CSTM-植物油 苯并（a）芘测定 超临界流体色谱在线净化-反相高效液相色谱法编制说明

《植物油苯并（a）芘测定超临界流体色谱在线净化-反相高效液相色谱法》标准编制说明书1工作简况1.1任务来源根据CSTM标准委员会2021年7月30日材试标字[2021]180号文件关于CSTM标准签发的立项通告，批准CSTM标准《植物油中苯并(a)芘快速自动化测定法-超临界流体色谱在线净化法》立项，立项编号为：CSTMLX990000754-2021，英文版立项编号为：CSTMLX990000754-2021E，标准项目由CSTM/FC99综合标准领域委员会归口管理，由岛津企业管理（中国）有限公司负责牵头起草。1.2主编单位协作单位标准计划中的负责起草单位为岛津企业管理（中国）有限公司，由岛津企业管理（中国）有限公司具体承担标准起草工作。主编单位：岛津企业管理（中国）有限公司、国家粮食和物资储备局科学研究院、钢研纳克检测技术股份有限公司、中粮集团。1.3主要工作过程2021年6月8日由岛津企业管理（中国）有限公司组织粮食和物资储备局科学研究院、钢研纳克检测技术股份有限公司等单位成员成立了标准编写工作组暨第一次工作组会议，开始进行标准草稿的编写工作，确定了标准制定方案和时间安排，并进行了工作划分，岛津企业管理（中国）有限公司、国家粮食和物资储备局科学研究院主要负责国内外苯并(a)芘测试方法及相关标准制修订情况的调研工作，完成植物油中苯并(a)芘快速自动化测定法-超临界流体色谱在线净化法标准草案起草工作，钢研纳克检测技术股份有限公司负责制定试验方案、准备试验样品。2021年7月13日标准编写工作组在钢研纳克检测技术股份有限公司召开了第二次工作组会议，首先对标准文本草案进行了讨论和修改，初步确立了标准草案，然后根据标准草案对试验方案进行了讨论和完善，决定开始进行试验验证工作。2021年7月13日-2021年11月1日由岛津企业管理（中国）有限公司、国家粮食和物资储备局科学研究院、钢研纳克检测技术股份有限公司等单位进行了试验验证工作。工作组对实验数据进了汇总统计，初步确定了标准的各项技术参数。2021年11月初标准编写工作组再次对标准文本进行了修改，并开始编写标准编制说明和试验验证报告。…………1.4本标准主要起草人：…………2.标准化对象简要情况及标准制修订原则2.1标准化对象简要情况3，4-苯并芘（即苯并(a)芘）被世界卫生组织列为一类致癌物，与人体DNA共价结合后可引起复制错误从而极易引发癌变。一般认为在油脂的高温工艺过程中由多环芳烃通过组合、重排产生。此外，在储存、运输或包装的过程中也易受外源污染。我国GB2762-2017中针对部分谷物及其制品、熏烧烤肉类、熏（烤）水产品、油脂及其制品中污染物质苯并[a]芘的限量进行了规定，其中针对油脂及其制品为10ug/kg，欧盟、韩国、西班牙等规定油脂中苯并(a)芘含量不得超2ug/kg，国际食品法典委员会（CAC）也规定了食用油中苯并[a]芘最高限量为5ug/kg。因此准确测试食品中苯并(a)芘的含量，对食品安全的管控显得尤为重要。2.2标准制定的必要性分析目前食用油中苯并（a）芘检测手段主要有气相色谱-质谱法、高效液相色谱-荧光法和酶联免疫吸附法。当采用色谱法进行分析时，上机之前，需要对食用油样品中苯并（a）芘进行提取，对样品进行净化。前处理手段主要包括液液萃取、索氏提取和固相萃取等方法。其中，固相萃取结合液相色谱荧光检测法对干扰基质净化能力好，检测灵敏度高，作为国际标准方法ISO15302-2017和国标方法GB5009.27-2016被广泛使用。但是现有标准中的固相萃取的前处理手段，操作步骤仍然繁琐费时，对实验人员技术水平要求较高，无法满足快速准确检测的需求。而且仍然需要使用大量有毒有害化学试剂，不仅成本高，而且不环保。本项目通过采用先进环保的超临界流体色谱分离技术，实现了植物油样品的在线净化和苯并（a）芘的快速自动化检测，而且降低了样品前处理过程中有机溶剂的使用成本，为植物油当中苯并（a）芘的快速监测和植物油的质量管理提供了有力的工具。此外，该方法准确可靠，具有普遍适用性，易于推广使用。2.3标准制修订的原则标准的编写格式按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则》、GB/T20001.4标准编写规则第4部分：试验方法标准的统一规定和要求进行编写。本标准采使用超临界流体色谱（SFC）-反相液相色谱（RPLC）二维系统对苯并（a）芘样品溶液进行在线超临界流体色谱分离净化后，用中心切割的方式将苯并（a）芘导入到第二维的反相高效液相色谱系统进行分离，荧光检测器检测，外标法定量。3.采用国际标准和国外先进标准的情况，我国标准同被采用标准、和/或与国际、国外同类标准的主要差异及其原因，或与测试的国外样品的有关数据对比情况现有的国际标准为ISO15302：2017动植物油脂苯并（a）芘的测定反相高效液相色谱法（Animalandvegetablefatsandoils-Determinationofbenzo[a]pyrene-Revers-phasehighperformanceliquidchromatographymethod)。国家标准GB/T22509-2008《动植物油脂苯并（a）芘的测定反相高效液相色谱法》修改采用了ISO15302。强制性国家标准GB5009.27-2016《食品安全国家标准食品中苯并（a）芘的测定》替代了GB/T22509-2008。本标准在制定过程中参考了GB5009.27-2016《食品安全国家标准食品中苯并（a）芘的测定》中试剂材料、色谱分析条件，ISO15302动植物油脂苯并（a）芘的测定反相高效液相色谱法（Animalandvegetablefatsandoils-Determinationofbenzo[a]pyrene-Revers-phasehighperformanceliquidchromatographymethod)中色谱条件、及精密度参数的规定。本标准与ISO15302：2017、GB5009.27-2016比对情况见表1.标准相比本标准采用了先进环保的超临界流体色谱分离技术，取代了采用氧化铝住或中性分子印迹柱对植物油中苯并（a）芘进行分离提取的前处理过程，有效减少了有机溶剂的使用，降低了标准方法对操作人员的技术要求，提高了方法标准的可操作性，给出了详细的精密度数据，能够有效保证检测结果的准确度、可靠性和可重复性。表1标准对比情况汇总表序号项目本标准GB5009.27-2016ISO15302：20171整体结构分为10章范围、规范性引用文件、术语和定义、原理、试剂和材料、仪器和设备、试验步骤、试验数据处理、精密度、质量控制、其他、附录A（资料性）、附录B（资料性）。分为8章范围、原理、试剂和材料、仪器和设备、分析步骤、分析结果的表述、精密度、其他、附录A。分为12章范围、规范性引用文件、术语和定义、原理、试剂、设备、试样、试样处理、试验步骤、试验结果表述、精密度、试验报告。2范围适用于测定植物油中的苯并(a)芘；测量范围：0.5μg/kg-50μg/kg。适用于谷物及其制品（稻谷、糙米、大米、小麦、小麦粉、玉米、玉米面、玉米渣、玉米片）肉及肉制品（熏、烧、烤肉类）、水产动物及其制品（熏、烤水产品）、油脂及其制品中苯并(a)芘的测定；未明确给出测量范围。适用于采用荧光检测器的反相高效液相色谱检测食用油脂中的苯并(a)芘。不适用于牛奶或牛奶制品的脂肪中苯并(a)芘的测定适用范围：0.1μg/kg-50μg/kg。3术语和定义给出了“超临界流体”、“超临界流体色谱法”的术语定义无无4原理使用超临界流体色谱（SFC）-反相液相色谱（RPLC）二维色谱系统在线分离净化样品，荧光检测器检测，外标法定量。用有机溶剂提取待测成分，中性氧化铝或分子印迹柱净化，然后用反相液相色谱法分离，荧光检测器检测，外标法定量。用石油醚溶解样品，并加入内标物，用过氧化铝柱净化待测成分，然后用反相液相高效色谱分离，荧光检测器检测，内标法定量。5试剂和材料净化柱无中性氧化铝或分子印迹柱净化过氧化铝柱内标物无无Benzo[b]chrysene6试验设备超临界流体色谱—反相液相色谱联用系统，配有荧光检测器液相色谱仪，配有荧光检测器液相色谱仪，配有荧光检测器7试验步骤试液制备称取1g样品，用正己烷溶解，定容至10mL，涡旋振荡，待测。称取0.4g试样，加入5mL正己烷溶解，涡旋振荡，待净化。称取0.4g试样，加入2mL石油醚溶解，注入20μl内标物，待净化。净化超临界流体色谱在线净化用中性氧化铝或分子印迹柱净化，洗脱剂为正己烷，氮气流下浓缩至干，乙腈试剂复溶，待测。过氧化铝柱净化洗脱剂为石油醚，氮气流下浓缩至干，用乙腈四氢呋喃混合溶液复溶，待测。标准曲线6个点无基体匹配，标准溶液经过前处理过程5个点无基体匹配，标准溶液不经过前处理过程5个点无基体匹配，标准溶液有内标，不经过前处理过程。8实验数据处理结果保留到小数点后一位。当含量为0μg/kg-10μg/kg时，结果保留到小数点后一位；当含量大于10μg/kg时，结果保留到整数。9精密度重复性给出了详细的重复性数据在重复性条件下获得的两次独立测试结果的绝对值不得超过算术平均值的20%。给出了低（2.12μg/kg）、中（38.02μg/kg）、高（58.30μg/kg）三个浓度点的重复性限r分别为0.34μg/kg、2.12μg/kg、5.72μg/kg。再现性给出了详细的再现性数据未给出给出了低（2.12μg/kg）、中（38.02μg/kg）、高（58.30μg/kg）三个浓度点的重复性限分别为1.54μg/kg、17.44μg/kg、23.4μg/kg。10质量控制采用质控样进行质量控制未给出未给出11检出限0.2μg/kg0.2μg/kg未给出12定量限0.5μg/kg0.5μg/kg未给出13试验报告给出了具体要求未给出详细规定给出了具体要求4.标准主要内容4.1标准名称本标准立项名称为植物油中苯并(a)芘快速自动化测定法-超临界流体色谱在线净化法》，在编制过程中标准编写工作组决定采用符合GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则》要求的三段式写法，将标准名称变更为《植物油苯并（a）芘测定超临界流体色谱在线净化-反相高效液相色谱法》（Vegetableoils—Determinationofbenzo(a)pyrene—ReversephaseHighperformanceliquidchromatographymethodwithon-linesupercriticalfluidchromatographycleanup）。4.2适用范围1）本标准在制定过程中，采用该标准方法对市场上流通的20多种主要植物油进行了测试，并对数据进行了汇总处理分析，验证了本标准适用于植物油中苯并（a）芘的测定。2）经过前期试验验证采用超临界流体色谱在线净化-反相高效液相色谱法测定植物油中苯并(a)芘含量具有较宽的线性范围。通过加标回收试验证明了本方法在0.5μg/kg~50μg/kg测试范围内具有良好的准确度和可靠性，详见验证报告。4.3原理使用高压切换六通阀将超临界流体色谱（SFC）与液相色谱（LC）联用，配合荧光检测器，进行植物油样品的在线净化和其中苯并（a）芘的检测定量。样品分析主要分以下三步完成。（1）当六通阀处于图1（a）所示位置时，Diol柱通过六通阀直接和背压控制器BPR连接，正己烷稀释后的植物油样品通过自动进样器注入，在超临界二氧化碳流体和夹带剂甲醇的共同作用下，弱极性的苯并（a）芘被保留在Diol柱上，非极性的脂质被优先洗脱下来，通过BPR流入废液。(a)(b)(c)图1SFC-LC植物油中苯并（a）芘检测原理示意图（2）在苯并（a）芘即将从Diol柱中溶出时，六通阀的位置切换至图1（b）所示位置。此时，Diol柱通过六通阀与C18预处理小柱串联后，进一步和BPR进行连接。使用甲醇将苯并（a）芘从Diol柱中洗脱下来，进入到C18预处理小柱中并被保留。在这个过程中，系统中的超临界二氧化碳流体被优先洗脱到废液当中。（3）在苯并（a）芘即将从C18预处理小柱中溶出时，六通阀切换至图1（c）所示位置。此时，C18预处理小柱和C18分析柱串联，在第二维的分析流动相的作用下，苯并（a）芘从预处理小柱进入到分析柱中，与杂质进行分离后，使用荧光检测器检测。4.4仪器设备图2超临界流体色谱在线净化-反相高效液相色谱联用装置图检测仪器采用超临界流体色谱-反相液相色谱二维色谱系统，并配有荧光检测器。使用高压六通阀，可以将市售的超临界流体色谱仪和液相色谱仪按照图2所示连接成二维色谱系统，用于该标准方法。4.5仪器参考条件（此处关于色谱条件的选择和确定应详细描述，例如：流动相配比、切换时间、流动相流速是如何确定的？）本项目在开发阶段，针对色谱分离条件，检测条件等进行了考察和优化。首先，针对超临界流体背压调节器（BPR）的参数设定，本实验采用了厂家的推荐条件。荧光检测器的激发波长和发射波长，参考了GB5009.27的检测条件。对色谱柱的类型和规格，流动相的条件，阀切换的时间等分析条件通过实验进行了考察和优化。该标准同时使用3支色谱柱，分别进行植物油的超临界流体色谱在线净化，系统中CO2超临界流体的去除，以及苯并（a）芘的分离和检出。其中，在选取SFC净化柱时，在Diol柱，Silica柱和NH2柱三种不同填料中进行选择，发现Diol柱保留更强，由此推断其净化能力更好，最终选择Diol填料柱作为SFC净化柱。另外，C18预处理小柱选用了柱长为5cm的且对苯并（a）芘保留能力强的C18填料柱。最终的分析柱同样选用了碳含量高，对多环芳烃保留强的C18分析柱进行分离。并且为了提高检测灵敏度，选用了内径为2.1mm的色谱柱。流动相分别为样品净化流动相和分析流动相。第一步中，样品净化流动相为3mL/min的总流速，其中98%为超临界CO2流体，2%为甲醇。此条件下，苯并（a）芘在Diol柱上可以实现足够的保留（>10min）使得植物油样品在SFC净化柱上能够得到充分的净化。此时，系统压力为23-24MPa，压力适中，降低了对系统耐压性能的要求。第二维的分离流动相条件参考国标条件，定为乙腈：水=90：10的混合溶液，可以快速检出，流速设为1mL/min，此时第二维系统压力为14MPa，压力适中。分别对第一步到第二步（图1（a）→（b））和第二步到第三步（图1（b）→（c））的切换时间进行了优化。首先在第一步中，在苯并（a）芘溶出Diol柱前，分别在9min、9.5min和10min进行阀的切换，随后，考虑到Diol柱和预处理C18小柱的死体积，将第二步到第三步的切换时间分别设定为13min、13.5min和14min。分别在三个条件下进行考察，均能得到苯并（a）芘的检出。最终选择中间条件2作为分析阀切换时间。表1SFC-LC阀切换时间条件1条件2条件3切换时间1第一步→第二步9min9.5min10min切换时间2第二步→第三步13min13.5min14min4.6校准曲线标准储备液溶剂、浓度、保存时间以及配制方法均采用了GB5009.27-2016的方法。标准曲线工作液用异丙醇进行稀释，浓度采用0.05ng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/ml、1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL六个系列浓度。0.2ng/mL和1.0ng/mL分别对应欧盟和国标的限量值。曲线浓度最低点是方法的定量限，曲线浓度最高点是卫生限量的5倍，最高浓度点是最低点的100倍，可以覆盖大部分样品的含量范围，与GB5009.27-2016给出的适用范围一致。本方法通过超临界流体色谱在线净化得到了去除基质干扰的待测成分，因此采用外标法进行定量。在进行分析时，标准溶液与试验样品均经过了超临界流体色谱在线净化和反相色谱分离的步骤，并且加标回收试验的结果证明采用外标法可准确定量（见验证报告）。4.7检出限、定量限依据美国EPA标准方法确定方法的检出限，详见验证报告，采用行业公认的3倍检出限作为方法的定量限。4.8精密度由于该标准方法的测量设备为创新装置，暂未在各实验室普及使用，不能找到8家实验室组织共同试验，标准编制工作组依据HJ168《环境监测分析方法标准制订技术导则》制定了共同试验技术方案，组织岛津企业管理（中国）有限公司组织粮食和国家粮食和物资储备局科学研究院按不同人员分组，采用不同仪器设备、环境条件和不同批次试剂材料开展共同试验，最终将试验数据进行统计分析得出精密度数据，并将该数据与ISO15302动植物脂肪和油中苯并（a）芘的测定反相高效液相色谱法（Animalandvegetablefatsandoils-Determinationofbenzo[a]pyrene-Revers-phasehighperformanceliquidchromatographymethod)进行比对，通过系数校正得出本方法标准最终的精密度数据。主要试验（或验证）结果的分析、综述报告等。详见验证报告。6.与有关的现行的方针、政策、法律、法规和强制性标准的关系（1）本标准符合现行方针、政策、法律、法规的规定。（2）现行强制性国家标准为GB5009.27-2016《食品安全国家标准食品中苯并(a)芘的测定》，规定了适用于谷物及其制品（稻谷、糙米、大米、小麦、小麦粉、玉米、玉米面、玉米渣、玉米片）肉及肉制品（熏、烧、烤肉类）、水产动物及其制品（熏、烤水产品）、油脂及其制品中苯并(a)芘的测定方法，该标准采用中性氧化铝柱或分子印迹柱分离提取试验样品中的待测成分，简单的给出了精密度数据，规定在重复性条件下获得的两次测试结果的绝对值不得超过算术平均值的20%。本标准主要针对植物油中苯并（a）芘的测试，采用超临界流体在线净化技术分离提取样品中的待测成分，给出了详细的精密度数据和质量控制手段，主要标准性能参数严于、高于GB5009.27-2016《食品安全国家标准食品中苯并(a)芘的测定》，符合团体标准制定原则。7.对征求意