平衡（3）能缓解对产毒有害物质的作用（4）能保护已经产生的毒素（5）不能含有对人有害或引起过敏反应的物质50③培养方法根据菌种的特性与具体的实验来决定2）脱毒影响因素：温度、pH、甲醛浓度、毒素3）精制适用于规模化生产，条件温和，避免对抗原的损伤514.毒性逆转及其相关因素毒素类毒化后仍有毒性逆转的可能，与毒性逆转有关的因素有：①稀释②脱毒条件③小分子物质的影响52二、常用细菌类毒素疫苗1.白喉类毒素1）概述由白喉杆菌引起的急性呼吸道传染病，产生外毒素引起局部炎症及组织坏死532）白喉杆菌的病原学（1）形态及生活习性：革兰氏阳性棒状杆菌，需氧或兼性厌氧，抵抗力较弱（2）分型：重型、中间型、轻型，流行中的多为轻型，引起的症状最轻（3）白喉毒素（Diphtheriatoxin）的分子结构及致病机制543）白喉类毒素的生产工艺与检定（1）生产工艺①菌株：PW8或由其筛选得到②产毒培养基：氮源、能源、生长因子、无机离子③培养：严格控制杂菌污染④精制：硫酸铵、活性炭分段盐析法或其他适宜方法⑤脱毒：甲醛脱毒后进行脱毒检查⑥吸附精制白喉类毒素：以Al（OH）3吸附剂为免疫佐剂55（2）白喉类毒素的检定①鉴别试验②外观③化学检定④安全试验⑤保护力试验562.破伤风类毒素1）概