基于脂蛋白纳米载体的小干扰RNA靶向递送方法研究毕业设计

(此文档为word格式，下载后您可任意编辑修改！)基于脂蛋白纳米载体的小干扰RNA靶向递送方法研究摘要RNA干扰作为一种治疗途径特别是恶性肿瘤的治疗具有巨大潜力。然而，系统递送siRNA需要高效和生物相容性的递送手段。肿瘤细胞通过过度表达清道夫B型1受体类(SR-B1)受体以清除HDL(HDL)粒子来维持其高生长水平。本文运用这种细胞特性来实现高效siRNA递送，通过siRNA偶联重组成HDL(rHDL)纳米粒子建立一种新型的siRNA制剂。这里,我们证实rHDL纳米粒子促进了siRNA体内高效递送。此外，概念证明治疗研究中,这些纳米粒可以有效沉默两种蛋白的表达，在原位卵巢和结肠直肠癌小鼠模型中，这两种蛋白是癌症生长和转移的关键(信号传感器和转录激活因子3以及粘着斑激酶)。这些数据表白，rHDL纳米粒是一种新型、高效的siRNA载体，因此。这种新型技术可以作为新型癌症治疗方法的基础。介绍RNA干扰（RNAi）逐渐被认为是一种潜在，高效的治疗途径。这个概念根源于干扰RNA（例如，小分子干扰RNA）基因沉默的能力，传统治疗方法很难靶向这些基因，如抗体或小分子克制剂。即使干扰RNA靶向特定基因的确很有前景的，但需要体内高效和生物相容性的siRNA递送手段来实现其完整的治疗潜力。虽然一些使用脂质体或其它纳米粒子的跨膜转运方法也已经报道，但是因毒性和其他因素其治疗应用受到限制。因此，需要新型，更具有特定性的方法以系统递送siRNA。脂蛋白，特别是HDL，是脂质运送系统的必要成分。HDL在胆固醇逆转中起着举足轻重的作用，通过促进外周细胞多余胆固醇返回到肝脏进行消除（胆汁排泄或在肝肠循环使用）。关于内源性，HDL纳米粒是完全可生物降解的，并且也无引起免疫反映的相关报道。此外，众所周知，HDL纳米粒可以逃避网状内皮系统的吸取，比大多数药物制剂或其他脂蛋白，他们在循环中表现出更长的滞留时间。HDL纳米粒循环的核心部分就是摄取，通过清道夫受体B类1型（SR-B1）受体介导的机制，这种受体重要表达在肝脏和恶性肿瘤细胞。基于体积小，屏蔽疏水核心，受体介导的摄取能力等这些有效特性，HDL纳米粒是一种抱负的药物载体。重组HDL是由人的HDL合成得到的。该rHDL纳米粒的组成部分有磷脂酰胆碱，载脂蛋白A-1，胆固醇和胆甾醇酯（图1A）。rHDL纳米粒都很小，直径约12至18纳米。为了研究siRNA靶向输送途径，一些肿瘤细胞受体已被获知。SR-B1受体重要在肝脏中的表达，也在肾上腺或正常卵巢组织也较小限度表达。然而，在恶性肿瘤细胞中SR-B1非常显著表达。增长HDL摄取可使肿瘤细胞产生较高增殖率。例如，乳腺癌细胞通过增长SR-B1的表达来增长胆固醇酯的摄取。因此，考虑到SR-B1在HDL中的作用，我们认为rHDL纳米粒可以作为选择性输送的有效载体。siRNA基因沉默治疗非常有效，其他方法很难靶向这些基因。信号传感器和转录激活因子3[STAT3]都可以介导正常细胞对多种细胞因子和生长因子的反映。激活STAT3是恶性肿瘤转化和发展（例如，细胞增殖，分化和存活）的关键过程。虽然STAT3可以在许多实体瘤里激活，但是它在正常组织中表达，并且参与许多正常细胞过程。因此，使用小分子克制剂或其他非特异性靶向STAT3的手段也许会导致许多不必要的副作用，因此需要有效途径限制毒性。同样，粘着斑激酶（FAK）对于肿瘤细胞存活，转移，入侵也非常重要。在卵巢癌患者中，FAK过度表达与侵袭性肿瘤的特性相关，这有助于弱势细胞生存。概念证明，我们在卵巢癌和大肠癌模型中证实使用rHDL纳米粒靶向STAT3和FAK治疗有效性。原料与方法rHDL纳米粒的制备和siRNA的偶联siRNA偶联到rHDL纳米粒，并储存在-20°C。简朴地说，载脂蛋白A-I，是rHDL纳米粒的重要核蛋白，在生产蛋白过程中用质粒载体进行分离和纯化。然后，脂类混合物（胆固醇[C]胆固醇油酸[CE]蛋黄卵磷脂[PC]，摩尔比的1:5:1.3:115）在氮气流中干燥。5mg的siRNA用25μg低聚赖氨酸（平均分子量为500-2023）在30℃预先孵育30分钟，然后加入到脂质成分中。低聚赖氨酸siRNA混合物偶联脂质，分散在60μl的DMSO和1.4ml的缓冲液（10mMTris，0.1MKCl，1mMpH为8.0的EDTA）。胆酸钠，140μL（100mgml溶于为PBS）形成的蛋黄卵磷脂摩和胆酸的摩尔比为1:1.6。载脂蛋白A-I（12.7mgml）溶于0.4mlPBS加入到混合物中，终体积用PBS调整到2ml。4℃孵育12h，接着用2L透射电子显微镜法在0.125M乙酸铵，2.6mM的碳酸铵，0.26mM的EDTA，pH值7.4中透析后，rHDL样品用pH值7.2的2％磷钨酸钠并放在福尔瓦200目镍网支持膜包裹的碳涂层进行负染。颗粒明显可见（放大50000倍），通过使用Zeiss910透射型电子显微镜。得到的图片有所增强，粒径可通过AdobeImageCS2软件检测。细胞系和培养条件衍生和源于人体上皮卵巢癌细胞系的HeyA8，SKOV3ip1，HeyA8-MDR细胞系在之前已有研究。人类大肠癌细胞株(HCT116)对于DrLeeEllis。本篇文章中所用到所有细胞株都是德克萨斯大学MD安德森癌症中心的，通过表征细胞线芯的研究得到认证。简朴地说,HeyA8和SKOV3ip1细胞在添加15%胎牛血清和0.1%硫酸庆大霉素的RPMI1640培养基中培养。HeyA8-MDR细胞在添加有15%的FBS和300ngml紫杉醇以及0.1%硫酸庆大霉素的RPMI1640培养基培养。HCT116细胞在添加10%的FBS和0.1%硫酸庆大霉素的改良伊格尔培养基中培养。所有的细胞都保存在37°体外基因沉默STAT3（靶序列5'-GCCUCUCUGCAGAAUUCAA-3'），粘着斑激酶（靶序列5'CCACCUGGGCCAGUAUUAU-3'），和一个非定标性的控制序列（靶序列的5'-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3'）均购自Sigma-Aldrich公司，RNAiFect转染试剂按照厂家建议使用。简朴地说，SKOV3ip1和HeyA8-MDR卵巢癌细胞系在一式三份的六孔板用1.33μg特定siRNA孔进行转染，在70％处汇合。分别使用1:3.75的siRNA和转染试剂进行转染，对照siRNA和STAT3siRNA组无血清培养基培养6=50)在SB-R1的表达可以用福尔马林固定石蜡包埋标本检测，这种方法源于德克萨斯大学MD安德森癌症中心，是通过机构审查委员会批准。高表达或低表达都是由妇科病理学家使用下列程序来决定的:强度从1到3,分布是从1到4。TUNEL染色取新鲜冷冻的实验组(SKOV3ip1模型)肿瘤组织部分，通过末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸缺口尾部标记进行末端染色，再用1:10,000的Hoechst进行复染。凋亡小体通过绿色荧光表达。Tunel阳性细胞在10个200×区域，每组分为5个部分进行计数，得到平均值。siRNA选择性递送SKOV3ip1雌性裸鼠用0.2mgKg的荧光标记对照siRNA或无标记对照siRNA（每组n=3时）静脉注射或腹腔注射。48小时后，处死小鼠，收集肿瘤和器官（脑，心脏，肺，肝，肾，脾）并冷冻。荧光染色取新鲜冰冻得原位卵巢癌模型（SKOV3ip1）的肿瘤组织，置于丙酮中，用PBS洗涤，并用Hoechst（1:10,000）复染。荧光显微镜在400×的视野来分析幻灯片。每张幻灯片有十个高倍区域，取平均值。原位卵巢癌模型雌性裸鼠（10〜12周龄）购自美国美国国家癌症研究所。所有的实验都是由MD安德森癌症中心机构动物护理和使用委员会批准。体内FAK靶向对于FAK靶向实验（SKOV3ip1模型），治疗组分为（每组n=10）：1）空rHDL纳米粒，2）对照siRNArHDL，3）FAKsiRNArHDL，4）对照siRNA+多烯紫杉醇，5）FAKsiRNArHDL+多烯紫杉醇体内STAT3靶向STAT3基因沉默实验，根据以下各组（每组n=10）进行实验：1）对照siRNArHDL，2）对照siRNArHDL+多烯紫杉醇，3）STAT3siRNArHDL，4）STAT3siRNArHDL+多烯紫杉醇。适合的肿瘤细胞来源于卵巢癌小鼠模型（HeyA8，SKOV3ip1和HeyA8MDR）用腹腔注射接种。小鼠随机饲养并在第7天后开始解决。约HeyA8模型3周后或SKOV3ip1和HEYA8-MDR5周后，解剖小鼠，收集肿瘤。大肠癌转移模型对于大肠癌转移模型，HCT116细胞注入雌性裸鼠脾脏（治疗组N=10）。两个星期后，按照前面描述的开始用奥沙利铂解决，根据图2C所示。4周后，解剖小鼠，收集肿瘤体内沉默STAT3或FAK基因的有效剂量通过在SKOV3ip1模型小鼠注入剂量范围为0.1〜0.2mgKgSTAT3siRNArHDL或FAKsiRNArHDL来测定。小鼠在第2，4或6天解剖。收集肿瘤组织，采用蛋白质印迹分析蛋白表达记录分析假如呈正态分布连续变量可以使用t检查(在两个组)或方差分析(所有组)进行比较。在非参数值中,连续变量使用曼-怀氏等级和检查或秩和检查(所有组)进行比较。rHDL体内研究将治疗组每10只小鼠被随机分派。我们使用SPSS和GraphPadPrism软件对所有结果进行处。我们认为P<0.05就是显著差异。本研究中所有的数据使用双侧分析。结果包含RNAi的rHDL纳米粒的制备由于RNAi分子是高度离子化,重要是由于磷酸基团带负电荷，我们设计了一个新奇制剂是将siRNA偶联到rHDL里。反义寡赖氨酸多肽具有大约40赖氨酸残基，这可使siRNA偶联到rHDL。siRNA偶联后，rHDL纳米粒的直径约10nm(图1，A和B)和带中性电荷(ζ电位−3.2mV)。rHDL纳米粒具有强大的有效载荷承载能力（最高至4mgsiRNAml)。此外，具有siRNA纳米粒是非常稳定的。由于样品储存两周并再次透析后siRNA没有从rHDL损失。SR-B1表达在肿瘤细胞在研究rHDL作为siRNA的有效递送系统之前，我们一方面分析了多个细胞系和人类肿瘤存在的SR-B1受体。在50种人类卵巢上皮癌,96%的肿瘤细胞表达了SR-B1受体(图1C)。此外，我们检测在人类正常器官的SR-B1表达并用RT-PCR分析乳腺癌、直肠癌、胰腺癌和卵巢癌细胞系的表达(图W1)。用RT-PCR也检测了一些细胞系(图1D)。所有的癌症细胞系测试证实了SR-B1的高水平表达。在正常的组织里，只有肝脏SR-B1高度表达，而其他组织很少表达。Figure1.CharacterizationofrHDLnanoparticles.(A)IllustrationsofrHDLnanoparticlecomposition.(B)ElectronmicrographofrHDLnanoparticlescontainingcontrolsiRNA.(C)ExpressionofSR-B1inepithelialovariancancer(IHC).(D)mRNAexpressionofSR-B1inovarianandcolorectalcancercelllines.在体内rHDL纳米粒的选择性输送比起正常组织，考虑到SR-B1受体在肿瘤细胞中的高度表达，我们接下来检测用rHDL纳米粒递送siRNA在体内的有效性。荧光标记(Alexa555)siRNA被包入到rHDL纳米粒子，并进行IV或IP(图2)。单剂量注射后，siRNA均匀分布到约80%的特定肿瘤组织。我们进一步验证rHDL纳米粒的递送是否由受体介导。为了解决这个问题,，我们一方面分析了用Alexa555标记siRNArHDL纳米粒解决的小鼠器官(图W2)。rHDL纳米粒在肝脏中的吸取最高，而在大脑、心脏、肺、肾、或脾中吸取很少。静脉注射或腹腔注射rHDLAlexa555后，肿瘤组织对rHDL纳米粒的吸取无显著差异。用该方法进行长期治疗实验之前，我们下一个验证STAT3siRNA偶联到rHDL纳米颗粒(siRNArHDL)在体内基因沉默的有效性。STAT3siRNA的有效性一方面在体外SKOV3细胞上测试(图W3A)，与对照组siRNA相比，5μg的STAT3siRNA导致STAT3蛋白表达超过80%的减少。接下来，检测在体内沉默STAT3基因的有效剂量。在SKOV3ip1小鼠模型中我们注射STAT3siRNArHDL，剂量范围从0.1至0.2mgKg。第四天，单剂量注射0.2mgKg的siRNA，我们发现减少了88%STAT3蛋白水平(图W3B)，在第6天，蛋白表达有些回升。根据这个实验，我们在后续实验中使用0.2mgKg的剂量。另一个关于癌症生长和转移的关键基因，FAK也具有类似的结果(图W3C)。在SKOV3ip1小鼠模型中单剂量注射FAKsiRNArHDL纳米粒4天后，FAK水平减少了87%。Figure2.SystemicdeliveryofsiRNAusingrHDLnanoparticles.(A)UptakeofAlexa555-labeledsiRNArHDLinSKOV3ip1tumors.AsingleIVorIPinjectionof0.2mgkgofAlexa555labeledor0.2mgkgofIVandIPinjectionofuntaggedsiRNArHDLwasadministeredinmicebearingSKOV3ip1tumors,and48vivoefficacyofSTAT3siRNArHDLinchemosensitive(HeyA8andSKOV3ip1)andchemoresistant(HeyA8-MDR)mousemodelsofovariancarcinoma.*P<.05comparedwithcontrols.**P<.05comparedwithcontrolsaswellasdocetaxelalone.(C)InvivoefficacyofSTAT3siRNArHDLincolorectalcancermodeloflivermetastases(HCT116).*P<.05comparedwithcontrolsiRNArHDL,**P<.05comparedwithSTAT3oroxaliplatinalone.InvivoefficacyofFAKsiRNArHDLintheSKOV3ip1ovariancancermodel.*P<.05comparedwithcontrols.**P<.05comparedwithcontrolsaswellasdocetaxelalone.Errorbars,SEMSTAT3或FAK基因沉默对肿瘤的生长和转移的影响体内成功沉默FAK或STAT3基因后(图W3B），我们接下来测试了这种是否用多烯紫杉醇化疗药方法的治疗有效性。我们一方面用STAT3siRNArHDL靶向STAT3(图2B)。在三个原位卵巢癌小鼠模型中用单独STAT3siRNArHDL或偶联多烯紫杉醇进行治疗。在HeyA8模型中，单独给STAT3siRNArHDL或多烯紫杉醇减少了的62%的肿瘤重量(P<0.5年,两者)。与对照组比较，STAT3siRNArHDL和多烯紫杉醇的联合治疗使肿瘤重量减少的最多(92%，P<0.05)。在SKOV3ip1模型中结果类似(图2B)。此外，当STAT3siRNArHDL有无多烯紫杉醇解决小鼠，HeyA8和SKOV3ip1卵巢癌模型中证实了肿瘤结数量的剧减。(图W4A)考虑到STAT3的耐药性，我们还进行了紫杉醇耐药HeyA8-MDR模型实验(图2B)。正如预期，多烯紫杉醇对肿瘤的生长无显著影响。STAT3siRNArHDL单药疗法使肿瘤生长减少了76%(P<0.01)。多烯紫杉醇和STAT3siRNArHDL联合疗法使肿瘤细胞的增长减低的更多(比起对照组，91%，P<0.001；比起多烯紫杉醇，89%，P<0.1)。肿瘤节数量也有类似的效果（图2）。我们在每一个治疗组的动物的局部转移频率进行了分析。相比于对照组和多烯紫杉醇单药疗法，STAT3siRNArHDL是否偶联多烯紫杉醇都能显著减少上腹部和薄壁肝组织的转移。接下来，我们研究在转移性结直肠癌小鼠模型（HCT116）研究STAT3沉默基因的治疗效果，该模型使SR-B1表达（图2C）。肿瘤细胞注射到脾脏后，转移扩散到肝脏。STAT3siRNArHDL单独治疗导致在肿瘤的重量减少79％（P<0.01）。对于这些实验，我们常用细胞毒性，奥沙利铂，偶联STAT3siRNArHDL。奥沙利铂减少55％的肿瘤生长（P<0.01）。与对照组相比，奥沙利铂和STAT3siRNArHDL偶联治疗可使肿瘤重量（96％，P<0.01）和肝脏中转移损坏数目（86％，P<0.01）显着减少。为了评估rHDL纳米粒的安全性，我们评估用rHDL纳米粒解决小鼠的几个参数（图W5）。在两个不同治疗组中，动物体重或肝功能测试（AST和ALT比值）没有显着差异（图W5，A和B）。与对照组相比，治疗结果显示没有显着变化后，多个正常器官用苏木精和伊红（H＆E）染色（图W5C）为了测试rHDL纳米粒对其他靶点的效用潜力,我们进行了FAKsiRNArHDL实验。我们在SKOV3ip1原位卵巢癌模型中用FAKsiRNArHDL纳米粒靶向FAK(图2C)。FAK或多烯紫杉醇单药治疗可使肿瘤重量减少62%和74%(两者P<0.01)。联合治疗显著减少肿瘤重量(96%，P<0.01)，肿瘤节的数量(74%，P<0.05)。空rHDL纳米粒和对照siRNArHDL解决的小鼠之间没有显著差异。STAT3靶向肿瘤微环境的影响为了了解STAT3rHDL的生物效应，在药物敏感的(SKOV3ip1)和药物耐药(HeyA8-MDR)卵巢癌模型中进行一系列的体内体外实验。在SKOV3ip1卵巢癌模型中(图3),STAT3基因沉默减少26%细胞增殖(P<0.05)，而多烯紫杉醇克制30%肿瘤细胞增殖(P<0.05)。与对照组比较，STAT3siRNArHDL和多烯紫杉醇联合治疗可克制48%肿瘤细胞增殖(P<0.05)(图3)。在HeyA8-MDR卵巢癌模型中(图W6)，就多烯紫杉醇解决对于细胞增殖就没有效果，STAT3siRNArHDL单药可减少19%细胞增殖。对照组比较，STAT3siRNArHDL和多烯紫杉醇偶联治疗可显著减少细胞增殖(39%，P<0.05）。为了拟定STAT3沉默对肿瘤相关血管生成的影响,我们从所有四个实验组取新鲜冷冻肿瘤组织的样品进行CD31染色实验(图3和W5)和检测MVD。在SKOV3ip1模型,STAT3siRNArHDL或多烯紫杉醇单药治疗在MVD(图3)产生66%至69%的减少(P<0.05)。比起对照组，STAT3siRNArHDL和多烯紫杉醇偶联治疗在MVD可减少88%(P<0.05)。同样,在HeyA8-MDR模型中，就多烯紫杉醇解决对MVD的减少没有影响，但多烯紫杉醇和STAT3siRNArHDL偶联治疗可显著减少(图W6)。众所周知，STAT3被认为是增长细胞存活和克制细胞凋亡。因此，我们在SKOV3ip1卵巢癌模型中用TUNEL染色法(图3)，在HeyA8-MDR模型活化型半胱天冬酶染色法(图W6)研究了肿瘤细胞的凋亡效果。在SKOV3ip1模型，与对照组比较，STAT3基因沉默或多烯紫杉醇治疗可增长8-12倍的细胞凋亡(P<0.05)。与对照组(P<0.05)相比，STAT3siRNArHDL和多烯紫杉醇的联合治疗可增长30倍的肿瘤细胞凋亡。除此之外，在HeyA8-MDR模型中，就多烯紫杉醇解决不影响细胞凋亡，对照组siRNArHDL相比，STAT3siRNArHDL或STAT3siRNArHDL与多烯紫杉醇联合治疗可大幅增长(分别为61%和76%，两者P<0.05)凋亡细胞(阳性活化型半胱天冬酶-3)(图W6)Figure3.EffectofrHDL-incorporatedSTAT3siRNAontumormicroenvironment.Tissues(Ki-67),angiogenesis(CD31),andapoptosis(TUNEL).FortheTUNELstain,fiverandomfieldsperslidewereexaminedwithfluorescencemicroscopy,andthenumberofapoptoticbodiesandnucleiisreportedasaveragepercentapoptoticcells(200×).Errorbars,SEM.卵巢癌细胞的STAT3沉默的组织标记为了辨认潜在组织标记对STAT3基因沉默的响应,我们在卵巢癌细胞对对照和STAT3siRNA进行基因组分析(图4，A和B)。这两组间有460个基因表达差异。生物数据指出，STAT3沉默后凋亡和修复是细胞生存的重要影响，我们重点研究这些途径的基因(表W1)。从表中知，我们使用RT-PCR验证STAT3基因沉默后最显著改变的12个基因(图4C)。STAT3基因沉默的限度与两个模型保持一致。STAT3基因沉默大量减少了关键生存基因，这些基因重要用来调节MAP激酶和AKT通路（图4）。这些基因可以作为响应靶向STAT3疗法的重要组织标记基因。在HeyA8-MDR模型中也有类似的结果(数据未显示)。Figure4.EffectofSTAT3silencingongeneexpressionprofileofovariancancercells.(A)STAT3silencingmodulatesgeneexpressionofapoptosisrelatedgenes.AfterSTAT3silencingwithsiRNA(invitro),microarrayanalysiswasperformed.Heatmap(A)representstheoverallgeneexpressionchanges.Analysisofapoptosis-related(B)genesareshown.(C)Validationofmicroarray.Apoptosis-relatedgenesthatweredifferentiallyexpressedbetweencontrolsiRNAandSTAT3siRNAtreatmentgroupswerevalidatedwithquantitativereal-timeRT-PCR.Averagefoldchangeispresented.Errorbars,SEM.体外STAT3沉默对细胞凋亡的影响为了拟定STAT3基因沉默是否直接影响肿瘤细胞的凋亡，在卵巢癌细胞(SKOV3ip1和HeyA8-MDR)的模型中，我们检测STAT3siRNA是否具有多烯紫杉醇对细胞存活的影响(图5)。STAT3沉默用免疫印迹分析证实(图W3A)。在SKOV3ip1细胞,STAT3siRNA或多烯紫杉醇单药治疗增长凋亡(分别是3和5.2倍，两者P<0.05)，而对照组相比，联合治疗增长7.7倍细胞凋亡(P<0.05)。与多烯紫杉醇治疗相比，STAT3siRNA可增高41%的细胞凋亡(P<0.05)，这表白在体内凋亡效应的的确受到直接影响(图5A)。此外，在HeyA8-MDR细胞多烯紫杉醇治疗没有产生显著凋亡(图5b)然而,STAT3沉默后增长多烯紫杉醇，比对照组相比可增长175%(P<0.05)的细胞凋亡，与单独多烯紫杉醇治疗可增长98%的细胞凋亡(P<0.05)。Figure5.EffectofSTAT3silencingonapoptosis.STAT3wassilencedusingSTAT3-specificsiRNAin(A)SKOV3ip1and(B)HeyA8-MDRcellswithandwithoutdocetaxeltreatment,andapoptosiswasassessedusingflowcytometry(annexinV).Averagepercentapoptosis(AnnexinVPE–positiveSKOV3cells)andaveragepercentapoptosiscomparedwithcontrol(annexinVPE–positiveHeyA8-MDRcells)arereported.Errorbars,SEM讨论本研究的关键发现就是在体内rHDL纳米粒能有效地传递siRNA以沉默基因，这些基因对癌症的增长和发育很重要。这个概念建立在多个肿瘤模型中，通过siRNA包入rHDL纳米粒以介导的高效STAT3或FAK基因沉默。生物效果是通过减少肿瘤细胞增殖，减少减少血管生成，减少细胞生存率来评估。尽管干扰RNA是一个高度特定基因沉默的模式,源于在体内全身输送的障碍，目前其治疗应用受到限制。为了克服这些障碍,选择性生物相容性的运载系统是必要的。到目前为止,一些纳米粒系统已经具有潜在的治疗措施，然而,由于缺少组织特异性和体内广泛分布大部分这些系统也许在对正常组织产生毒性。因此,非特异性递送系统也许需要更高的剂量来达成有效性和连续的基因沉默。因此,比起其他方法，靶向性递送系统克服这些障碍更抱负。递送siRNA的rHDL传输系统具有许多的优点。例如，rHDL核心成分的细胞摄取通过一个特定的受体(SR-B1)完毕。我们的数据表白，与正常组织相比，SR-B1受体在肿瘤细胞中的表达增长。这些表达差异也许有助于避免副作用。在目前研究中，rHDL纳米粒的吸取重要局限于肿瘤和肝。这种吸取模式与SR-B1表达分布完全一致。此外,我们的安全研究表白，对照组siRNA相比，STAT3rHDL在小鼠肝脏中吸取没有任何不良反映。概念验证，我们证实了多种临床前模型成功靶向两个关于癌症生长和增殖重要的基因。STAT3是一个良好的转录因子，涉及到肿瘤增殖和转移的许多关键过程。干扰RNA是一种有效的治疗策略，特别是对其他方法不易给药的靶点。即使STAT3被广泛认为是一个重要的癌症启动子，传统治疗方法因其靶向性受到的限制。因此，所说的siRNA递送系统对于靶向STAT3和恶性肿瘤增长促进剂是很重要的途径。减少血管生成的生物效应，继发于肿瘤细胞的STAT3沉默，这点已经得到支持，是通过STAT3激活剂来调节血管内皮生长因子的表达。在肿瘤细胞中激活STAT3与血管内皮生长因子表达的增长是相关的。所以，药理干预靶向STAT3对于这里描述的纳米技术是也许的。此外，其他实体瘤中，FAK在直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、甲状腺、前列腺癌上过度表达这一点也曾报道过。在卵巢癌患者中，FAK的过度表达与肿瘤相关功能在所有存活者中并不明显。用脂质体或小分子克制剂系统性靶向FAK显示减少肿瘤生长和转移，但是，这种方法并非肿瘤特异性并且也许产生毒性。FAKsiRNArHDL治疗方法具有高度肿瘤特异性，可以显著克制肿瘤的生长和转移并且对其他器官无明显副作用。总之，用rHDL纳米粒系统性递送siRNA为治疗人类恶性肿瘤开拓了新的视野。这个递送方法不仅高效的，并且具有选择性和生物相容性。因此,rHDL纳米粒癌症管理中具有显著的应用。FigureW1.ExpressionofSR-B1mRNAindifferentorgansandtumorsusingRT-PCR.Actinisusedasaloadingcontrol.FigureW2.Distributionofsystemicdeliveryoffluorescent-labeledsiRNArHDL.Alexa555-labeledcontrolsiRNArHDLoruntaggedsiRNArHDLwasinjected(IVorIP),and48tissueswerecounterstainedwithHoechst,andtheleveloffluorescent-labeledsiRNA(red)wasassessedwithfluorescentmicroscopy.Averagefluorescenceuptakeisrepresentedbythegraphs.*P<.05comparedwithuntaggedsiRNArHDL.H&ErepresentstheorganmorphologyFigureW3.STAT3andFAKsilencingwithsiRNArHDL.(A)STAT3siRNAtreatment(invitro)inSKOV3ip1ovariancancercells.(B)STAT3siRNArHDL.(C)FAKsiRNArHDLwasinjectedinmicebearingSKOV3ip1ovariantumors.Westernblotanalysisdemonstratesrelativeproteinexpression.GraphsrepresentmeanexpressionintensitymeasuredwithdensitometryFigureW4.InvivoeffectofSTAT3siRNArHDLwithandwithoutdocetaxeltherapyontumornodulesin(A)HeyA8andSKOV3and(B)HeyA8-MDRovariancancermodels.Theaveragenumberoftumornodulesispresentedasabargraph.Errorbars,SEM.Three-dimensionalgraphdepictsthedistributionofovariantumormetastasisinHeyA8-MDR(Taxol-resistant)ovariancancermodelFigureW5.SafetyofrHDLnanoparticles.(A)Bodyweights.(B)Liverfunctiontests(LFTs)measuredattheendoftherapyexperimentfromalltreatmentgroupsarereported(forLFTs,ASTandALTratioispresented).(C)Immunohistochemistry(IHC)performedonorgansafteralong-termtherapyexperiment.RepresentativeimagesofIHCfromeachtreatmentgrouparepresentedFigureW6.EffectofrHDL-incorporatedSTAT3siRNAontumormicroenvironment.Tissuescancermousemodelweresubjectedtoimmunohistochemistryformarkersofproliferation(Ki-67),angiogenesis(CD31),andapoptosis(cleavedcaspase-3).Fortheanalysis,fiverandomfieldsperslidewereexaminedwithlightmicroscopyandnumberofaveragenumberofmicrovessels(MVD)orthenumberofcellspositive(Ki-67andcleavedcaspase-3)andnucleiarereportedasaveragepercentpositivecells(200×).Errorbars,SEM.以下免费送您一百个优秀毕业论文题目，供参考。1.公司集团激励与绩效评价问题研究2.XXX地区中小公司财务管理现状问题研究3.XXX地区上市公司赚钱质量实证研究4.XXX地区公司集团整合过程中的财务问题研究5.XXX地区中小公司的信用担保体系问题研究6.XXX地区上市公司财务预警问题研究7.公司并购前后财务状况变化问题研究8.以平衡计分卡为核心的绩效评价体系研究9.EVA在公司绩效评价中的作用研究10.关于我区中小公司引入风险投资问题研究11.我国上市公司经营目的的实证分析12.对内含报酬率法的再思考13.运用平衡计分卡贯彻战略的案例分析14.基于EVA的公司业绩评价指标体系的构建与实行研究15.基于不同发展周期的公司财务战略选择研究16.集团公司全面预算目的的制定与分解17.钞票流量折现法在评估公司战略中的应用分析18.财务指标与非财务指标在评估管理者业绩中的应用拟合19.我国公司财务管理目的的现实选择20.财务管理目的与公司财务核心能力问题研究21.公司财务管理中运用税收筹划的探讨22.建立以财务管理为核心的资源配置制度23.财务预警系统在财务管理中应用评价24.基于Excel的财务预警模型研究25.中西部地区中小公司财务战略选择问题研究26.中小公司纳税筹划问题研究27.公司投资过程中的纳税筹划问题研究28.公司集团纳税筹划问题研究29.公司纳税筹划中的风险规避问题研究30.从公司治理结构透视财务管理目的31.作业成本管理模式及其应用研究32.论管理层并购在我国的运用33.公司并购中的财务风险与防范34.跨国公司财务管理策略及其在我国的实践35.关于上市公司并购的财务分析36.跨国公司财务管理体制的比较与选择37.跨国公司财务管理策略及其在中国的实践38.全球化与财务管理发展趋势及其模式选择39.财务治理与财务管理之异同40.EVA对传统财务管理的冲击41.公司财务管理机制重塑问题探讨42.财务管理发展的文化分析43.利益相关者合作模式下的财务管理目的选择44.行为财务管理探索——以价值管理为中心45.上市公司股利政策实证研究46.公司治理结构与财务管理目的问题研究47.产权理论分析与财务管理目的的现实选择48.金融工具创新与公司财务管理49.对价值链财务管理目的的探讨50.IT信息产业公司的财务管理51.期权在财务管理中的运用52.论创业投资在我国所面临的财务问题53.风险投资退出机制问题研究54.公司可连续发展与财务管理问题研究55.公司集团资金链构造问题研究56.内蒙古地区上市公司融资效率实证研究57.预算管理在ERP系统中的运用问题研究58.发展中小公司信贷融资的思考59.中小公司在不同发展阶段战略选择问题研究60.连锁经营公司财务管理创新61.对我国中小公司风险投资的探讨62.中西部地区中小公司融资策略研究63.融资租赁在中小公司中的运用问题研究

64.对我国中小公司信用管理的研究65.对我国中小公司创业版上市公司成长性分析的探讨66.对连锁经营公司资金运营管理的思考67.推行全面预算管理

建立新型财务管理体系68.机会成本及其在公司财务管理中的应用69.建立以预算管理为中心的财务管理模式70.论边际成本在公司理财中的运用71.公司融资障碍及对策研究72.高新技术公司财务管理若干问题的思考73.公司的扩张与财务管理74.行为财务管理新论75.论破产公司财务管理存在的问题及对策76.公司核心能力与财务管理能力研究77.我区公司运用外资融资效率分析78.我区中小公司创新模式研究—基于财务视角79.公司集团成本管理的创新问题研究80.集团公司财务管理模式的探讨81.非营利组织财务管理面临的问题及对策研究82.公司激励与绩效评价问题研究83.我区公司集团财务战略选择问题研究84.非营利组织财务管理创新问题研究85.公司集团资本运营问题研究86.论表内融资与表外融资的关系87.EVA—现代公司的最佳绩效评价指标88.对杜邦分析法的再思考89.EVA与传统业绩评价方法结合问题研究90.财务分析指标体系创新问题研究91.非财务分析法与财务分析法结合有效性研究92.非财务指标在业绩评价体系中运用的有效性问题研究93.关于经营者业绩评价的思考94.公司融资效率实证研究95.信息时代财务控制趋势分析96.期权在公司投资决策中的应用97.公司集团融资中的风险规避问题研究98.我区公司的融资创新问题研究99.现代资本预算技术在公司理财中的运用100.国有资本减持的财务风险研究现在，我把自己数年来撰写毕业论文经验，总结如下，一并赠送给您，希望能帮到您：毕业论文注意事项前言毕业论文（学士学位论文）是本科生毕业设计成果的“固化”与“浓缩”，其规范性历来为指导教师和论文审阅人所重视，几乎系评语中不可或缺之内容。毕业论文的规范性由此可见一斑。各届学生毕业论文中出现的问题比比皆是，笔者将其加以整理，急忙成文，姑且称之为“毕业论文注意事项”。须指出，本文所有内容乃笔者之见，难免以偏概全、挂一漏万，更无权威性可言，故不敢称之为“毕业论文写作规范”。文中不妥之处在所难免，欢迎同仁批评指正，共同商榷，以飨毕业班之学生。或许一些人认为，给一篇毕业论文做“样板”，诸多问题都将迎刃而解；网站上提供论文模版供学生下载更为上策。但笔者必须指出，许多应注意的细微之处，远不是给一篇范文或给一个模版就能做到的，此乃撰本文之初衷。第一章关于插图1．1图号插图要有图号，格式为“图m-n”。其中m为该插图所在的章号，n为本章中该插图的顺序号，m与n均为阿拉伯数字。每一章的插图独立编号。例如第3章的第4个插图标记为“图3-4”1．2图名（图注）图名应确切反映该图的含义，一般为名词性短语，力图简明扼要。图名放于图号后，与图号隔两个全角空格。为便于叙述，不妨将图号与图名并称为“图题”。1．3插图的形式插图一般有四种形式，即手绘图、屏幕抓图、扫描图、文献插图。来自电子版参考文献的插图，多数是模糊不清的，故建议用手绘图取而代之。1．3．1手绘图手绘图系指在Word中直接用绘图命令绘制的图。该类插图所占磁盘空间最少，系使用最多的一种插图形式，数据流图、结构图、程序框图一般用此法绘制。绘图所用图例应注意规范。程序框图的选择框要注意标“是否”或“YN”，起始框、终结框注意用圆角矩形（建议使用专门用于画框图的软件Visio画框图）；数据流图的数据线需标数据名称，数据加工与数据存储之间的箭头无数据名称。其他图形的图例参考有关文献。手绘图时必须一丝不苟，搭结欠量、过量均不合格；图中的文字放入文本框中，框内文字注意横纵居中；线框交界处注意匀称；框内文字的笔划宜完整，不得被线框遮盖；文字、线条不得交叉；图中文字尽也许使用统一的字体、字形、字号，其中字号原则上不大于正文字号（以小半号为宜）。微调线条位置、长短时，可将Alt键和箭头键配合使用。观测线条是否存在搭接问题时，可选用500%的显示比例，否则难以看出搭接问题。线条、文字等元素输入完毕后，应选中与所绘之图有关的所有线条、文本框，按鼠标右键，选“组合”，将各元素组合在一起。否则，很有也许排版后“东一只胳膊、西一条腿”，甚至“丢胳膊少腿”。1．3．2屏幕抓图此类图系指使用PrtScreen或Alt+PrtScreen键通过剪贴板获得的图像。采用屏幕抓图制作插图时，应“量身定做”，抓图后不要缩放，以免模糊。1．3．3扫描图如使用扫描图片，分辨率规定为300线，颜色模式为灰度，嵌入文中后不要缩放。1．3．4文献插图文献插图系指使用“插入|图片|来自文献…”命令插入的图像。采用文献插图时，尽量不要使用JPG等类型的压缩图片，以免影响打印效果。1．4插图的位置尽量将插图与正文中的相关文字说明置于同一页。放入前一页或后一页，乃不得已而为之（例如图太大等）。插图一般居中放置；图题位于插图的下方，用宋体5号字，居中放置；图题与插图放于同一页中，即两者不得跨页。换言之，图题不能位于某一页的页首。一张图一般不得跨页（大的程序框图例外，但需按正规规定标清楚）。1．5插图的排版插图很小时，建议使用围绕排版（四周排版），插图前、图题后均应留适当空间，切勿与正文“紧密相连”。第二章关于表格论文中的表格一般使用Word的表格功能直接制作，使用Excel制作亦可。2．1表号表格要有表号，格式为“表m-n”。其中m为该表格所在的章号，n为该章中该表格的顺序号，即每一章的表格独立编号。例如第3章的第4个表格标记为“表3-4”2．2表名表名应确切反映该表的含义，一般为名词性短语，力图简明扼要。表名放于表号后，与表号隔两个全角空格。为便于叙述，不妨将表号与表名并称为“表题”。2．3表格尽量将表格与正文中的相关文字说明置于同一页，放入前一页或后一页乃不得已而为之（例如表格太大等）。表格一般居中放置；表题位于表格的上方，用宋体5号字；居中放置；表题与表格放于同一页中，即两者不得跨页。换言之，表题不能位于某一页的页尾。表格自身可以跨页，但次页的表应加一个表头（注意，不是标题，是表头，即表格的首行），或在次页首部加注“（续表）”。2．4表格内文字的排版表格内文字应比正文小半号，一般居中放置，但文字量较大且长短不一时，以左对齐为宜。表格设计应美观、大方，表格风格尽量一致，推荐使用三线式表格。表格前、后均应留适当空间，切勿与正文“紧密相连”。第三章关于摘要5．1格式中英文摘要各占一页，首行写“摘要”“ABSTRACT”（“摘要”之间空两格，采用三号字、黑体、居中，与内容空一行）；第三行开始写摘要内容，首行空两格（内容采用小四号宋体）。最后单独列一行，写中英文关键词。关键词一般提供3-5个即可，写于1-2行上，以分号分隔。中文关键词前冠以“关键词：”，靠左；英文关键词前冠以“Keywords:”，亦靠左。第二行首个关键字与第一行的首个关键字对齐。具体规定参见模板。5．2内容课题的意义，工作方法，结果与结论，后续研发建议等。摘要中不可大段大段地引用正文中的段落。切忌使用自动翻译工具将中文摘要翻译为英文摘要。第四章关于目录4．1目录的制作目录必须由Word自动生成，不得手工输入，以免后患无穷。制作方法：先使用格式工具栏的第一个图标将各级标题“格式化”，再使用“插入|索引和目录”便可自动生成。目录生成后，在首行加上“目录”二字，采用黑体三号字，居中。目录只列到三级，一、二、三级标题依次内缩一字，分别采用四号、小四号、五号宋体。4．2目录页的位置目录页位于正文第一页之前。正文首页为论文第一页。目录右端的页号应对齐。目录页超过一页时，应有页码，一般采用大写罗马数字，以区别于正文。注意：目录之前的各页均无页号、无页眉。第五章关于正文5．0关于页面新的一章应换页。正文任何一页的尾部均不得留很多空行（一章的末页除外）。图表过大，致使本页剩余空间容纳不下时，可将其放于次页，并将其后的文字上提至前一页。编了号的图表，原则上可放于正文的任何一页，但通常与正文中的说明性文字不要相隔甚远。只有正文才有页眉。换言之，正文之前的各页无页眉；自“参考文献”起，以后各页亦无页眉。正文各页的页脚只有页码，且居中放置。5．1关于体例第一章章标题（黑体、小三号、居中）1.1节标题（黑体、四号、顶格）1.1.1小节标题（黑体、四号、顶格）一、段落标题1（宋体、小四号、空2格、用1.25倍行间距）1.段落标题2(1)段落标题3=1\*GB3①段落标题4论文正文注意：无论哪一级标题，尾部均无标点符号。不得悬空出现一个标题，如：系统的基本原理提醒：根据往届学生论文情况，各级序号尽量不用Word自动生成，以免格式难以控制。5．2关于字体、字形、字号、行距、字距（按模版）正文一般用小四号宋体，行距采用1.5倍，字距采用默认值。5．3关于分页新的一章开始，要换页，但不要用多个回车进行分页（否则后患无穷），而要用^Enter（即Ctrl+Enter）插入换页符；标题不得位于一页的末行；图题不得位于一页的首行（前已提及，此处强调）；表题不得位于一页的末行（前已提及，此处强调）；不能因图表过大而提前换页（即将大的图表放入次页）；可将后页的部分文字提到前页来解决此问题。5．4关于文献引用引用文献处，用[n]以上角标形式标注，其中n为参考文献序号。文献引用属正常现象，无可厚非，但忌讳大量抄录，特别是整章整节内容大肆抄袭。软件介绍、开发工具介绍、数据库原理介绍宜少花笔墨。并且，所“写”内容出自何文献，需以此方法注明（通俗地讲，抄自何处，应让人一目了然）。5．5关于图表只要出现插图或表格，在正文中必须要有相应的说明。例如：“系统的数据流图如图3-1所示”，“数据字典示于表3-1”，等等（前已提及，此处强调）。不得出现“…如下图所示”、“…如下表所示”图表中的文字应注意严厉性，严禁出现不良人名、地名，忌讳影星、歌星名字或影视作品中的人名。5．6关于段落段首严格空两个汉字的位置。应使用标尺进行控制，不要使用4个半角空格或2个全角空格代之。除特殊情况外，段落一般使用“两端对齐”，以免右侧参差不齐，特别是英文。5．7关于标点1．凡中文叙述之处，均使用全角标点符号；破折号“——”与省略号“……”必须规范（在微软拼音方式下，分别用“Shift+-”和“Shift+^”输入，前者亦可用Alt+Ctrl+.输入），不得用其他符号替代。外国人名字的姓与名之间用“•”分隔，不得以“.”或“．”代替。表达区间、范围时，使用“～”，不使用“~”（参考文献页码范围使用“-”）。2．凡英文叙述之处，均使用半角标点符号；且注意英文无顿号，代之以逗号；英文无书名号，代之以斜体排版。3．凡是程序中涉及标点符号的，一律用半角符号（双引号应显示为“"”，单引号应显示为“’”），但程序中的注释例外。4．写完文章后，要多检查几遍，注意文中标点的对的使用。5．8关于错别字1．多数同学使用拼音法输入汉字，同音别字非常之多，如“仪器”误输为“一起”，“及其”误输为“机器”，“登录”误输为“登陆”，“清楚”误输为“清洗”，“指导”误输为“直到”……特别注意：“登陆”二字在学生论文中大量出现，希望使用Word的查找命令检查一下是否出现之。2．写完文章后，要多检查几遍，注意文中错别字问题，特别是“的、地、得”的误用问题（本科生的论文中大量出现此类问题）。5．9关于缩略语、外来语、文献名、软件名称及其版本号1．缩略语正文中初次出现缩略语时应给出原文。形式如下：MIS（ManagementInformationSystem，管理信息系统）顺便说明一下，重点术语，即使非缩写，亦应给出原文。2．外来语外来语大小写应统一。例如：Internet，INTERNET，internet应统一为Internet，不可混用。3．文献名文献名（特别是扩展名）一般应大写。4．软件名称以及版本号介绍软件名称以及版本号时，要注旨在软件名和版本号之间加一个半角的空格，如：Windows2023（错误）、Windows2023（对的）。Windows不可写为Window。软件名称中，字母的大小写应前后一致。常用软件名称的写法如下：PowerBuilder9.0,FoxPro2.5,VFP6.0,VB6.0,VC++6.0,C++Builder,C#,Delphi,ASP,SQLServer2023，Oracle9i，SybaseSQLAnywhere等。5．10关于句子1．要做到语法对的、句子通顺，注意语义连贯性，杜绝病句。一般句子规定有主语、谓语，及物动词还应带宾语（本不该在此提及此类“小儿科”之事，但毕业论文中的的确确存在着大量病句，尤以无主句为盛。要反反复复、认认真真地读每一个句子，复读数十遍，毛病必自现）。以祈使句描述某一过程时可以使用无主句，特殊情况下也可以使用无主句。例如：“为了提高CPU超频的成功率，可把其核心电压提高0.1-0.2伏”。2．要用书面语，忌用口头语，忌用“网络语言”，忌用非专业术语。“这个问题前面已经说过了，所以这里就不多说了。”（不好）“该问题前已提及，此处不复赘述。”（好）“运营了N多遍。”（极差）“文献的后缀”应改为“文献的扩展名”。3．用语简明扼要，切忌烦琐。“由于毕业设计只有三四个月的时间，比较短，所以该系统免不了尚有许多不尽如人意的地方，这些都有待于在下一个版本中进行进一步的完善。”（不好）“因时间所限，系统不尽人意之处在所难免，尚有待进一步完善。”（好）4．中文句、英文句应严格区分，不要土洋结合，不伦不类。“使用起来非常easy，只需点一下mouse就OK了。”（不好）5．11关于称谓每篇论文均系一人所作，故不要张口闭口地用“我们”。“我”字在科技论文中显得过于乏味，可代之以“笔者”、“本人”。5．12关于程序大量的程序不宜出现于正文中，但少量程序、核心代码或脚本可以穿插于正文之中；量大时建议放于附录中，不要给人以充字数之嫌。5．13关于计量单位介绍内存、外存容量以及软件的大小时，注意将单位写清楚、写规范。如：353K（错误）、353KB（对的）、256M（错误）、256MB（对的）。5．14关于下载地址介绍软件下载地址时，一定要有最终地址，不要写成:.cfan之类的，而要写成:.cfandownloadscfan.exe之类。正文中尽量避免出现下载地址，最佳放于参考文献中。5．15关于表达式（含方程等）公式、表达式一般应居中排版。若带有编号，编号应加圆括号，并靠右对齐。例如：a2+b2=c2(2-1)公式如有上、下角标，应对的使用。变量应使用斜体排版，常量用正体排版。建议使用word的公式编辑器进行排版。第六章关于封面“毕业论文”一行的下面直接写论文题目，不必画蛇添足，多写“题目：”二字。你见过哪本书的封面上写着“书名：XXXXXX”吗？姓名为两个字时，中间应加两个空格。班级名应规范化。本校计算机专业全称为“计算机科学与技术”。第七章关于参考文献工大学报几乎每篇文章最后均附有参考文献，其格式十分正规，分为著作、论文、网文、学位论文等几类，格式各异。参考文献以正文中引用的先后顺序排列。以下分别是著作、学位论文和期刊的例子：[1]王兴业，唐羽章．复合材料力学性能[M]．长沙：国防科技大学出版社，1988：366–382．[2]李玉彬．环氧树脂电子束固化机制与应用基础研究[D]．北京：北京航空航天大学，2023．[3]武德珍，宋勇志，金日光．PVC弹性体纳米CaCO3复合体系的加工和组成对力学性能的影响[J]．复合材料学报，2023，21(1)：119–124．第八章关于结束语写毕业设计的收获、感想、局限性，以及哪些地方尚可改善。忌讳大段引用正文中的句子。第九章关于翻译最佳写明所译材料的出处，最佳提供原书的影印件（建议使用扫描仪扫描）。所译之材料在内容上最佳有一定的相对独立性，且应有标题，内容尽量与所做课题接近。第十章关于谢辞9．1称谓问题谢辞中，“感谢指导教师XXX”显得不够礼貌，“XXX”后应有个称谓（博士、专家、老师、先生、女士、同志……）。9．2病句与错别字问题9．2．1病句的典型例子及其改法（1）“感谢单位领导的大力支持，使我在繁忙的工