第3讲 基因工程、生物技术的安全性和伦理问题- 备战2024年高考生物大一轮复习课件

第十二单元第3讲

基因工程

生物技术的安全性和伦理问题AgendaSubtitlehere.........考点由高考知核心知识点预测基因工程

生物技术的安全性和伦理问题考点1基因工程的工具及其操作步骤（2023·北京卷）（2023·广东卷）（2023·浙江卷）（2023·湖南卷）（2023·湖北卷）（2023·山西卷）（2023·天津卷）（2023·山东卷）考点2生物技术伦理（2023·浙江卷）考点1基因工程的工具及其操作步骤（2022·北京卷）（2022·广东卷）（2022·重庆卷）（2022·辽宁卷）（2022·湖北卷）（2022·浙江卷）（2022·河北卷）（2022·山东卷）（2022·福建卷）（2022·天津卷）（2022·江苏卷）考点2生物技术伦理（2022·北京卷）（2022·辽宁卷）考基因工程是选修教材中的重点考察内容之一，基因工程的基本操作程序、蛋白质工程的原理是重高频考点，山东卷北京卷广东卷兼顾了实验“DNA的粗提取与鉴定”。1基因工程的基本工具2基因工程的基本操作程序及应用3蛋白质工程4DNA的粗提取和及电泳鉴定5生物技术的安全性和伦理问题1基因工程的基本工具1．基因工程的概念(1)手段：按照________________，通过____________等技术，赋予生物新的遗传

特性。(2)目的：创造出更符合人们需要的新的___________和___________。(3)水平：_______水平。(4)基础：___________、分子生物学和_________学等学科。（5）优点：克服远缘杂交不亲和的障碍，定向改造生物的_____________。)优人们的愿望转基因生物类型生物产品分子生物化学微生物遗传性状（2024届·广东深圳·一模）基因工程的发展离不开理论的突破和技术的创新。下列科学研究体现了基因工程正式问世的是（

）A．艾弗里等人通过肺炎链球菌的体外转化实验证明DNA可以转移B．沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型并提出自我复制假说C．科学家利用质粒构建重组DNA载体并导入受体细胞中成功表达D．科学家发现了多种限制性内切核酸酶、DNA连接酶和逆转录酶【答案】C1基因工程的基本工具2.基因工程的基本工具(3种工具，其中有2种工具酶)(1)限制性内切核酸酶(限制酶是一类酶，而不是一种酶)主要是原核生物来源1、特异性识别双链DNA分子作用形成黏性末端或平末端结果2、断开磷酸二酯键5’A脱氧核糖POC脱氧核糖POT脱氧核糖POG脱氧核糖POT脱氧核糖POA脱氧核糖POG脱氧核糖POC脱氧核糖PO5’3’3’1基因工程的基本工具AGTCATTCGATAGGATCATCATAT

大肠杆菌(E.coli)的EcoRⅠ限制酶能特异性识别

_________序列，并切割___和___之间的____________。切割后产生__________。GAATTCGA磷酸二酯键黏性末端EcoRI限制酶限制酶种类：1基因工程的基本工具种类：CCCGGGGGGCCCGGGCCCCCCGGGSmaI限制酶只能识别

序列，切割

和

之间的

切开，切割后产生

。CCCGGGCG磷酸二酯键平末端SmaI限制酶限制酶1基因工程的基本工具①限制酶的识别序列与被作用的DNA序列是不同的。前者一般由6个核苷酸组成，少数由4个、8个或其他数量的核苷酸组成；后者是双链序列。②判断黏性末端是否由同一种限制酶切割形成的方法是将黏性末端旋转180°，同一种限制酶切割形成的黏性末端应该是完全相同的结构。③限制酶作用的化学键只能是磷酸二酯键，而不能是氢键。④在切割含目的基因的DNA分子时，需用限制酶切割两次此DNA分子，产生4个末端。只有这样，才能使目的基因的两端都有可连接的黏性末端或平末端。注意要点1基因工程的基本工具根据目的基因两端的限制酶切割位点、质粒上的限制酶切割位点以及是否破坏目的基因和标记基因来确定限制酶的种类。限制酶的选择方法1基因工程的基本工具(1)应选择酶切位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ；不能选择酶切位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。(3)切割质粒的限制酶不能同时切开质粒上的所有标记基因，即至少要保留一个标记基因，以用于重组DNA的鉴定和选择，如图乙中的质粒不能使用SmaⅠ切割。(2)为避免目的基因及质粒的自身环化、反向连接，也可使用不同的限制酶(非同尾酶)切割目的基因所在片段和质粒(双酶切)，如图甲可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)。(2023湛江一模节选改编)下图是A基因和质粒上限制酶切割位点示意图该过程需要选择

限制酶切割A基因和质粒。XbaⅠ和HindⅢ(2024江门一模)16、在构建基因表达载体时，传统方法常受限于限制酶识别序列。科研人员研发了新的DNA重组方法:In-Fusion技术。该技术关键是要在目的基因两端构建与线性化质粒末端相同的DNA序列（即同源序列），然后用In-Fusion酶处理，使同源序列形成黏性末端，最终形成的重组质粒会在受体细胞内形成完整的重组序列。主要操作过程如图示。下列叙述错误的是（

）A.推测In-Fusion酶的作用是识别同源序列、形成黏性末端、连接磷酸二酯键B.载体A端和B端的序列不同，可防止目的基因与质粒反向连接及自身环化C.形成重组质粒时，如果温度远高于50℃，黏性末端的碱基不容易互补配对D.该技术无需识别特定切割位点，需识别目的基因与线性质粒任意同源序列【答案】A（2023·山西·统考高考真题）某同学拟用限制酶（酶1、酶2、酶3和酶4）、DNA连接酶为工具，将目的基因（两端含相应限制酶的识别序列和切割位点）和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。

下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是（

）A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coliDNA连接酶连接B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4DNA连接酶连接C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4DNA连接酶连接D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coliDNA连接酶连接【答案】C1基因工程的基本工具(2)DNA连接酶。--“分子缝合针”把切下来的DNA片段拼接成新的DNA，即将

和

连接起来催化形成

。

脱氧核糖磷酸磷酸二酯键类型来源功能相同点差别E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶大肠杆菌T4噬菌体恢复磷酸二酯键只能连接黏性末端能连接黏性末端和平末端(效率较低)【小结】E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶的区别1基因工程的基本工具DNA连接酶DNA聚合酶相同点作用实质化学本质不同点模板作用对象作用结果用途都能催化形成磷酸二酯键都是蛋白质 不需要需要形成完整的重组DNA分子形成DNA的一条链基因工程DNA复制【小结】DNA连接酶与DNA聚合酶的比较只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键（2023·湖北·统考高考真题节选）某病毒对动物养殖业危害十分严重。我国学者拟以该病毒外壳蛋白A为抗原来制备单克隆抗体，以期快速检测该病毒，其主要技术路线如图所示。(4)构建重组质粒需要使用DNA连接酶。下列属于DNA连接酶底物的是

。④1基因工程的基本工具（3）载体--“分子运输车”载体的作用载体的必要条件载体的种类①能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。②具一个或多个限制酶切点，以便与外源基因连接。③具有某些标记基因，便于进行鉴定和选择。④必须是安全的，对受体细胞无害。①作为运载工具，将目的基因导入受体细胞中②在受体细胞内对目的基因进行大量复制①细菌的质粒②病毒：λ噬菌体衍生物、动植物病毒等。基因工程中的载体是DNA分子，膜载体是蛋白质。1基因工程的基本工具根据质粒的特点确定限制酶的种类。①切割质粒的限制酶要与切割目的基因的限制酶一致，以确保具有相同的黏性末端。②目的基因的表达需要调控序列，质粒插入目的基因部位之前有启动子，之后需有终止子。③质粒作为载体必须具备标记基因、启动子和终止子等，选择的限制酶尽量不要破坏这些结构。④如果所选限制酶的切点不止一个，则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。1基因工程的基本工具标记基因的作用标记基因可用于检测目的基因是否导入受体细胞。被转化的细菌有三种：含环状目的基因的细菌、含重组质粒的细菌、含质粒的细菌。筛选方法：将细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组质粒的细菌和含质粒的细菌，如上图1、2、3、4、5菌落。再利用灭菌的绒布影印到含有四环素的培养基上，如上图能生长的菌落为2、3、4，则在含四环素培养基上不生长的即为含有目的基因的菌落，如上图1、5菌落。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。（2023·湖北·统考高考真题）用氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、四环素抗性基因（TetR）作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体（重组质粒），并转化到受体菌中。下列叙述错误的是（）A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）和Tet的培养基中能形成菌落【答案】D2基因工程的基本操作程序及应用1．目的基因的筛选与获取(1)筛选合适的目的基因①目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变______________或获得______________等的基因。主要是指______________的基因。②筛选目的基因的方法：从相关的已知____________清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。受体细胞性状预期表达产物编码蛋白质结构和功能（2）目的基因的获取方法①利用PCR获取和扩增目的基因②人工合成目的基因③从基因文库中获取目的基因2基因工程的基本操作程序及应用①概念：PCR全称为___________________，是一项在生物________复制___________________的核酸合成技术聚合酶链式反应体外特定DNA片段②PCR利用的原理是______________DNA复制利用PCR获取和扩增目的基因DNA复制所需的基本条件参与的组分在DNA复制中的作用解旋酶DNA母链4种脱氧核苷酸DNA聚合酶引物打开DNA双链提供DNA复制的模板合成DNA子链的原料催化合成DNA子链使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸2基因工程的基本操作程序及应用905072℃3`5`5`3`耐高温的DNA聚合酶引物1引物24种脱氧核苷酸模板DNA目的基因主要是DNA单链或RNAPHOPOH③PCR技术所需的基本条件利用PCR获取和扩增目的基因2基因工程的基本操作程序及应用参与的组分在PCR中的作用

前提条件高温模板DNA4种脱氧核苷酸耐高温的DNA聚合酶引物一定的缓冲溶液(Mg2＋)打开DNA双链提供DNA复制的模板合成DNA子链的原料催化合成DNA子链使耐高温的DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸已知基因的核苷酸序列提供合适的酸碱度和离子，DNA聚合酶需要Mg2＋激活2基因工程的基本操作程序及应用④PCR过程905072℃延伸905072℃变性905072℃复性利用PCR获取和扩增目的基因2基因工程的基本操作程序及应用④PCR过程利用PCR获取和扩增目的基因905072℃变性3`5`5`3`2基因工程的基本操作程序及应用④PCR过程利用PCR获取和扩增目的基因905072℃复性2基因工程的基本操作程序及应用④PCR过程利用PCR获取和扩增目的基因905072℃延伸2基因工程的基本操作程序及应用④PCR过程利用PCR获取和扩增目的基因905072℃变性2基因工程的基本操作程序及应用④PCR过程利用PCR获取和扩增目的基因905072℃复性2基因工程的基本操作程序及应用④PCR过程利用PCR获取和扩增目的基因905072℃延伸2基因工程的基本操作程序及应用905072℃变性2基因工程的基本操作程序及应用905072℃复性2基因工程的基本操作程序及应用905072℃延伸2基因工程的基本操作程序及应用④PCR过程利用PCR获取和扩增目的基因a、变性（超过90℃）：双链DNA模板在热作用下，

断裂，形成

。

b、复性（下降到50℃）：系统温度降低，引物与DNA模板通过碱基互补配对，形成局部

。c、延伸（上升到72℃）：在TaqDNA聚合酶的作用下，溶液中的的

在

的作用下，根据碱基互补配对原则，合成与模板互补的

的新的DNA链。氢键单链DNA双链4种脱氧核苷酸5′端→3′端耐高温的DNA聚合酶2基因工程的基本操作程序及应用利用PCR获取和扩增目的基因⑤反应的结果：以_______方式扩增，即______（n为扩增循环的次数）

指数2n⑥采用

来鉴定PCR的产物。琼脂糖凝胶电泳2基因工程的基本操作程序及应用比较PCR技术与体内DNA复制项目PCR技术体内DNA复制相同点原则原料条件碱基互补配对原则四种脱氧核苷酸均需要模板、引物、酶等2基因工程的基本操作程序及应用比较PCR技术与体内DNA复制项目PCR技术体内DNA复制相同点场所解旋方式酶引物特点ATP温度条件结果细胞外（主要在PCR仪内）细胞内（主要在细胞核内）耐高温的DNA聚合酶解旋酶催化DNA在高温下变性解旋解旋酶、DNA聚合酶小段RNA或单链DNA分子一小段RNA体外迅速扩增生物体内边解旋边复制不需要需要在较高温度下进行细胞内温和的条件短时间形成大量DNA片段形成完整的DNA分子（2022·辽宁·统考高考真题）抗虫和耐除草剂玉米双抗12-5是我国自主研发的转基因品种。为给监管转基因生物安全提供依据，采用PCR方法进行目的基因监测，反应程序如图所示。下列叙述正确的是（

）A．预变性过程可促进模板DNA边解旋边复制B．后延伸过程可使目的基因的扩增更加充分C．延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制D．转基因品种经检测含有目的基因后即可上市【答案】B2基因工程的基本操作程序及应用2．基因表达载体的构建——核心(1)构建基因表达载体的目的①使目的基因在受体细胞中____________，并且可以________给下一代。②使目的基因能够________和发挥作用。(2)基因表达载体的组成上游RNA聚合酶转录目的基因下游标记基因稳定存在遗传表达2基因工程的基本操作程序及应用①用一定的_________切割质粒，使其出现一个切口，露出__________。②用_____________切断目的基因，使其产生_____________________。③将切下的目的基因片段插入质粒的______处，再加入适量___________，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）。限制酶黏性末端同一种限制酶的黏性末端切口DNA连接酶相同(3)基因表达载体的构建过程(1)基因表达载体≠载体：基因表达载体与载体相比增加了目的基因。(2)目的基因的插入位点不是随意的：基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入到启动子与终止子之间的部位，若目的基因插入到启动子内部，启动子将失去其功能。(3)启动子≠起始密码子，终止子≠终止密码子：启动子和终止子位于DNA片段上，分别控制转录过程的启动和终止；起始密码子和终止密码子位于mRNA上，分别控制翻译过程的启动和终止。易错分析基因表达载体的构建过程易错分析2基因工程的基本操作程序及应用3．将目的基因导入受体细胞类型方法说明特点植物细胞农杆菌转化法将目的基因插入农杆菌Ti质粒的__________上→转入农杆菌→用农杆菌侵染植物细胞→将目的基因整合到植物细胞的______________上→目的基因表达经济、有效，适用于双子叶植物和裸子植物，尤其适用于双子叶植物，但单子叶植物也获得了成功T­DNA染色体DNA2基因工程的基本操作程序及应用类型方法说明特点植物细胞花粉管通道法用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入____中；在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在__________上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊简便、经济，我国科学家独创的一种方法3．将目的基因导入受体细胞目的基因目的基因子房花柱切面2基因工程的基本操作程序及应用类型方法说明特点动物细胞显微注射技术将含有目的基因的__________→显微注射到受精卵中→注射了目的基因的受精卵，经____________后，移植到雌性动物的输卵管或子宫内→获得具有新性状的动物将目的基因导入动物细胞最为有效的方法3．将目的基因导入受体细胞表达载体胚胎早期培养2基因工程的基本操作程序及应用3．将目的基因导入受体细胞类型方法说明特点微生物细胞Ca2＋处理法Ca2＋处理细胞→细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的__________→基因表达载体导入简便、经济、有效生理状态（2023·广东·统考高考真题）种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥（2n=10）进行诱变筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序，发现野生型DAI基因发生一个碱基G到A的替换，突变后的基因为隐性基因，据此推测突变体的表型与其有关，开展相关实验。回答下列问题：(1)拟采用农杆菌转化法将野生型DAI基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与

植株的种子大小相近。(2)用PCR反应扩增DAI基因，用限制性核酸内切酶对PCR产物和

进行切割，用DNA连接酶将两者连接。为确保插入的DAI基因可以正常表达，其上下游序列需具备

。野生型运载体

启动子和终止子(3)转化后，T-DNA（其内部基因在减数分裂时不发生交换）可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下，选出单一位点插入的植株，并进一步获得目的基因稳定遗传的植株（如图），用于后续验证突变基因与表型的关系。①农杆菌转化T0代植株并自交，将T1代种子播种在选择培养基上，能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了

。②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基，选择阳性率约

%的培养基中幼苗继续培养。75DAI基因和卡那霉素抗性基因③将②中选出的T2代阳性植株

（填“自交”、“与野生型杂交”或“与突变体杂交”）所得的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基，阳性率达到

%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。为便于在后续研究中检测该突变，研究者利用PCR扩增野生型和突变型基因片段，再使用限制性核酸内切酶X切割产物，通过核酸电泳即可进行突变检测，相关信息见下，在电泳图中将酶切结果对应位置的条带涂黑

。自交

1002基因工程的基本操作程序及应用4.目的基因的检测与鉴定2基因工程的基本操作程序及应用个体生物学水平的检测转基因生物鉴定方法成功标志抗虫植物抗病毒（菌）植物抗盐植物抗除草剂植物获取目的基因产物的转基因生物饲喂害虫（抗虫接种实验）害虫死亡病毒（菌）感染（抗病接种实验）未出现病斑盐水浇灌正常生长喷洒除草剂正常生长功能、活性正常提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较4.目的基因的检测与鉴定(3)在食品工业方面的应用：利用基因工程菌生产食品工业用酶、_____________________等。2基因工程的基本操作程序及应用(1)基因工程在农牧业方面的应用：转基因______植物、转基因______植物、转基因__________植物、改良植物的品质、提高动物的__________、改善畜产品的品质。5.基因工程的应用(2)基因工程在医药卫生领域的应用：①对_________________________进行基因改造，使它们生产药物。②让哺乳动物批量生产__________。③尝试将建立_____________工厂的设想成为现实。抗虫抗病抗除草剂生长速率微生物或动植物的细胞药物移植器官氨基酸和维生素2基因工程的基本操作程序及应用乳腺生物反应器与工程菌生产药物的区别比较内容乳腺生物反应器工程菌含义指将外源基因在哺乳动物的乳腺中特异表达，利用动物的乳腺组织生产药物蛋白指用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类基因表达合成的药物蛋白与天然蛋白质相同微生物合成的药物蛋白可能没有活性2基因工程的基本操作程序及应用比较内容乳腺生物反应器工程菌受体细胞动物受精卵微生物细胞目的基因导入方式显微注射法感受态细胞法生产条件不需严格灭菌；温度等外界条件对其影响不大需严格灭菌，严格控制工程菌所需的温度、pH、营养物质浓度等外界条件药物提取从动物乳汁中提取从微生物细胞或其培养液中提取乳腺生物反应器与工程菌生产药物的区别（2023·北京·统考高考真题）变胖过程中，胰岛B细胞会增加。增加的B细胞可能源于自身分裂（途径I），也可能来自胰岛中干细胞的增殖、分化（途径Ⅱ）。科学家采用胸腺嘧啶类似物标记的方法，研究了L基因缺失导致肥胖的模型小鼠IK中新增B细胞的来源。(1)EdU和BrdU都是胸腺嘧啶类似物，能很快进入细胞并掺入正在复制的DNA中，掺入DNA的EdU和BrdU均能与

互补配对，并可以被分别检测。未掺入的EdU和BrdU短时间内即被降解。(2)将处于细胞周期不同阶段的细胞混合培养于多孔培养板中，各孔同时加入EdU，随后每隔一定时间向一组培养孔加入BrdU，再培养十几分钟后收集该组孔内全部细胞，检测双标记细胞占EdU标记细胞的百分比（如图）。图中反映DNA复制所需时长的是从

点到

点。

A/腺嘌呤QR（2023·山东·高考真题）科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。(1)与图甲中启动子结合的酶是

。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有

（答出2个结构即可）。(2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物

。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的

（填“a链”或“b链”）相应部分的序列相同。RNA聚合酶限制酶切割位点、标记基因、复制原点等F2和R1或F1与R2

a链(3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了

，条带2所检出的蛋白

（填“是”或“不是”）由重组质粒上的J基因表达的。J-V5融合蛋白不是（2022·福建·统考高考真题·节选）美西螈具有很强的再生能力。研究表明，美西螈的巨噬细胞在断肢再生的早期起重要作用。为研究巨噬细胞的作用机制，科研人员制备了抗巨噬细胞表面标志蛋白CD14的单克隆抗体，具体方法如下。回答下列问题：（一）基因工程抗原的制备(1)根据美西螈CD14基因的核苷酸序列，合成引物，利用PCR扩增CD14片段。已知DNA聚合酶催化引物的3’—OH与加入的脱氧核苷酸的5’—P形成磷酸二酯键，则新合成链的延伸方向是

（填“5’→3’”或“3’→5’”）。5'→3'(2)载体和CD14片段的酶切位点及相应的酶切抗性基因序列如图1所示。用XhoI和Sal1分别酶切CD14和载体后连接，CD14接入载体时会形成正向连接和反向连接的两种重组DNA．可进一步用这两种限制酶对CD14的连接方向进行鉴定，理由是

。培养能表达CD14蛋白的大肠杆菌，分离纯化目的蛋白。正向连接的重组DNA有这两种酶切位点（限制酶的识别序列）；而反向连接的重组DNA会形成新的序列，没有这两种酶的酶切位点（没有限制酶的识别序列）（2022·辽宁·统考高考真题）某抗膜蛋白治疗性抗体药物研发过程中，需要表达N蛋白胞外段，制备相应的单克隆抗体，增加其对N蛋白胞外段特异性结合的能力。Ⅰ．N蛋白胞外段抗原制备，流程如图1(1)构建重组慢病毒质粒时，选用氨苄青霉素抗性基因作为标记基因，目的是

。用脂质体将重组慢病毒质粒与辅助质粒导入病毒包装细胞，质粒被包在脂质体

（填“双分子层中”或“两层磷脂分子之间”）。(2)质粒在包装细胞内组装出由

组成的慢病毒，用慢病毒感染海拉细胞进而表达并分离、纯化N蛋白胞外段。检测目的基因是否成功导入受体细胞双分子层中蛋白质外壳和含N蛋白胞外段基因的核酸（2022·天津·高考真题·节选）研究者拟构建高效筛选系统，将改进的苯丙氨酸合成关键酶基因P1导入谷氨酸棒杆菌，以提高苯丙氨酸产量。(1)如图是该高效筛选系统载体的构建过程。载体1中含有KanR（卡那霉素抗性基因）和SacB两个标记基因，为去除筛选效率较低的SacB，应选择引物

和

，并在引物的

（5＇∕3＇）端引入XhoⅠ酶识别序列，进行PCR扩增，产物经酶切、连接后环化成载体2。(2)PCR扩增载体3中筛选效率较高的标记基因RpsL（链霉素敏感基因）时，引物应包含

（EcoRⅠ∕HindⅢ∕XhoⅠ）酶识别序列，产物经单酶切后连接到载体2构建高效筛选载体4。145＇XhoⅠ(3)将改进的P1基因整合到载体4构建载体5。将载体5导入链霉素不敏感（由RpsL突变造成）、卡那霉素敏感的受体菌。为获得成功导入载体5的菌株，应采用含有

的平板进行初步筛选。(4)用一定的方法筛选出如下菌株：P1基因脱离载体5并整合到受体菌拟核DNA，且载体5上其他DNA片段全部丢失。该菌的表型为__________。A．卡那霉素不敏感、链霉素敏感B．卡那霉素敏感、链霉素不敏感C．卡那霉素和链霉素都敏感D．卡那霉素和链霉素都不敏感(5)可采用

技术鉴定成功整合P1基因的菌株。之后以发酵法检测苯丙氨酸产量。卡那霉素BPCR（2022·北京·统考高考真题）生态文明建设已成为我国的基本国策。水中雌激素类物质（E物质）污染会导致鱼类雌性化等异常，并通过食物链影响人体健康和生态安全。原产南亚的斑马鱼，其肌细胞、生殖细胞等存在E物质受体，且幼体透明。科学家将绿色荧光蛋白（GFP）等基因转入斑马鱼，建立了一种经济且快速的水体E物质监测方法。(1)将表达载体导入斑马鱼受精卵的最佳方式是

。(2)为监测E物质，研究者设计了下图所示的两种方案制备转基因斑马鱼，其中ERE和酵母来源的UAS是两种诱导型启动子，分别被E物质-受体复合物和酵母来源的Gal4蛋白特异性激活，启动下游基因表达。与方案1相比，方案2的主要优势是

，因而被用于制备监测鱼（MO）。显微注射监测灵敏度更高(3)现拟制备一种不育的监测鱼SM，用于实际监测。SM需经MO和另一亲本（X）杂交获得。欲获得X，需从以下选项中选择启动子和基因，构建表达载体并转入野生型斑马鱼受精卵，经培育后进行筛选。请将选项的序号填入相应的方框中。Ⅰ.启动子：

。①ERE②UAS③使基因仅在生殖细胞表达的启动子（P生）④使基因仅在肌细胞表达的启动子（P肌）Ⅱ.基因：

。

A．GFPB．Gal4C．雌激素受体基因（ER）

D．仅导致生殖细胞凋亡的基因（dg）(4)SM不育的原因是：成体SM自身产生雌激素，与受体结合后

造成不育。(5)使拟用于实际监测的SM不育的目的是

。②D激活ERE诱导Gal4表达，Gal4结合UAS诱导dg表达，生殖细胞凋亡避免转基因斑马鱼逃逸带来生物安全问题（2022·广东·高考真题）“绿水逶迤去，青山相向开”大力发展低碳经济已成为全社会的共识。基于某些梭菌的特殊代谢能力，有研究者以某些工业废气（含CO2等一碳温室气体，多来自高污染排放企业）为原料，通过厌氧发酵生产丙酮，构建一种生产高附加值化工产品的新技术。回答下列问题：(1)研究者针对每个需要扩增的酶基因（如图）设计一对

，利用PCR技术，在优化反应条件后扩增得到目标酶基因。引物

(2)研究者构建了一种表达载体pMTL80k，用于在梭菌中建立多基因组合表达库，经筛选后提高丙酮的合成量。该载体包括了启动子、终止子及抗生素抗性基因等，其中抗生素抗性基因的作用是

，终止子的作用是

。(3)培养过程中发现重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，出现了生长迟缓的现象，推测其原因可能是

，此外丙酮的积累会伤害细胞，需要进一步优化菌株和工艺才能扩大应用规模。(4)这种生产高附加值化工产品的新技术，实现了

，体现了循环经济特点。从“碳中和”的角度看，该技术的优势在于

，具有广泛的应用前景和良好的社会效益。作为标记基因，筛选含有基因表达载体的受体细胞

终止转录，使转录在需要的地方停下来二氧化碳等气体用于大量合成丙酮，而不是用于重组梭菌的生长废物的资源化

不仅不排放二氧化碳，而且还可以消耗工业废气中的二氧化碳（2024届·广东深圳·一模）番茄在种植过程中容易发生虫害。研究人员将双价抗虫载体转入番茄中，获得具有抗虫特性的转基因番茄。图为所用载体的部分结构示意图，其中Bar为除草剂抗性基因，Cry1Ac为苏云金杆菌毒蛋白基因，Pta为半夏凝集素基因。回答下列问题：(1)双价抗虫载体中的P1、P2和P3是属于基因表达载体中的

，其作用是

。(2)构建的载体通常用

法转入到番茄子叶中并进行植物组织培养，并在培养基中添加

用于筛选转基因番茄。

启动子

RNA聚合酶识别和结合的位点农杆菌转化法

除草剂(3)为验证Pta基因是否转入番茄基因组中，研究人员使用

技术筛选转基因番茄中的Pta基因，再进行凝胶电泳鉴定，结果如图所示。图中①为阳性对照，②为阴性对照，③为待测植株，试分析③中出现2条条带的可能原因是

。(4)对于成功转化的番茄植株还需进一步进行抗虫鉴定，研究人员选取3株阳性转基因番茄进行小菜蛾幼虫抗性实验，结果如下表。株系编号CK123幼虫致死率（%）039.86.548.9注：CK表示对照由表中可知，株系2的幼虫致死率较低，推测其可能原因是

。PCR

所使用的的Pta引物特异性不高抗虫基因在转基因番茄株系2的表达水平比较低（2024届·广东省·一模）健康的生活方式、乐观的心态和定期体检是预防癌症的主要手段。（CAR-T细胞疗法是治疗血液恶性肿瘤及淋巴瘤的研究热点，我国首款新型肿瘤治疗方法——CAR-T产品于2021年上市。左图为CAR-T细胞疗法的原理示意图，该疗法借助基因工程和细胞工程技术，根据CAR蛋白（右图）是多种肿瘤的嵌合抗原受体的特点而设计。

回答下列问题：(1)机体肿瘤的发生主要与免疫系统的

功能降低有关。(2)图中过程①称为

，这是基因工程的核心步骤，需要用到的工具酶有

。过程②最常用的方法是

。CAR-T细胞输入患者体内后，其活化需要两个信号的刺激，具体是

。免疫监视基因表达载体的构建

限制酶和DNA连接酶显微注射法

CAR蛋白与肿瘤细胞表面抗原结合；细胞因子刺激

(3)据图可知，CAR-T细胞疗法相对传统的药物化疗和放疗而言，具有

（请写出两点）的突出优点。(4)CAR-T细胞在治疗肺癌、肝癌、乳腺癌等实体瘤的总体效果上还不尽如人意，请根据右图并结合特异性免疫的原理，提出一种CAR蛋白改造的简单思路，以提升CAR-T细胞对实体瘤的疗效：

。治疗更精准、免疫排斥反应少、杀瘤效果更持久、杀瘤范围更广改造胞外识别区，使CAR蛋白能与更多实体瘤的癌细胞结合；改造胞内信号域，更好调控CAR-T细胞的活化与增殖3蛋白质工程蛋白质工程(第二代基因工程，生产自然界中不存在的蛋白质)(1)概念：以蛋白质分子的___________及其与生物功能的关系作为基础，通过_____________基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。(2)操作手段和结果结构规律改造或合成基因改造基因合成改造现有蛋白质制造新的蛋白质结

果结

果3蛋白质工程(3)基本思路蛋白质工程：预期的蛋白质功能出发设计预期的蛋白质结构推测应有的氨基酸序列找到并改变相应的脱氧核苷酸序列酸3蛋白质工程(4)蛋白质工程的应用①医药工业方面：研发药物，如延长干扰素的保存时间；降低小鼠单克隆抗体诱发免疫反应的强度。②其他工业方面：改进____的性能或开发新的______________。③农业方面：通过改造某些__________________________，增加粮食产量；改造微生物____________________，设计优良微生物农药，防治病虫害。酶工业用酶参与调控光合作用的酶蛋白质的结构3蛋白质工程项目蛋白质工程基因工程操作对象操作起点操作水平操作流程结果实质联系基因基因DNA分子水平DNA分子水平预期蛋白质功能→设计蛋白质结构→推测氨基酸序列→找到并改变对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新基因→获得所需要的蛋白质目的基因的筛选与获取→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定可生产自然界没有的蛋白质生产自然界已有的蛋白质通过改造或合成基因来定向改造现有蛋白质或制造新的蛋白质将一种生物的基因转移到另一种生物体内，后者可以产生它本不能产生的蛋白质，进而表现出新的性状①蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程；②蛋白质工程离不开基因工程，其包含基因工程的基本操作。预期蛋白质功能目的基因（5）蛋白质工程和基因工程的比较4DNA的粗提取和电泳鉴定1．DNA的粗提取与鉴定(1)实验原理酒精NaCl溶液2mol/L蓝色4DNA的粗提取和及电泳鉴定(2)实验步骤10mL研磨液4℃冰箱放置95%的酒精二苯胺试剂1．DNA的粗提取与鉴定4DNA的粗提取和及电泳鉴定2．DNA片段的扩增及电泳鉴定(1)实验原理①PCR原理：利用了_________________原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。②电泳：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷_______的电极移动，这个过程就是电泳。③PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的________________等有关。DNA的热变性相反大小和构象4DNA的粗提取和及电泳鉴定(2)实验步骤微量移液器离心管底部RCR仪(3)DNA的测定：凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为_______的紫外灯下被检测出来。300nm易错分析1．DNA的粗提取与鉴定的注意事项(1)加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。(2)本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核(无DNA)。可选用鸡血细胞作为材料。(3)鉴定DNA时，一支试管为对照组，另一支试管为实验组。两支试管中都先加物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液；在实验组试管中加DNA丝状物，对照组不加；加入二苯胺试剂后沸水浴加热。结果可以看到加DNA丝状物的试管呈现蓝色，对照组无色。如果实验组蓝色较浅，说明提取出的DNA量太少。易错分析2．DNA片段的扩增及电泳鉴定(1)为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。(2)该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在－20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。(3)在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换，避免试剂的污染。(4)在进行操作时，一定要戴好一次性手套。(5)观察DNA带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。（2023·广东·统考高考真题）“DNA粗提取与鉴定”实验的基本过程是：裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是（

）A．裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质B．分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等C．沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度D．鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色【答案】D（2022·北京·统考高考真题）下列高中生物学实验中，对实验结果不要求精确定量的是（）A．探究光照强度对光合作用强度的影响B．DNA的粗提取与鉴定C．探索生长素类调节剂促进插条生根的最适浓度D．模拟生物体维持pH的稳定【答案】B（2022·山东·高考真题）关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是（

）A．过滤液沉淀过程在4℃冰箱中进行是为了防止DNA降解B．离心研磨液是为了加速DNA的沉淀C．在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色D．粗提取的DNA中可能含有蛋白质【答案】B（2022·河北·统考高考真题·改编）人染色体DNA中存在串联重复序列，对这些序列进行体外扩增、电泳分离后可得到个体的DNA指纹图谱。该技术可用于亲子鉴定和法医学分析。下列叙述错误的是（）A．DNA分子的多样性、特异性及稳定性是DNA鉴定技术的基础B．串联重复序列在父母与子女之间的遗传遵循孟德尔遗传定律C．指纹图谱显示的DNA片段属于人体基础代谢功能蛋白的编码序列D．串联重复序列突变可能会造成亲子鉴定结论出现错误【答案】C（2023·浙江·统考高考真题）某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因（GFP）整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得Gata3-GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。下列叙述正确的是（）A．Gata3基因的启动子无法控制GFP基因的表达B．翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白C．2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是Gata3-GFP基因纯合子D．若用引物1和引物3进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子【答案】B（2024届·广东汕头·一模）镉（Cd）是重金属污染物，具有极强毒性。烟草作为重要的经济作物，在生长过程中容易富集Cd，Cd通过烟气进入人体，长期积累可能会引发疾病。N1NRAMP3是定位于液泡膜参与Cd转运的蛋白，研究人员以普通烟草为材料，通过转基因技术研究NINRAMP基因的功能，为研究烟草在Cd胁迫中的适应机制提供理论基础。回答下列问题：(1)从数据库获得NtNRAMP基因的序列，设计引物F和R后利用

技术扩增得到NtNRAMP基因的cDNA片段，测序鉴定。使用AscI、SpeI和DNA连接酶等酶将NINRAMP连接到pCambia300-221质粒的T-DNA区域中（图为该T-DNA的左边界至右边界），得到重组质粒pCambia300-NtNRAMP。图示使用AscI、SpeI的过程是

（填图中的数字）。PCR②(2)将pCambia300-NtNRAMP转入农杆菌，培养基中添加了琼脂与潮霉素，两者的作用分别是形成

培养基以便得到单菌落、筛选

。含pCambia300-NtNRAMP的农杆菌与烟草愈伤组织共培养，培养后得到12株烟草植株。提取烟草细胞的核DNA用引物F和R进行扩增，对转基因烟草进行鉴定。若扩增到特异性DNA片段，则说明

。(3)上述烟草植株经PCR检测和电泳后，结果如图所示：为进一步研究转基因烟草在不同镉浓度胁迫下的NtNRAMP表达量变化，请从上述植株选取适宜的材料，简要写出实验探究思路

（要求写出所选3株植株的编号）。注：CK为阴性对照；1~12为待检测植株；A为空白对照；B为pCambia300-NtNRAMP。固体

含重组质粒（抗潮霉素））的菌株目的基因成功导入烟草细胞用一系列浓度的镉处理CK植株、6号植株和7号植株，检测并比较各种处理下3株植物的NtNRAMP表达量5生物技术的安全性和伦理问题1.转基因产品的安全性（1）在转基因微生物方面的成果①对微生物的基因改造的优点:微生物具有生理结构和遗传物质简单、生长繁殖快，对环境因素敏感和容易进行遗传物质操作等优点。②对微生物的基因改造的成果:用来减少啤酒酵母双乙酰的生成，缩短啤酒的发酵周期。构建高产、优质的基因工程菌生产氨基酸。用工程菌生产药物已经几乎涉及各种疾病的治疗。研究最早的领域5生物技术的安全性和伦理问题（2）转基因动物方面:①将生长激素基因、促生长激素释放激素基因转入动物体内，培育出大批生长迅速、营养品质优良的转基因家畜、家禽；③建立某些人类疾病的转基因动物模型，模拟疾病的发生和发展过程，为研究该疾病的致病机制和开发治疗药物提供依据。②导入某些抗病毒基因，培育抵抗相应病毒的动物新品种；1.转基因产品的安全性5生物技术的安全性和伦理问题（3）转基因植物方面科学家已经培育出了大批具有抗虫，抗病，抗除草剂和耐储藏等新性状的农作物，如：大豆，玉米，棉花，油菜，水稻等。转基因大豆可以抵抗杀草剂——草甘膦（毒滴混剂）同时出油率比普通大豆高3~5%。普通番茄转基因耐储存番茄抑制乙烯形成1.转基因产品的安全性5生物技术的安全性和伦理问题（4）理性看待转基因技术

转基因作为一项技术本身是中性的，由这项技术研发出来的产品需要经过一系列的安全性评价，符合相应标准后才能上市。理性看待转基因技术不是人云亦云，更不是诋毁科学创新、造谣惑众，而是需要以完备的相关科学知识为基础，既清晰地了解转基因技术的原理和操作规程；要靠确凿的证据和严谨的逻辑进行思考和辩论。社会舆论导向正确了，往往有利于决策者作出正确的决策，从而促进科学技术的发展；相反，舆论导向不正确将可能阻碍科学技术的发展。5生物技术的安全性和伦理问题2.关注生殖性克隆人(1)生殖性克隆人面临的伦理问题。①生殖性克隆人“有违人类尊严”。③克隆技术尚不成熟，面临构建重构胚胎成功率低，胚胎移植到母体子宫后着床率低、流产率高、胎儿畸形率高和出生后死亡率高等问题。②生殖性克隆人是在人为地制造在心理上和社会地位上都不健全的人，严重违反了人类伦理道德。5生物技术的安全性和伦理问题(2)我国禁止生殖性克隆人。

②我国政府一再重申四不原则：不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验。③我国政府主张对治疗性克隆进行有效监控和严格审查。2.关注生殖性克隆人①中国政府积极支持制定《禁止生殖性克隆人国际公约》，坚决反对克隆人，不允许进行任何生殖性克隆人实验。5生物技术的安全性和伦理问题(3)治疗性克隆。2.关注生殖性克隆人5生物技术的安全性和伦理问题(4)治疗性克隆和生殖性克隆的比较。2.关注生殖性克隆人5生物技术的安全性和伦理问题3.试管婴儿与设计试管婴儿的异同点(1)不同点①所用技术手段：设计试管婴儿在胚胎移植前需进行遗传学诊断(如诊断血型、诊断性别、诊断HLA的类型等)，试管婴儿不需进行遗传学诊断。如下图，设计试管婴儿比试管婴儿多了

d过程：②应用：试管婴儿主要是解决不孕夫妇的生育问题，设计试管婴儿用于白血病、致命贫血症等疾病的治疗。(2)相同点：都是体外受精，并进行体外早期胚胎培养，都要经过胚胎移植，都是有性生殖。 ①致病菌类：炭疽杆菌、霍乱弧菌等。 ②病毒类：天花病毒、某些动物的痘病毒、通过基因工程改造的流感病毒等。 ③__________类：肉毒杆菌毒素等。 (2)特点：______________________________。 (3)散布途径：可以直接或者通过食物、生活必需品和带菌昆虫等散布，经由呼吸道、消化道和皮肤等侵入人、畜体内，造成大规模伤亡，也能大量损害植物。5生物技术的安全性和伦理问题4.生物武器(1)种类。生化毒剂致病能力强，攻击范围广（2023·浙江·统考高考真题）以哺乳动物为研究对象的生物技术已获得了长足的进步。对生物技术应用于人类，在安全与伦理方面有不同的观点，下列叙述正确的是（

）A．试管婴儿技术应全面禁止B．治疗性克隆不需要监控和审查C．生殖性克隆不存在伦理道德方面的风险D．我国不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验【答案】D核心考点1重组DNA技术的基本工具基因工程：基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。有关核酸的方向性问题：① 核苷酸：② 一条脱氧核苷酸链（DNA单链）:123451’碳连碱基2’碳（脱氧核糖连无氧；核糖有氧）3’碳连羟基（-OH）5’碳连磷酸⑥ tRNA的3’端结合氨基酸⑦ 翻译时核糖体的移动方向：沿着mRNA的5’-3’方向移动⑧ 限制性内切核酸酶识别的序列：沿5’-3’方向读取一端的3’碳上有游离的羟基（-OH），叫3’端；另一端的5’碳上有游离的磷酸基团，叫5’端。一条核糖核苷酸链（RNA链）也是如此。③ DNA是由两条脱氧核苷酸链，按反向平行的方式构成④ DNA聚合酶：总是从引物的3’端连接脱氧核苷酸（沿着模板链的3’-5’方向合成子链）⑤ RNA聚合酶：总是从引物的3’端连接核糖核苷酸（沿着模板链的3’-5’方向合成子链）重组DNA技术的基本工具限制性内切核酸酶——“分子手术刀”DNA连接酶——“分子缝合针”基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”限制性内切核酸酶——“分子手术刀”：1、来源：2、对原核生物的作用：3、作用：作用：识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。结果：切割DNA成为两个DNA片段识别的序列：①沿5’-3’方向读取②大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，少数4个、8个。③多数为回文序列

（因此，切割形成的黏性末端碱基序列：既相同，又互补）黏性末端：主要是原核生物防止外来病原物的侵害,将外源DNA切割保证自身安全当限制酶在它识别序列的中心轴线(图中虚线）两侧将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是黏性末端；黏性末端特点：既相同，又互补当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的是平末端。平末端：E.coliDNA连接酶：T4DNA连接酶：①从大肠杆菌中分离得到②只能连接黏性末端，不能连接平末端③恢复磷酸二酯键①从T4噬菌体中分离出来②既能连接黏性末端，又能连接平末端，但连接平末端的效率相对较低③恢复磷酸二酯键DNA连接酶——“分子缝合针”基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”最常用的载体：质粒质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。质粒适合做载体的特点（载体必需具备的特点）：① 有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段（基因）插入其中；② 能在受体细胞中进行自我复制，或可整合到受体细胞DNA上，随受体DNA同步复制；③ 这些质粒上常有特殊的标记基因，四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等，便于重组DNA分子的筛选；④ 对受体细胞无害。（真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。）在基因工程中使用的载体除质粒外，还有噬菌体，动植物病毒等。DNA的粗提取与鉴定一、原理1、DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精2、DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2mol/L的NaCl溶液NaCl浓度0.14mol/LDNA的溶解度O3、在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色二、过程洋葱（30g）+研磨液（10mL）研磨取上清液方法一：方法二：在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。直接将研磨液倒入塑料离心管中，在1500r/min的转速下离心5min，再取上清液放入烧杯中。析出DNA在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%)，静置2~3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA取出DNA方法一：方法二：用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分将溶液倒入塑料离心管中，在10000r/min的转速下离心5min，取沉淀物（弃上清液）溶解DNA2mol/L的NaCl溶液鉴定DNA实验组：对照组：2mol/L的NaCl溶液+DNA+二苯胺试剂4mL→沸水浴5min2mol/L的NaCl溶液+二苯胺试剂4mL→沸水浴5min核心考点2基因工程的基本操作程序转基因抗虫棉的主要四个步骤：目的基因的筛选与获取筛选合适的目的基因：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一科学家不仅掌握了Bt基因的序列信息，也对Bt基因的表达产物——Bt抗虫蛋白有了较为深入的了解利用PCR获取和扩增目的基因：人工合成；利用PCR技术扩增；通过构建基因文库获取获取目的基因的方法：基因表达载体的构建构建目的：让目的基因在受体细胞中：①稳定存在；②遗传给下一代；③表达和发挥作用构建过程：① 首先用一定的限制酶切割载体，使它出现一个切口；② 然后用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段；③ 再利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处，这样就形成了一个重组DNA分子基因表达载体的组成：Clicktoaddtext启动子：终止子相当于一盏红色信号灯，使转录在所需要的地方停下来，它位于基因的下游，也是一段有特殊序列结构的DNA片段。启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，紧挨转录的起始位点，它是RNA聚合酶识别和结合的部位。诱导型启动子：当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达。终止子：目的基因：（如，Bt抗虫蛋白基因）位于启动子和终止子之间。标记基因：（如，抗生素抗性基因）将含有目的基因的细胞筛选出来将目的基因导入受体细胞导入植物细胞：①花粉管通道法：可以用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注人子房中；可以在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊②农杆菌转化法：导入动物细胞：一般先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中。显微注射法利用显微注射将目的基因注入动物的受精卵中(图3-8)，这个受精卵将发育成为具有新性状的动物导入原核细胞：目的基因的检测与鉴定首先是分子水平的检测，包括：其次，还需要进行个体生物学水平的鉴定：① 通过PCR等技术检测棉花的染色体DNA上是否插入了Bt基因② 检测Bt基因是否转录出了mRNA；③ 从转基因棉花中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原一抗体杂交，检测Bt基因是否翻译成Bt抗虫蛋白等。例如，通过采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫来确定Bt基因是否赋予了棉花抗虫特性以及抗性的程度。相关的基本概念：用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因就是目的基因。它主要是指编码蛋白质的基因，如与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。（也可以是一些具有调控作用的因子）目的基因：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一获取目的基因的有效方法：PCR技术扩增目的基因的方法：引物：定义：①长度通常为20～30个核苷酸②PCR需要2种引物③有方向性④G-C碱基对越多，复性温度越高，pcr反应越快。引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。（复制一段DNA需要两种引物）特点：使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸作用：定义：Bt抗虫蛋白基因（简称Bt基因）苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴孢晶体蛋白(Bt抗虫蛋白)，破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体。因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响。Clicktoaddtext农杆菌转化法① 可以将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，并再生成植株；② 可以将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等。1、转化：是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。农杆菌细胞内含有Ti质粒