《肉及肉制品中鸡鸭源性成分的鉴定梯型熔解温度等温扩增检测方法》编制说明（征求意见稿）

2肉及肉制品中鸡鸭源性成分的鉴定梯型熔解温度等温扩增检测方法本文件规定了肉及肉制品中鸡鸭源性成分的梯型熔解温度等温扩增检测方法。本文件适用于肉及肉制品中鸡鸭源性成分的定性检测。本文件所规定方法的检出限（LOD）为0.1%（质量比）。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T9695.19肉与肉制品取样方法GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4方法提要提取样品DNA，用已知含鸡肉、鸭肉成分的样品DNA为阳性对照，已知不含鸡肉、鸭肉成分的样品DNA为阴性对照，灭菌双蒸水作为空白对照，使用特异性引物和探针，采用梯型熔解温度等温扩增技术，根据荧光信号和扩增现象，判定是否存在鸡肉、鸭肉成分。5原理选择Tm值曲线为梯型（包括人字梯型、半人字梯型和直梯型）的特异性核酸片段为靶序列设计巢式引物，将巢式引物的外引物与内引物分别连接成一对引物作为等温扩增用引物，借助外引物与核酸靶序列上对应片段的熔解温度差异提供单链模板，在DNA聚合酶（大片段）催化下通过合成反应与链替代反应对梯型Tm值曲线的靶标核酸片段进行等温扩增，进行不同肉类成分的定性分析。6试剂或材料3T/HNSPXHXXX—XXXX除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB/T6682中一级水的规格。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。6.1动物组织DNA提取试剂盒。6.2梯型熔解温度等温扩增检测LMTIA试剂盒。Proofman探针法6.3梯型熔解温度等温扩增检测LMTIA的引物和探针。鸡肉、鸭肉引物和探针详见表1。鸡肉和鸭肉引物扩增的靶标序列参见附录A。6.4梯型熔解温度等温扩增检测反应混合液（5μL（2X）通用型LMTIA预混液，0.4μL(100U/µL)(U,Unit，酶学单位)Bst酶）。表1鸡肉、鸭肉成分鉴定用引物和探针序列名称序列(5’→3’)靶基因鸡肉正向引物F:GACGCCCGGCCTCGTTTTAGTCGTAACAAGGTTTCCGTITS反向引物B:GCGTCCGGCCGAGCTTTTGGAAGGGAAGGGAAGGCTG环引物LF:TCCTTCCGCAGGTTCAC环引物LB:ACGAGCGCGCGCGGG探针:BHQ2-TCCTTCCGCAGGTTA-6-FAM鸭肉正向引物F:CAGCCCCGGTAATGATTTTAGTCGTAACAAGGTTTCCGTITS反向引物B:ACCGGGGCTGGGCCTTTTGGGCTCCGTCGCTCAC环引物LF:CTTCCGCAGGTTCACCT环引物LB:GGCTTGGGCGTCGCA探针:BHQ2-GGCTTGGGCGTCT-JOE7仪器设备7.1等温荧光扩增仪。7.2恒温水浴锅。7.3离心机：离心力≥12000g。7.5恒温混匀仪。7.6涡旋震荡器。7.7pH计，精度为0.01。7.8天平：感量0.01g。7.9微量紫外-可见分光光度计。8检测步骤8.1DNA提取应采用市售的动物组织DNA提取试剂盒提取。注意：洗脱缓冲液体积不应少于50μL，体积过小影响回收效率。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若用双蒸水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率；且DNA产物应保存在-20℃,以防DNA降解。8.2DNA浓度与纯度的检测使用核酸蛋白仪或微量紫外-可见分光光度计检测提取DNA的浓度与纯度。分别检测260nm和280nm处的吸光值，每个样品重复测三次，取平均值。当A260/A280比值在1.6～2.0时，可用于LMTIA扩增。8.3梯型熔解温度等温扩增8.3.1梯型熔解温度等温扩增反应体系梯型熔解温度等温扩增反应体系见表2。PCR八联管中按表1依次加入反应试剂，混匀。放入等温荧光扩增仪。表2梯型熔解温度等温扩增反应体系（10μL）试剂体积(μL）梯型熔解温度等温扩增反应混合液5.4正向引物F（100μmol/L）0.16反向引物B（100μmol/L）0.16环引物LF（100μmol/L）0.04环引物LB（100μmol/L）0.04探针（10μmol/L）0.2灭菌双蒸水2.0DNA模板2.08.3.2梯型熔解温度等温扩增反应程序按照表2配制鸡肉、鸭肉基因的反应体系。反应程序为：等温荧光扩增仪，鸡肉、鸭肉的检测温度分别设置为62℃和66℃,设置40个循环，每个循环30s。在样品等温扩增的同时，检测过程中应分别设立阳性对照和阴性对照。用已知含含鸡肉、鸭肉成分的样品DNA作阳性对照，用已知不含鸡肉、鸭肉成分的样品DNA作阴性对照，和空白对照（灭菌双蒸水），实验重复三次。9结果判定5T/HNSPXHXXX—XXXX若有FAM荧光检出，等温荧光扩增仪中出现S型或S型趋势的曲线，则判定样品含有鸡源性成分，表述为“检出鸡肉成分”;S曲线参考附录B；若有JOE荧光检出，等温荧光扩增仪中出现S型或S型趋势的曲线，则判定样品含有鸭源性成分，表述为“检出鸭肉成分”;S曲线参考附录B；如无FAM荧光检出，无S典型扩增曲线，则判定为不含鸡源性性成分，表述为“未检出鸡肉成分”;如无JOE荧光检出，无S典型扩增曲线，则判定为不含鸭源性成分，表述为“未检出鸭肉成分”;在样品梯型熔解温度等温扩增的同时，应设置梯型熔解温度等温扩增阴性对照、梯型熔解温度等温扩增阳性对照和梯型熔解温度等温扩增空白对照，实验重复三次。10检测过程中防止交叉污染的措施检测过程中防止交叉污染的措施应按照GB/T27403-2008中附录D的规定执行。附录A（规范性）/（材料性）鸡肉成分的基因扩增靶标参考序列AGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACCGGGGCCGAGGCCGGGCGTCCGGCCGAGCCGTGGCACGAGCGCGCGCGGGCGCGCAGCCTTCCCTTCCCTTCC注:下划线标记处为引物位置。鸭肉成分的基因扩增靶标参考序列AGTCGTAACAAGG