生物质能源转化原理与技术实验指导书

《生物质能源转化原理与技术》课堂实验/实践指导书课程中文名称：生物质能源转化原理与技术课程英文名称：BiomassEnergyTransformationPrinciple课程编号：021060380适用专业：新能源科学与工程学时数：总课时32（理论课28+实验4）学分数：2课程类别：专业课程应开课学期：第七学期实验/实践一：培养基的制备及厌氧菌群的培养实验/实践类型：演示实验/实践学时：2实验/实践要求：必做一、实验/实践目的掌握微生物实验室常用玻璃器皿的清洗；掌握培养基的配置方法以及厌氧菌的培养方法；掌握干热灭菌和高压蒸汽灭菌的操作方法；加深对理论知识的理解，培养动手和动脑相结合的实际操作能力。实验/实践内容1.根据要求清洗各种玻璃器皿；2.根据要求配制培养基，用高压蒸汽灭菌锅对所配各培养基灭菌；对矿井水中的厌氧菌群进行培养。三、实验材料及仪器设备1.培养基配方1）产甲烷菌富集基：每1000mL矿井水中加入1.0gNH4Cl、0.1gMgCl2·6H2O、0.4gK2HPO4·3H2O、0.2gKH2PO4、0.2gNa2S、2.0gNaHCO3、0.001gC12H7NO4、0.5gC3H7NO2S、2.0gHCOONa、2.0gCH3COONa、1.0g酵母膏、0.1g胰蛋白胨和10mL微量元素液。

2）微量元素液：每1000mL无菌去离子水中加入氨基三乙酸1.5g、MnSO4·2H2O0.5g、MgSO4·7H2O3.0g、FeSO4·7H2O0.1g、NaCl1.0g、CoCl2·6H2O0.1g、CaCl2·2H2O0.1g、CuSO4·5H2O0.01g、ZnSO4·7H2O0.1g、H3BO30.01g、AlK(SO4)20.01g、NiCl2·6H2O0.02g、Na2MoO40.01g。2.仪器设备恒温培养箱，往复式恒温摇床，pH计，血清瓶及配套设备，市售医用一次性无菌注射器。四、实验/实践原理、方法、手段和步骤一、实验原理：在培养厌氧微生物时，需要消除环境中的氧气并降低培养基的氧化还原势。消除氧气的方法有物理、化学和生物方法，或它们的综合使用。简单地介绍如下：(1).通无氧气体。向厌氧微生物培养的小环境和培养基中通入无氧气体，如高纯氮气和二氧化碳，即可基本驱除其中的氧气。(2).添加还原剂。向培养厌氧微生物的培养基中添加还原剂，如半胱氨酸和硫化钠，可消除其中的氧，降低培养基的氧化还原势。(3).碱性焦性没食子酸法。焦性没食子酸与碱溶液作用后形成易被氧化的碱性没食子盐，能通过氧化作用而形成黑、褐色的焦性没食子橙，从而除掉密封容器中的氧。该法操作简单，无需特殊和昂贵的设备，但其除氧速度较慢。对于一些厌氧要求较高的微生物，如产甲烷菌，单一的除氧方法无法达到其生长所需的厌氧程度，常需结合两种除氧方法。如对培养基进行除氧，制作预还原培养基时，常先向培养基中通高纯氮气，先去除培养基中的绝大部分的氧后，再往培养基中添加适量的还原剂，即可制成高度无氧的预还原培养基。二、实验步骤1.玻璃器皿的洗涤玻璃器皿在使用前必须洗刷干净。将三角瓶、试管、培养皿、量筒等浸入含有洗涤剂的水中．用毛刷刷洗，然后用自来水及蒸馏水冲净。移液管先用含有洗涤剂的水浸泡，再用自来水及蒸馏水冲洗。洗刷干净的玻璃器皿置于烘箱中烘干后备用。2.液体培养基的配制过程称量：一般可用0.01g天平称量配制培养基所需的各种药品，先按培养基配方计算出各成分的用量．然后进行准确称量。溶解：将称好的药品置于一烧杯中，先加入少量水(根据实验需要可用自来水或蒸馏水)，用玻璃棒搅动，加热溶解。定容：待全部药品溶解后，倒入一量筒中，加水至所需体积。如某种药品用量太少时，可预先配成较浓溶液，然后按比例吸取一定体积溶液，加入至培养基中。调pH：一般用pH试纸测定培养基的pH。用剪刀剪出一小段pH试纸，然后用镊子夹取此段pH试纸，在培养基中蘸一下，观看其pH范围，如培养基偏酸或偏碱时，可用1mol/LNaoH或1mol/LHCl溶液进行调节。调节pH时，应逐滴加入NaOH或HCI溶液，防止局部过酸或过碱，破坏培养基中成分。边加边搅拌，并不时用pH试纸测试，直至达到所需pH为止。过滤：用滤纸或多层纱布过滤培养基。一般无特殊要求时，此步可省去。3.培养基的灭菌培养基经分装包扎后，应立即按配制方法规定的灭菌条件进行进行高压蒸汽灭菌。灭菌后的培养基，一般需进行无菌检查。最好取出1~2管(瓶)，置于37℃温箱中培养1~2天，确定无菌后方可使用。4.无菌水的制备在每个250mL的三角瓶内装100mL的蒸馏水并塞上棉塞或硅胶塞。在每支试管内装4.5mL蒸馏水，塞上棉塞或硅胶塞。再在棉塞上包上一张牛皮纸，高压蒸汽灭菌。0.1MPa灭菌20~30min。5.厌氧菌培养将配制好的产甲烷菌富集培养基，装入到121℃灭菌后的锥形瓶中，充氮气2min后迅速密封，然后放置到恒温培养箱中，在35℃条件下厌氧发酵4d，得到产甲烷菌群的富集溶液。五、实验/实践结果处理对比三角瓶中菌体的生长以及产气情况（条件允许可拍照）并予以分析。六、实验/实践注意事项1．实验一般不允许学生请假，确因特殊情况需要请假，须事先经指导教师和主管教学院长批准；2．实验期间，不得迟到、早退，有事必须向指导教师请假，不得擅自离队。必须服从指挥、注意听讲、认真参观、多加思考、记好笔记；3．严格遵守组织纪律，禁止进入受限空间，遵守纪律，注意安全，未经实验室老师的许可，不得乱动任何设备。4．灭菌过程中，达到灭菌所需的时间后，切断电源，让灭菌锅温度自然下降，当压力表的压力降至“0”后，方可打开排气阀，排尽余下的蒸汽，旋松螺栓，打开锅盖，取出灭菌物品，倒掉锅内剩水。压力一定要降到“0”后，才能打开排气阀，开盖取物。否则就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基或试剂由于内外压力不平衡而冲出容器口，造成瓶口被污染，甚至灼伤操作者。七、预习与思考题简述配制培养基的基本步骤及注意事项。配制培养基时为什么要调节pH？高压蒸汽灭菌为什么比干热灭菌要求温度低、时间短？厌氧培养的基本原理以及注意事项。实验/实践二：厌氧发酵液液相成分检测实验/实践类型：演示实验/实践学时：2实验/实践要求：必做一、实验/实践目的1．熟悉厌氧发酵过程中液相成分的组成及含量，认识并使用测试仪器和主要器皿；2．掌握各种仪器性能及使用方法，熟悉各种液相成分测定的操作方法；3．加深对理论知识的理解，培养动手和动脑相结合的实际操作能力。二、实验/实践内容1．了解并认识发酵液液相成分所需仪器设备，熟悉液相成分测试流程以及操作过程中的规章和规定；2．了解并认识气相色谱-质谱联用仪的基本结构、工作原理，熟悉仪器操作流程以及操作过程中的规章和规定；三、仪器设备挥发性脂肪酸标准品、离心机、气相色谱-质谱联用仪、萃取仪、容量瓶、内标液、乙酸乙酯四、实验/实践原理、方法、手段和步骤一、实验原理：气相色谱-质谱联用仪是一种质谱仪，气相色谱的流动相为惰性气体，气-固色谱法中以表面积大且具有一定活性的吸附剂作为固定相。当多组分的混合样品进入色谱柱后，由于吸附剂对每个组分的吸附力不同，经过一定时间后，各组分在色谱柱中的运行速度也就不同。吸附力弱的组分容易被解吸下来，最先离开色谱柱进入检测器，而吸附力最强的组分最不容易被解吸下来，因此最后离开色谱柱。如此，各组分得以在色谱柱中彼此分离，顺序进入检测器中被检测、记录下来。质谱分析是一种测量离子荷质比（电荷-质量比）的分析方法，其基本原理是使试样中各组分在离子源中发生电离，生成不同荷质比的带正电荷的离子，经加速电场的作用，形成离子束，进入质量分析器。在质量分析器中，再利用电场和磁场使发生相反的速度色散，将它们分别聚焦而得到质谱图，从而确定其质量。二、实验步骤：1．标准溶液的配制根据需要配制合适浓度的标准工作液体待用。以挥发性脂肪酸为例：准确称取各短链脂肪酸对照品，用无水乙醇溶解并定容，得到7种标准品的单储备液，并加入50uLd4-乙酸内标溶液，根据需要配置系列工作溶液。2．样品前处理取冻存的样品，加1000μL乙酸乙酯溶液(含0.5%(V/V)浓HCl)，加入50uLd4-乙酸内标溶液，涡旋混匀，超声40min萃取，然后14000r/min离心10min，取上清液直接进行气相色谱质谱分析。3．仪器条件气相色谱分析条件为毛细管柱采用DB-FFAP毛细管色谱柱[30m（长度）×0.25mm（内径）×0.25m（膜厚）]，载气为氦气，载气流速为1.0mL/min；进样口温度：250℃，不分流。升温程序：初始温度50℃保持2min，以15℃/min升至120℃，以5℃/min升至170℃，以15℃/min升至240℃后保持3min。MS条件：电子轰击电离（EI）源，全扫及SIM扫描方式，电子能量70eV。五、实验/实践结果处理将混合标准品溶液逐级稀释成系列标准品溶液，以标准品浓度比上内标浓度x(μg/mL)为横坐标，以对照品的峰面积比上内标峰面积y为纵坐标，绘制标准曲线，计算样品中目标物含量。六、实验/实践注意事项1．实验一般不允许学生请假，确因特殊情况需要请假，须事先经指导教师和主管教学院长批准；2．实验期间，不得迟到、早退，有事必须向指导教师请假，不得擅自离队。必须服从指挥、注意听讲、认真参观、多加思考、记好笔记；3．严格遵守组织纪律，禁止进入受限空间，遵守纪律，注意安全，未